Una semplice tecnica per analizzare l'attività locomotoria nella Drosophila

Riepilogo

Il presente protocollo valuta l'attività locomotoria di Drosophila tracciando e analizzando il movimento delle mosche in un'arena fatta a mano utilizzando il software open source Fiji, compatibile con plugin per segmentare i pixel di ogni fotogramma in base alla registrazione video ad alta definizione per calcolare i parametri di velocità, distanza, ecc.

Abstract

Drosophila melanogaster è un organismo modello ideale per lo studio di varie malattie grazie alla sua abbondanza di tecniche avanzate di manipolazione genetica e diverse caratteristiche comportamentali. Identificare la carenza comportamentale nei modelli animali è una misura cruciale della gravità della malattia, ad esempio, nelle malattie neurodegenerative in cui i pazienti spesso presentano menomazioni nella funzione motoria. Tuttavia, con la disponibilità di vari sistemi per tracciare e valutare i deficit motori nei modelli di mosca, come gli individui trattati con farmaci o transgenici, manca ancora un sistema economico e facile da usare per una valutazione precisa da più angolazioni. Qui viene sviluppato un metodo basato sull'interfaccia di programmazione dell'applicazione (API) AnimalTracker , compatibile con il programma di elaborazione delle immagini delle Fiji, per valutare sistematicamente le attività di movimento di individui adulti e larvali dai video registrati, consentendo così l'analisi del loro comportamento di tracciamento. Questo metodo richiede solo una telecamera ad alta definizione e un'integrazione hardware periferica per registrare e analizzare il comportamento, rendendolo un approccio economico ed efficace per lo screening di modelli di mosche con carenze comportamentali transgeniche o ambientali. Vengono forniti esempi di test comportamentali che utilizzano moscerini trattati farmacologicamente per mostrare come le tecniche possono rilevare cambiamenti comportamentali sia nelle mosche adulte che nelle larve in modo altamente ripetibile.

Introduzione

Drosophila melanogaster fornisce un eccellente organismo modello per studiare le funzioni cellulari e molecolari in modelli di malattia neuronale creati da modificazione genica¹, trattamento farmacologico² e senescenza³. L'elevata conservazione dei percorsi biologici, delle proprietà fisiche e dei geni omologhi associati alla malattia tra gli esseri umani e la Drosophila rende il moscerino della frutta un imitatore ideale dal livello molecolare a quello comportamentale⁴. In molti modelli di malattia, la carenza comportamentale è un indice importante, fornendo un modello utile per varie neuropatie umane ^5,6. La Drosophila è ora utilizzata per studiare molteplici malattie umane, neurosviluppo e malattie neurodegenerative come il morbo di Parkinson e la sclerosi laterale amiotrofica ^7,8. Rilevare la capacità motoria dei modelli di malattia è fondamentale per comprendere il progresso patogenetico e può fornire una correlazione fenotipica ai meccanismi molecolari alla base del processo patologico.

Recentemente, sono stati sviluppati strumenti software disponibili in commercio e programmi convenienti per le strategie di rilevamento locomotorio della Drosophila, come il test ad alta produttività in mosche raggruppate^9,10 e la misurazione della locomozione in tempo reale^11,12. Uno di questi approcci convenzionali è la geotassi negativa interattiva rapida (RING), chiamata anche saggio di arrampicata, che include più canali che consentono di contenere una grande popolazione di mosche con lo stesso sesso ed età, riducendo la variazione durante la raccolta dei dati ^9,13. Un altro metodo di pre-test per analizzare il comportamento locomotore è TriKinetics Drosophila activity monitor (DAM), un dispositivo che utilizza più fasci per rilevare il movimento dell'attività della mosca all'interno di un sottile tubo di vetro¹⁴. Il dispositivo registra continuamente la posizione, che rappresenta la locomozione automatizzata calcolando gli attraversamenti del fascio per studiare l'attività e il ritmo circadiano delle mosche per un periodo di tempo più lungo¹⁵. Sebbene questi metodi siano stati ampiamente utilizzati nell'analisi dei difetti comportamentali nei moscerini della frutta per determinare i cambiamenti nella locomozione comportamentale, richiedono sempre attrezzature di prova speciali o processi di analisi complessi e limitano la loro applicazione in alcuni modelli con un dispositivo limitato e semplice. Le strategie basate sul gruppo di tracciamento degli animali per testare la Drosofila adulta, come FlyGrAM¹¹ e il test dell'isola di Drosophila ¹⁰, implementano il reclutamento sociale e il monitoraggio individuale in un'area predefinita. Tuttavia, la restrizione sociale individuale nelle aree sfidate potrebbe avere un effetto negativo sulle identificazioni nelle immagini, causate dalla collisione o dalla sovrapposizione delle mosche. Anche se alcuni metodi basati su materiali open source, come TRex¹⁶, MARGO 12 e FlyPi¹⁷, hanno un'emergenza, possono tracciare rapidamente le mosche con un utilizzo flessibile nei test comportamentali. Questi approcci di test sono associati a elaborate installazioni di apparecchiature sperimentali, requisiti software speciali o linguaggi informatici professionali. Per le larve, misurare la distanza totale percorsa attraverso il numero di linee di confine della griglia per unità di tempo¹⁸, o contare approssimativamente le contrazioni della parete corporea per gli individui^{manualmente 19}, sono i metodi predominanti per valutare la loro capacità locomotoria. A causa della mancanza di precisione nelle attrezzature o nei dispositivi e nei metodi di analisi, alcune locomozioni comportamentali delle larve potrebbero sfuggire al rilevamento, rendendo difficile valutare con precisione il movimento comportamentale, in particolare il movimento fine¹⁵.

