Uma técnica simples para avaliar a atividade locomotora em Drosophila

Resumo

O presente protocolo avalia a atividade locomotora de Drosophila rastreando e analisando o movimento de moscas em uma arena artesanal usando software de código aberto Fiji, compatível com plugins para segmentar pixels de cada quadro com base em gravação de vídeo de alta definição para calcular parâmetros de velocidade, distância, etc.

Resumo

Drosophila melanogaster é um organismo modelo ideal para o estudo de várias doenças devido à sua abundância de técnicas avançadas de manipulação genética e diversas características comportamentais. A identificação de deficiência comportamental em modelos animais é uma medida crucial da gravidade da doença, por exemplo, em doenças neurodegenerativas, onde os pacientes frequentemente experimentam prejuízos na função motora. No entanto, com a disponibilidade de vários sistemas para rastrear e avaliar déficits motores em modelos de moscas, como indivíduos tratados com drogas ou transgênicos, ainda falta um sistema econômico e fácil de usar para avaliação precisa de múltiplos ângulos. Desenvolve-se aqui um método baseado na interface de programação de aplicativos (API) AnimalTracker , compatível com o programa de processamento de imagens de Fiji, para avaliar sistematicamente as atividades de movimento de indivíduos adultos e larvais a partir de vídeos gravados, permitindo assim a análise de seu comportamento de rastreamento. Este método requer apenas uma câmera de alta definição e uma integração de hardware periférico de computador para gravar e analisar o comportamento, tornando-se uma abordagem acessível e eficaz para a triagem de modelos de moscas com deficiências comportamentais transgênicas ou ambientais. Exemplos de testes comportamentais usando moscas tratadas farmacologicamente são dados para mostrar como as técnicas podem detectar mudanças comportamentais em moscas adultas e larvas de maneira altamente repetível.

Introdução

Drosophila melanogaster fornece um excelente organismo modelo para investigar funções celulares e moleculares em modelos de doenças neuronais criadas por modificação gênica¹, tratamento medicamentoso² e senescência³. A alta conservação de vias biológicas, propriedades físicas e genes homólogos associados a doenças entre humanos e Drosophila torna a mosca-da-fruta uma mimética ideal desde o nível molecular até o comportamental⁴. Em muitos modelos de doenças, a deficiência comportamental é um índice importante, fornecendo um modelo útil para várias neuropatias humanas ^5,6. Atualmente, a drosófila é utilizada no estudo de múltiplas doenças humanas, do neurodesenvolvimento e de doenças neurodegenerativas, como a doença de Parkinson e a esclerose lateral amiotrófica7,8. A detecção da habilidade motora dos modelos de doença é crucial para a compreensão do progresso patogênico e pode fornecer uma correlação fenotípica com os mecanismos moleculares subjacentes ao processo da doença.

