초파리에서 운동 활동을 분석하는 간단한 기술

요약

현재 프로토콜은 속도, 거리 등의 매개변수를 계산하기 위해 고화질 비디오 녹화를 기반으로 각 프레임의 픽셀을 분할하는 플러그인과 호환되는 오픈 소스 소프트웨어 피지를 사용하여 손으로 만든 경기장에서 파리의 움직임을 추적 및 분석하여 초파리 의 운동 활동을 평가합니다.

초록

Drosophila melanogaster 는 풍부한 고급 유전자 조작 기술과 다양한 행동 특징으로 인해 다양한 질병을 연구하는 데 이상적인 모델 유기체입니다. 동물 모델에서 행동 결함을 식별하는 것은 예를 들어 환자가 종종 운동 기능 장애를 경험하는 신경퇴행성 질환에서 질병 중증도의 중요한 척도입니다. 그러나 약물 치료 또는 형질전환 개체와 같은 비행 모델의 운동 결함을 추적하고 평가할 수 있는 다양한 시스템을 사용할 수 있기 때문에 여러 각도에서 정확한 평가를 위한 경제적이고 사용자 친화적인 시스템이 여전히 부족합니다. 피지 이미지 처리 프로그램과 호환되는 AnimalTracker 응용 프로그래밍 인터페이스(API)를 기반으로 하는 방법이 여기에서 개발되어 녹화된 비디오에서 성충과 애벌레 개체의 움직임 활동을 체계적으로 평가하여 추적 행동을 분석할 수 있습니다. 이 방법은 행동을 기록하고 분석하기 위해 고화질 카메라와 컴퓨터 주변 장치 하드웨어 통합만 필요하므로 형질전환 또는 환경적 행동 결함이 있는 파리 모델을 선별하는 데 저렴하고 효과적인 접근 방식입니다. 약리학적으로 처리된 파리를 사용한 행동 테스트의 예는 기술이 성충 파리와 유충 모두의 행동 변화를 매우 반복 가능한 방식으로 감지할 수 있는 방법을 보여주기 위해 제공됩니다.

서문

초파리 멜라노가스터(Drosophila melanogaster)는 유전자 변형⁽gene modification)1, 약물 치료(drug treatment⁾², 노화(sagingence)³에 의해 생성된 뉴런 질환 모델에서 세포 및 분자 기능을 조사하기 위한 우수한 모델 유기체를 제공한다. 인간과 초파리 사이의 생물학적 경로, 물리적 특성 및 질병 관련 상동체 유전자의 높은 보존은 초파리를 분자에서 행동 수준까지 이상적인 모방체로 만듭니다⁴. 많은 질병 모델에서, 행동 결핍은 다양한 인간 신경병증에 대한 유용한 모델을 제공하는 중요한 지표이다 ^5,6. 초파리는 현재 파킨슨병 및 근위축성 측삭 경화증과 같은 여러 인간 질병, 신경 발달 및 신경퇴행성 질환을 연구하는 데 사용됩니다 ^7,8. 질병 모델의 운동 능력을 감지하는 것은 병원성 진행을 이해하는 데 중요하며 질병 과정의 기초가 되는 분자 메커니즘에 대한 표현형 상관관계를 제공할 수 있습니다.