Il presente metodo sviluppato utilizza l'interfaccia di programmazione dell'applicazione AnimalTracker (API), compatibile con il programma di elaborazione delle immagini Fiji (ImageJ), per valutare sistematicamente l'attività locomotoria di mosche adulte e larvali analizzando il loro comportamento di tracciamento da video ad alta definizione (HD). Fiji è una distribuzione software open source ImageJ in grado di combinare robuste librerie software con numerosi linguaggi di scripting, con conseguente prototipazione rapida di algoritmi di elaborazione delle immagini, rendendolo popolare tra i biologi per le sue capacità di analisi delle immagini²⁰. Nell'approccio attuale, l'integrazione delle Fiji nell'API AnimalTracker viene sfruttata per sviluppare un test comportamentale unico di Drosophila con inserimento personalizzato dell'algoritmo e fornisce un passaggio utile per una documentazione dettagliata e tutorial per supportare solide capacità analitiche del comportamento locomotore (Figura 1). Per aggirare la complicazione delle identificazioni oggettive nelle immagini causate dalla collisione o dalla sovrapposizione di mosche, ogni arena è limitata ad ospitare una sola mosca. Dopo aver valutato la precisione di tracciamento dell'approccio, è stato implementato per tracciare e quantificare i movimenti locomotori di Drosophila che sono stati somministrati con il farmaco tossico rotenone, che viene generalmente utilizzato per modelli animali della malattia di Parkinson, scoprendo infine la compromissione della locomozione nel trattamento farmacologico²¹. Questa metodologia, che impiega software open source e libero, non richiede strumentazione ad alto costo e può analizzare in modo preciso e riproducibile la locomozione comportamentale della Drosophila .

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Protocollo

Per il presente studio sono state utilizzate W¹¹¹⁸ mosche adulte e larve di terzo stadio.

1. Preparazione sperimentale

NOTA: Un'arena in campo aperto per il monitoraggio della locomozione della Drosophila è realizzata conun gel di silice incolore e inodore.

1. Miscelare il reagente A e il reagente B in un rapporto di 1:10, secondo le istruzioni del produttore per il kit di silice (vedere la tabella dei materiali). Assicurarsi che il bicarbonato di sodio venga aggiunto alla miscela mescolando fino a quando il colore diventa bianco. Trasferire il composto in una piastra di Petri pulita e metterlo in forno a 40 °C per l'essiccazione per 48 ore.
2. Posizionare la videocamera HD (vedere Tabella dei materiali) su un treppiede, regolandolo in modo che l'obiettivo della fotocamera sia perpendicolare alla superficie dell'arena di silice. Regolando la lunghezza focale e le aperture della fotocamera, assicurarsi che la fotocamera sia focalizzata sulla superficie della silice e che il display sia adeguatamente illuminato. La configurazione sperimentale è illustrata nella Figura 1.
3. Trasferisci una mosca nell'arena in campo aperto per registrare un video continuo di almeno 61 s.
   NOTA: Considerando la natura lenta delle larve, si consiglia un tempo di registrazione video di oltre 10 minuti.
   1. Apri il video con Fiji, trascina la barra di avanzamento sul fotogramma iniziale e approva tacitamente. Scegli l'intero corpo della mosca usando lo strumento "selezione a mano libera" (Figura 2B, C).
   2. Fare clic sull'immagine > regolare > luminosità e contrasto per regolare il bilanciamento del bianco fino a quando il valore di grigio dell'area selezionata si avvicina allo sfondo generale (Figura 2D-F).
      NOTA: L'omogeneizzazione dello sfondo del primo fotogramma consente al software di distinguere lo sfondo senza oggetti e creare un contrasto quando è presente una mosca, consentendo così al software di seguirlo.
4. Eseguire l'intero esperimento in un ambiente di prova impostato a 25 °C e 60% di umidità relativa, in un'area silenziosa e priva di esposizione alla luce intensa.