Recentemente, ferramentas de software disponíveis comercialmente e programas de baixo custo têm sido desenvolvidos para estratégias de detecção locomotora de Drosophila, tais como testes de alto rendimento em moscas agrupadas^9,10 e mensuração da locomoção em tempo real^11,12. Uma dessas abordagens convencionais é a geotáxi negativa interativa rápida (RING), também chamada de ensaio de escalada, que inclui múltiplos canais que permitem conter uma grande população de moscas com o mesmo sexo e idade, reduzindo a variação durante a coleta de dados ^9,13. Outro método de pré-teste para análise do comportamento locomotor é o TriKinetics Drosophila activity monitor (DAM), um dispositivo que utiliza múltiplos feixes para detectar o movimento da atividade das moscas dentro de um tubo de vidro fino¹⁴. O aparelho registra a posição continuamente, o que representa a locomoção automatizada por meio do cálculo dos cruzamentos de feixes para estudar a atividade e o ritmo circadiano das moscas em um período maior de tempo¹⁵. Embora esses métodos tenham sido amplamente utilizados na análise de defeitos comportamentais em moscas-das-frutas para determinar mudanças na locomoção comportamental, eles sempre requerem equipamentos especiais de teste ou processos complexos de análise, e restringem sua aplicação em alguns modelos com um dispositivo limitado e simples. Estratégias baseadas em grupos de rastreamento animal para testar a Drosophila adulta, como o FlyGrAM¹¹ e o ensaio da ilha de Drosophila ¹⁰, implementam o recrutamento social e o rastreamento individual em uma área predefinida. No entanto, a restrição social individual em áreas desafiadas pode ter um efeito negativo sobre as identificações nas imagens, causadas pela colisão ou sobreposição de moscas. Mesmo que alguns métodos baseados em materiais de código aberto, como TRex¹⁶, MARGO 12 e FlyPi¹⁷, tenham uma emergência, eles podem rastrear rapidamente as moscas com uso flexível em testes comportamentais. Essas abordagens de teste estão associadas a elaboradas instalações de aparelhos experimentais, requisitos especiais de software ou linguagens de computador profissionais. Para as larvas, a mensuração da distância total percorrida ao longo do número de linhas de borda da grade por unidade de tempo¹⁸, ou a contagem aproximada das contrações da parede corporal para os indivíduos manualmente¹⁹, são os métodos predominantes para avaliar sua capacidade locomotora. Devido à falta de precisão nos equipamentos ou dispositivos e métodos de análise, algumas locomoções comportamentais das larvas podem escapar à detecção, dificultando a avaliação precisa do movimento comportamental, especialmente o movimento^fino15.

O presente método desenvolvido utiliza a interface de programação de aplicativos (API) AnimalTracker , compatível com o programa de processamento de imagens Fiji (ImageJ), para avaliar sistematicamente a atividade locomotora de moscas adultas e larvais, analisando seu comportamento de rastreamento a partir de vídeos de alta definição (HD). Fiji é um software de código aberto ImageJ distribuição que pode combinar bibliotecas de software robustas com inúmeras linguagens de script, resultando em prototipagem rápida de algoritmos de processamento de imagem, tornando-o popular entre os biólogos por suas capacidades de análise de imagem²⁰. Na abordagem atual, a integração de Fiji na API AnimalTracker é explorada para desenvolver um ensaio comportamental exclusivo de Drosophila com inserção de algoritmo personalizado, e fornece uma etapa útil para documentação detalhada e tutoriais para apoiar capacidades analíticas robustas do comportamento locomotor (Figura 1). Para contornar a complicação de identificações objetivas nas imagens causadas pela colisão ou sobreposição de moscas, cada arena é restrita a hospedar apenas uma mosca. Ao avaliar a precisão do rastreamento da abordagem, implementou-se o rastreamento e quantificação dos movimentos locomotores de Drosophila que foram administrados com a droga tóxica rotenona, que geralmente é usada para modelos animais da doença de Parkinson, descobrindo o comprometimento da locomoção no tratamento medicamentoso²¹. Esta metodologia, que emprega software livre e de código aberto, não necessita de instrumentação de alto custo, podendo analisar de forma precisa e reprodutível a locomoção comportamental da Drosophila .

Protocolo

Foram utilizadas 1118 moscas adultas W ¹¹¹⁸ e larvas de terceiro ínstar para o presente estudo.

1. Preparação experimental

NOTA: Uma arena de campo aberto para rastreamento de locomoção de Drosophila é feita com sílica gel incolor e inodora.