최근에, 상업적으로 이용 가능한 소프트웨어 도구 및 비용 효율적인 프로그램이 초파리 운동 탐지 전략을 위해 개발되었는데, 예를 들어 그룹화된 파리 9,10에서의 고처리량 테스트 및 실시간^운동 측정(^11,12)과 같은 것이다. 이러한 전통적인 접근법 중 하나는 등반 분석이라고도하는 신속한 상호 작용 음성 지오 택시 (RING)로, 동일한 성별과 연령을 가진 많은 파리 개체군을 포함 할 수있는 다중 채널을 포함하여 데이터를 수집하는 동안 변동을 줄입니다 ^9,13. 운동 거동을 분석하기 위한 또 다른 사전 테스트 방법은 TriKinetics 초파리 활동 모니터(DAM)이며, 이 장치는 얇은 유리관⁽¹⁴) 내에서 비행 활동 이동을 검출하기 위해 다중 빔을 사용하는 장치이다. 이 장치는 위치를 지속적으로 기록하는데, 이는 장기간에 걸쳐 파리의 활동과 일주기 리듬을 연구하기 위해 빔 교차를 계산하여 자동화된 이동을 나타냅니다¹⁵. 이러한 방법은 행동 운동의 변화를 결정하기 위해 초파리의 행동 결함을 분석하는 데 널리 사용되었지만 항상 특수 테스트 장비 또는 복잡한 분석 프로세스가 필요하며 제한적이고 간단한 장치로 일부 모델에서는 적용을 제한합니다. FlyGrAM¹¹ 및 Drosophila island assay¹⁰과 같은 성체 초파리를 테스트하기 위한 동물 추적 그룹 기반 전략은 사전 정의된 영역에서 사회적 모집 및 개별 추적을 구현합니다. 그럼에도 불구하고, 반항적인 지역에서의 사회적 개별적 제한은 파리의 충돌 또는 겹침으로 인해 이미지의 식별에 부정적인 영향을 미칠 수 있습니다. TRex¹⁶, MARGO 12 및 FlyPi¹⁷과 같은 일부 오픈 소스 재료 기반 방법은 비상 사태가 발생하더라도 행동 테스트에서 유연한 사용으로 파리를 빠르게 추적할 수 있습니다. 이러한 테스트 접근 방식은 정교한 실험 장치 설치, 특수 소프트웨어 요구 사항 또는 전문 컴퓨터 언어와 관련이 있습니다. 유충의 경우, 단위 시간당 격자 경계선의 수를 가로질러 이동한 총 거리를 측정하거나¹⁸ 개체의 체벽 수축을 수동으로 대략적으로 세는 것¹⁹이 운동 능력을 평가하는 주된 방법이다. 장비나 장치 및 분석 방법의 정밀도가 부족하기 때문에 유충의 일부 행동 운동은 탐지되지 않아 행동 움직임, 특히 미세한 움직임을 정확하게 평가하기 어렵다¹⁵.

현재 개발된 방법은 피지(ImageJ) 영상 처리 프로그램과 호환되는 AnimalTracker 응용 프로그래밍 인터페이스(API)를 활용하여 고화질(HD) 비디오에서 추적 행동을 분석하여 성충 파리와 유충 파리의 운동 활동을 체계적으로 평가합니다. Fiji는 강력한 소프트웨어 라이브러리와 수많은 스크립팅 언어를 결합할 수 있는 오픈 소스 소프트웨어 ImageJ 배포판으로, 이미지 처리 알고리즘의 신속한 프로토타이핑을 가능하게 하여 이미지 분석 기능으로 생물학자들 사이에서 인기가 있습니다⁽²⁰). 현재 접근 방식에서 피지의 AnimalTracker API에 대한 통합은 개인화된 알고리즘 삽입을 통해 고유한 초파리 행동 분석을 개발하는 데 활용되며, 운동 행동의 강력한 분석 기능을 지원하기 위한 자세한 문서 및 자습서를 위한 유용한 단계를 제공합니다(그림 1). 파리의 충돌 또는 겹침으로 인한 이미지에서 객관적인 식별의 복잡성을 피하기 위해 각 경기장은 단 하나의 파리만 호스팅하도록 제한됩니다. 접근법의 추적 정밀도를 평가한 결과, 파킨슨병의 동물 모델에 일반적으로 사용되는 독성 약물 로테논과 함께 투여된 초파리 의 운동 운동을 추적하고 정량화하여 궁극적으로 약물 치료에서 운동 장애를 발견하기 위해 구현되었습니다²¹. 오픈 소스 및 자유 소프트웨어를 사용하는 이 방법론은 고비용의 계측을 필요로 하지 않으며 초파리 행동 운동을 정확하고 재현 가능하게 분석할 수 있습니다.