2. Registrazione video e pre-elaborazione

1. Dopo un breve periodo di anestesia utilizzando il 95% di anidride carbonica (CO₂), trasferire una mosca nell'arena aperta e premere il pulsante di registrazione sull'applicazione della fotocamera per avviare la registrazione video.
   NOTA: Per ridurre al minimo l'effetto dell'anestetico sulla locomozione, consentire alle mosche di recuperare per 10 minuti prima di iniziare la registrazione video. Si raccomanda anche l'anestetizzazione a freddo mediante raffreddamento.
   1. Una volta che le mosche si sono riprese dall'anestesia, metti il piatto dell'arena contenente la mosca sotto la fotocamera e scuoti rapidamente la piastra da un lato all'altro per assicurarti che la mosca sia in movimento quando inizia la registrazione.
2. Al termine della registrazione, premere il pulsante di arresto per terminare la registrazione video.
   NOTA: assicurarsi che il tempo di registrazione video superi leggermente il tempo di tracciamento della destinazione di un piccolo margine. Inoltre, per migliorare l'efficienza sperimentale, è possibile tracciare più mosche spontaneamente. Questo dipende dalla risoluzione della fotocamera per consentire un ritaglio video di alta qualità.
3. Converti i video registrati in formato AVI con codifica MJPEG, in modo che possano essere aperti e analizzati utilizzando le Fiji. Nel frattempo, imposta la frequenza dei fotogrammi al secondo (fps) del video su 15 fps per le mosche adulte e 12 fps per le larve.

3. Analisi video

1. Apri il video che è stato trasformato con "usa stack virtuale" e "converti in scala di grigi", due opzioni nella finestra popup quando apri il video con Fiji (Figura 2A).
2. Crea un primo fotogramma vuoto, come menzionato sopra.
3. Ottenere una finestra di elaborazione utilizzando lo strumento "imposta immagine attiva" del plugin AnimalTracker e creare un'area di tracciamento che circonda l'arena nella finestra video originale utilizzando lo strumento "ovale" (Figura 3A).
4. Impostate i filtri (Figura 3A,3) e i parametri dei due filtri (Figura 4A-G) per il primo fotogramma vuoto nella finestra di elaborazione. Quindi, selezionate il fotogramma successivo nella finestra video originale e scegliete la superficie filtrata della finestra di elaborazione (Figura 5A-C).
   NOTA: La fase di filtraggio serve a diminuire il rumore dell'immagine e/o rimuovere lo sfondo, rendendo così più semplice separare il primo piano dallo sfondo nella binarizzazione dei fotogrammi.
5. Una volta selezionata una finestra di elaborazione filtrata, ruotare la mosca tracciata con un profilo rosso coperto nella finestra di elaborazione utilizzando lo strumento "imposta soglia" (Figura 3A,4, Figura 5D-E e Figura 6A).
6. Utilizzare il "set blob-detector" per consentire al computer di riconoscere la mosca con un profilo rosso coperto nella finestra di elaborazione (Figura 3A,5 e Figura 6B).
7. Impostare il fotogramma 901 come ultimo fotogramma per la mosca adulta, calcolato in base alla durata della registrazione del video e agli fps (Figura 3A,6, Figura 6C).
   NOTA: Il seguente esperimento con le larve è stato monitorato per 10 minuti, quindi il fotogramma 7200 è impostato come ultimo fotogramma.
8. Utilizzare lo strumento "mostra blob" per presentare un rettangolo di tracciamento nella finestra video originale (Figura 3A,7 e Figura 6D,E). Quindi, avviare il rilevamento ed esportare il file di rilevamento al termine del monitoraggio (Figura 3A,8,9 e Figura 7A,B).

4. Analisi dei file di tracciamento

1. Caricare i file di traccia e zona utilizzando il plug-in Animal tracker > Tracking analyzer (Figura 8A).
2. Selezionare l'indice desiderato utilizzando le impostazioni della zona e modificare le impostazioni dei parametri (Figura 8). Calcolate il tempo dell'intervallo di fotogrammi utilizzando la frequenza fotogrammi.
   NOTA: in questa condizione, la frequenza fotogrammi è 15 fps e l'intervallo di fotogrammi è di circa 0,067 s, che è l'impostazione predefinita (Figura 8D).
3. Produrre i grafici di analisi quantitativa utilizzando il software per fogli di calcolo e GraphPad Prism dopo essere stati analizzati nell'analizzatore di tracciamento (Figura 9).