프로토콜

W¹¹¹⁸ 성충 파리와 세 번째 instar 유충이 본 연구에 사용되었습니다.

1. 실험 준비

참고: Drosophila 운동 추적을 위한 오픈 필드 경기장은 무색 및 무취 실리카겔로 만들어집니다.

1. 실리카 키트에 대한 제조업체의 지침에 따라 시약 A와 시약 B를 1:10의 비율로 혼합합니다( 재료 표 참조). 색상이 흰색으로 바뀔 때까지 교반하여 중탄산나트륨이 혼합물에 첨가되었는지 확인합니다. 혼합물을 깨끗한 페트리 접시에 옮기고 40°C의 오븐에 넣어 48시간 동안 건조시킵니다.
2. HD 카메라( 재료 표 참조)를 삼각대에 놓고 카메라 렌즈가 실리카 경기장 표면에 수직이 되도록 조정합니다. 카메라의 초점 거리와 조리개를 조정하여 카메라가 실리카 표면에 초점을 맞추고 디스플레이의 조명이 적절하게 밝은지 확인하십시오. 실험 설정은 그림 1에 나와 있습니다.
3. 파리를 오픈 필드 경기장으로 옮겨 최소 61초의 연속 비디오를 녹화합니다.
   참고: 유충의 느린 특성을 고려하여 10분 이상의 비디오 녹화 시간을 권장합니다.
   1. Fiji로 비디오를 열고 진행률 표시 줄을 초기 프레임으로 드래그 한 다음 암묵적으로 승인하십시오. "자유형 선택" 도구를 사용하여 파리의 몸 전체를 선택합니다(그림 2B,C).
   2. >이미지를 클릭하고 밝기 및 대비> 조정하여 선택한 영역의 회색 값이 넓은 배경에 가까워질 때까지 화이트 밸런스를 조정합니다(그림 2D-F).
      참고: 첫 번째 프레임의 배경 균질화를 통해 소프트웨어는 물체가 없는 배경을 구별하고 파리가 있을 때 대비를 생성하여 소프트웨어가 이를 추적할 수 있도록 합니다.
4. 25°C 및 60% 상대 습도로 설정된 테스트 환경, 조용하고 밝은 빛에 노출되지 않는 영역에서 전체 실험을 수행합니다.

2. 비디오 녹화 및 전처리

1. 95 % 이산화탄소 (CO₂)를 사용하여 짧은 마취 후 파리를 오픈 경기장으로 옮기고 카메라 응용 프로그램의 녹화 버튼을 눌러 비디오 녹화를 시작합니다.
   알림: 운동에 대한 마취제의 영향을 최소화하려면 비디오 녹화를 시작하기 전에 파리가 10분 동안 회복되도록 하십시오. 냉기에 의한 시원함 마취도 권장됩니다.
   1. 파리가 마취에서 회복되면 파리가 들어있는 경기장 접시를 카메라 아래에 놓고 플레이트를 좌우로 빠르게 흔들어 녹화가 시작될 때 파리가 움직이도록합니다.
2. 녹화가 완료되면 중지 버튼을 눌러 동영상 녹화를 종료합니다.
   참고: 비디오 녹화 시간이 대상 추적 시간을 약간 초과하는지 확인하십시오. 또한 실험 효율성을 높이기 위해 여러 파리를 자발적으로 추적 할 수 있습니다. 이것은 고품질 비디오 자르기를 가능하게 하는 카메라의 해상도에 따라 다릅니다.
3. 녹화된 비디오를 MJPEG 인코딩을 사용하여 AVI 형식으로 변환하여 피지를 사용하여 열고 분석할 수 있습니다. 한편, 비디오의 초당 프레임 속도(fps)를 성충의 경우 15fps, 유충의 경우 12fps로 설정합니다.

3. 비디오 분석

1. Fiji로 비디오를 열 때 팝업 창의 두 가지 옵션인 "가상 스택 사용" 및 "회색조로 변환"으로 변환된 비디오를 엽니다(그림 2A).
2. 위에서 언급 한 것처럼 빈 첫 번째 프레임을 만듭니다.
3. AnimalTracker 플러그 인의 "활성 이미지 설정" 도구를 사용하여 처리 창을 가져오고 "타원형" 도구를 사용하여 원본 비디오 창에서 경기장을 도는 추적 영역을 만듭니다(그림 3A).
4. 처리 창의 첫 번째 빈 프레임에 대해 필터(그림 3A,3)와 두 필터의 매개변수(그림 4A-G)를 설정합니다. 그런 다음 원본 비디오 창에서 다음 프레임을 선택하고 처리 창의 필터링된 표면을 선택합니다(그림 5A-C).
   참고: 필터링 단계는 이미지 노이즈를 줄이거나 배경을 제거하는 역할을 하므로 프레임의 이진화에서 전경과 배경을 더 쉽게 분리할 수 있습니다.
5. 필터링된 처리 창이 선택되면 "임계값 설정" 도구를 사용하여 처리 창에 가려진 빨간색 프로필로 추적 플라이를 돌립니다(그림 3A, 4, 그림 5D-E 및 그림 6A).
6. "set blob-detector"를 사용하여 컴퓨터가 처리 창에 빨간색 프로파일이 있는 파리를 인식하도록 합니다(그림 3A, 5 및 그림 6B).
7. 프레임(901)을 비디오의 녹화 지속 시간 및 fps에 의해 계산된 성인 파리의 마지막 프레임으로 설정합니다(그림 3A, 6, 그림 6C).
   참고: 유충에 대한 다음 실험은 10분 동안 추적되었으므로 프레임 7200이 마지막 프레임으로 설정됩니다.
8. "얼룩 표시" 도구를 사용하여 원본 비디오 창에 추적 사각형을 표시합니다(그림 3A, 7 및 그림 6D, E). 그런 다음 추적을 시작하고 모니터링이 완료된 후 추적 파일을 내보냅니다(그림 3A, 8,9 및 그림 7A, B).

4. 추적 파일 분석

1. Animal 추적기 > 추적 분석기 플러그인을 사용하여 트랙 및 영역 파일을 로드합니다(그림 8A).
2. 영역 설정을 사용하여 원하는 인덱스를 선택하고 매개변수 설정을 변경합니다(그림 8). 프레임 속도를 사용하여 프레임 간격의 시간을 계산합니다.
   참고: 이 조건에서 프레임 속도는 15fps이고 프레임 간격은 기본 설정인 약 0.067초입니다(그림 8D).
3. 추적 분석기에서 분석한 후 스프레드시트 소프트웨어와 GraphPad Prism을 사용하여 정량 분석 차트를 생성합니다(그림 9).