5. Analisi per fotogramma

1. Eseguire l'analisi della velocità per intervallo di fotogrammi. Analizza il file di traccia senza Fiji se è necessaria una ricerca più dettagliata.
   1. Aprire il file di traccia, copiare tutte le coordinate in Microsoft Office Excel e dividere le celle utilizzando la barra spaziatrice.
      NOTA: Ad esempio, una volta che il file è stato diviso in colonne "C" e "D", la velocità di Drosophila per intervallo di fotogrammi viene calcolata dalla formula SQRT((C5-C4)^ 2+(D5-D4)^2), mostrata nella colonna "E" (Figura 10A). I dati nella colonna "E" indicano il numero di pixel che la mosca ha spostato tra due fotogrammi, senza considerare il primo fotogramma. Selezionare tutti i risultati calcolati e inserire un grafico a linee per visualizzare una velocità di movimento di volo intuitiva per intervallo di fotogrammi, con un picco sul grafico a linee (Figura 10B).
2. Calcola il tempo di immobilità per intervallo di fotogrammi. Dopo che il file è stato diviso in colonne "C" e "D", calcolare lo stato di immobilità di Drosophila per intervallo di fotogrammi utilizzando la formula IF(SQRT((C6-C5)^ 2+(D6-D5)^2) <20, 0, 1), che viene mostrata nella colonna "E". (Figura 10C).
   NOTA: a differenza dell'analisi della velocità, sono stati definiti i risultati del primo fotogramma. Le mosche che si muovevano meno di 20 pixel erano considerate immobili e registrate come "0" nella colonna "E".
   1. Selezionare tutti i risultati calcolati e inserire un istogramma per visualizzare visivamente il tempo di immobilità con il margine dell'intero istogramma (Figura 10D).
3. Assicurarsi che l'angolo di direzione cambi.
   NOTA: l'analisi del cambio di direzione rappresenta la scelta della direzione delle mosche. Una volta che il file è stato suddiviso nelle colonne "C" e "D", l'angolo di cambio di direzione viene calcolato dalla formula ACOS(((SQRT(((C7-C6)^2+(D7-D6)^2))^2+(SQRT(((C6-C5)^2+(D6-D5)^2))^2-(SQRT((C7-C5)^2+(D7-D5)^2))^2)/(2*SQRT((C6-C5)^2+(D6-D5)^2))*( SQRT((C7-C6)^2+(D7-D6)^2)))*180/PI(), che è presentata nella colonna "E" (Figura 10E). I risultati calcolati indicano l'angolo tra tre coordinate.
   1. Selezionare tutti i risultati calcolati e inserire un diagramma a dispersione per illustrare l'angolo di cambio di direzione del movimento delle mosche (Figura 10F).

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Risultati

Nel presente studio, i deficit locomotori nelle mosche adulte e nelle larve di terzo stadio trattate con rotenone sono stati esaminati e confrontati nella loro attività motoria con quella di una mosca di controllo alimentata con il solvente farmaco dimetil solfossido (DMSO). Il trattamento con rotenone in Drosophila ha dimostrato di causare perdita di neuroni dopaminergici nel cervello²² e portare a significativi deficit locomotori²³. Come mostrato in Figura

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Discussione

Abbiamo progettato un metodo, basato sul materiale open source AnimalTracker API compatibile con il programma di elaborazione delle immagini delle Fiji, che può consentire ai ricercatori di valutare sistematicamente l'attività locomotoria monitorando sia le mosche larvali adulte che individuali. AnimalTracke è uno strumento scritto in Java che può essere facilmente integrato in database esistenti o altri strumenti per facilitare l'analisi del comportamento di tracciamento degli animali progettato da...

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Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Animal tracker	Hungarian Brain Research Program	version: 1.7	pfficial website: http://animaltracker.elte.hu/main/downloads
Camera software	Microsoft	version: 2021.105.10.0	built-in windows 10 system
Computer	DELL	Vostro-14-5480	a comupter running win 10 system is available
Drosophila carbon dioxide anesthesia workstation	Wu han Yihong technology	#YHDFPCO2-018	official website: http://www.yhkjwh.com/
Fiji software	Fiji team	version: 1.53v	official website: https://fiji.sc/
Format factory software	Pcfreetime	version: X64 5.4.5	official website: http://www.pcfreetime.com/formatfactory/CN/index.html
Graph pad prism	GraphPad Software	version: 8.0.2	official website: https://www.graphpad-prism.cn
Hight definition camera	TTQ	Jingwang2 (HD1080P F1.6 6-60mm)	official website: http://www.ttq100.com/product_show.php?id=35
Office software	Microsoft	version: office 2019	official website: https://www.microsoftstore.com.cn/software/office
Petri dish	Bkman	110301003	size: 60 mm
Silica gel	DOW	SYLGARD 184 Silicone Elastomer Kit	Mix well according to the instructions
Sodium bicarbonate	Macklin	#144-55-8	Mix well with silica gel