5. 프레임당 분석

1. 프레임 간격당 속도 분석을 수행합니다. 더 자세한 조사가 필요한 경우 피지 없이 트랙 파일을 분석합니다.
   1. 트랙 파일을 열고 모든 좌표를 Microsoft Office Excel로 복사한 다음 스페이스 키를 사용하여 셀을 분할합니다.
      참고: 예를 들어, 파일이 "C" 및 "D" 열로 분할되면 프레임 간격당 초파리 의 속도는 "E" 열에 표시된 공식 SQRT((C5-C4)^ 2+(D5-D4)^2)로 계산됩니다(그림 10A). 열 "E"의 데이터는 파리가 두 프레임 간에 이동한 픽셀 수를 나타내며 첫 번째 프레임은 고려되지 않습니다. 계산된 모든 결과를 선택하고 꺾은선형 차트를 삽입하여 프레임 간격당 직관적인 비행 이동 속도를 나타내며 꺾은선형 차트에 피크가 표시됩니다(그림 10B).
2. 프레임 간격당 움직이지 않는 시간을 계산합니다. 파일을 "C" 및 "D" 열로 분할한 후 "E" 열에 표시된 IF(SQRT((C6-C5)^2+(D6-D5)^2) <20, 0, 1) 공식을 사용하여 프레임 간격당 초파리의 부동 상태를 계산합니다. (그림 10C).
   참고: 속도 분석과 달리 첫 번째 프레임의 결과가 정의되었습니다. 20픽셀 미만으로 이동한 파리는 움직이지 않는 것으로 간주되어 열 "E"에 "0"으로 기록되었습니다.
   1. 계산된 결과를 모두 선택하고 세로 막대형 차트를 삽입하여 전체 세로 막대형 차트의 여백만큼 움직이지 않는 시간을 시각적으로 표시합니다(그림 10D).
3. 방향 각도가 변경되는지 확인하십시오.
   참고: 방향 변경 각도 분석은 파리의 방향 선택을 나타냅니다. 파일이 "C" 및 "D" 열로 분할되면 방향 변경 각도는 "E" 열에 표시되는 ACOS(((SQRT((C7-C6)^2+(D7-D6)^2))^2+(SQRT((C6-C5)^2))^2-(SQRT((C7-C5)^2+(D7-D5)^2))^2)/(2*SQRT((C6-C5)^2+(D6-D5)^2))*( SQRT((C7-C6)^2+(D7-D6)^2)*180/PI()로 계산되며, 이는 "E" 열에 표시됩니다(그림 10E). 계산된 결과는 세 좌표 사이의 각도를 나타냅니다.
   1. 계산된 결과를 모두 선택하고 파리의 움직임에 따른 방향 변경 각도를 설명하기 위해 분산형 다이어그램을 삽입합니다(그림 10F).

결과

본 연구에서는 로테논으로 처리된 성충 파리와 세 번째 유충의 운동 결손을 조사하고 운동 활동을 약물 용매 디메틸 설폭사이드(DMSO)를 먹인 대조군 파리의 운동 활동과 비교했습니다. 초파리에서 로테논으로 치료하면 뇌에서 도파민성 뉴런 손실이 발생하고²² 상당한 운동 장애를 유발하는 것으로 나타났다²³. 그림 11 및 그림 12에서...

토론

우리는 피지 이미지 처리 프로그램과 호환되는 오픈 소스 자료 AnimalTracker API를 기반으로 연구자들이 성충 파리와 개별 유충 파리를 모두 추적하여 운동 활동을 체계적으로 평가할 수 있는 방법을 설계했습니다. AnimalTracke 는 자바로 작성된 도구로, 애플리케이션-설계된 동물 추적 행동의 분석을 용이하게 하기 위해 기존 데이터베이스 또는 다른 툴에 쉽게 통합될 수 있다

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Animal tracker	Hungarian Brain Research Program	version: 1.7	pfficial website: http://animaltracker.elte.hu/main/downloads
Camera software	Microsoft	version: 2021.105.10.0	built-in windows 10 system
Computer	DELL	Vostro-14-5480	a comupter running win 10 system is available
Drosophila carbon dioxide anesthesia workstation	Wu han Yihong technology	#YHDFPCO2-018	official website: http://www.yhkjwh.com/
Fiji software	Fiji team	version: 1.53v	official website: https://fiji.sc/
Format factory software	Pcfreetime	version: X64 5.4.5	official website: http://www.pcfreetime.com/formatfactory/CN/index.html
Graph pad prism	GraphPad Software	version: 8.0.2	official website: https://www.graphpad-prism.cn
Hight definition camera	TTQ	Jingwang2 (HD1080P F1.6 6-60mm)	official website: http://www.ttq100.com/product_show.php?id=35
Office software	Microsoft	version: office 2019	official website: https://www.microsoftstore.com.cn/software/office
Petri dish	Bkman	110301003	size: 60 mm
Silica gel	DOW	SYLGARD 184 Silicone Elastomer Kit	Mix well according to the instructions
Sodium bicarbonate	Macklin	#144-55-8	Mix well with silica gel