1. Misture o reagente A e o reagente B na proporção de 1:10, de acordo com as instruções do fabricante para o kit de sílica (consulte a Tabela de Materiais). Certifique-se de que o bicarbonato de sódio é adicionado à mistura mexendo até que a cor mude para branco. Transfira a mistura para uma placa de Petri limpa e coloque-a em estufa a 40 °C para secagem por 48 h.
2. Configure a câmera HD (consulte Tabela de Materiais) em um tripé, ajustando-a para que a lente da câmera fique perpendicular à superfície da arena de sílica. Ajustando a distância focal e as aberturas da câmera, certifique-se de que a câmera esteja focada na superfície da sílica e que a tela esteja adequadamente iluminada. O arranjo experimental está ilustrado na Figura 1.
3. Transfira uma mosca para a arena de campo aberto para gravar um vídeo contínuo de pelo menos 61 s.
   NOTA: Considerando a natureza lenta das larvas, recomenda-se um tempo de gravação de vídeo de mais de 10 min.
   1. Abra o vídeo com Fiji, arraste a barra de progresso para o quadro inicial e aprove tacitamente. Escolha todo o corpo da mosca usando a ferramenta "seleção à mão livre" (Figura 2B,C).
   2. Clique na imagem > ajustar > brilho e contraste para ajustar o balanço de branco até que o valor de cinza da área selecionada se aproxime do plano de fundo amplo (Figura 2D-F).
      NOTA: A homogeneização de fundo do primeiro quadro permite que o software distinga o plano de fundo sem nenhum objeto e crie um contraste quando uma mosca está presente, permitindo assim que o software rastreiá-lo.
4. Realizar todo o experimento em um ambiente de teste definido para 25 °C e 60% de umidade relativa, em uma área silenciosa e desprovida de exposição à luz brilhante.

2. Gravação e pré-processamento de vídeo

1. Após um curto período de anestesia usando 95% de dióxido de carbono (CO₂), transfira uma mosca para a arena aberta e pressione o botão de gravação no aplicativo da câmera para iniciar a gravação de vídeo.
   NOTA: Para minimizar o efeito do anestésico na locomoção, permita que as moscas se recuperem por 10 min antes de iniciar a gravação do vídeo. A anestesia por resfriamento também é recomendada.
   1. Assim que as moscas se recuperarem da anestesia, coloque o prato de arena contendo a mosca sob a câmera e agite a placa rapidamente de um lado para o outro para garantir que a mosca esteja em movimento quando a gravação começar.
2. Após a conclusão da gravação, pressione o botão de parada para encerrar a gravação de vídeo.
   NOTA: Certifique-se de que o tempo de gravação de vídeo exceda ligeiramente o tempo de rastreamento de destino por uma pequena margem. Além disso, para melhorar a eficiência experimental, é possível rastrear várias moscas espontaneamente. Isso depende da resolução da câmera para permitir um corte de vídeo de alta qualidade.
3. Converta os vídeos gravados em formato AVI com codificação MJPEG, para que possam ser abertos e analisados usando Fiji. Enquanto isso, defina a taxa de quadros por segundo (fps) do vídeo para 15 fps para moscas adultas e 12 fps para larvas.

3. Análise de vídeo

1. Abra o vídeo que foi transformado com "use virtual stack" e "convert to grayscale", duas opções na janela pop-up ao abrir o vídeo com Fiji (Figura 2A).
2. Faça um primeiro quadro em branco, como mencionado acima.
3. Obtenha uma janela de processamento usando a ferramenta "set active image" do plugin AnimalTracker e crie uma área de rastreamento que circunda a arena na janela de vídeo original usando a ferramenta "oval" (Figura 3A).
4. Defina os filtros (Figura 3A,3) e os parâmetros dos dois filtros (Figura 4A-G) para o primeiro quadro em branco na janela de processamento. Em seguida, selecione o próximo quadro na janela de vídeo original e escolha a superfície filtrada da janela de processamento (Figura 5A-C).
   NOTA: A etapa de filtragem serve para diminuir o ruído da imagem e/ou remover o fundo, tornando assim mais simples separar o primeiro plano do plano de fundo na binarização dos quadros.
5. Uma vez selecionada uma janela de processamento filtrada, gire a mosca rastreada com um perfil vermelho coberto na janela de processamento usando a ferramenta "definir limite" (Figura 3A,4, Figura 5D-E e Figura 6A).
6. Use o "set blob-detector" para permitir que o computador reconheça a mosca com um perfil vermelho coberto na janela de processamento (Figura 3A,5 e Figura 6B).
7. Defina o quadro 901 como o último quadro para a mosca adulta, calculado pela duração da gravação do vídeo e fps (Figura 3A,6, Figura 6C).
   NOTA: O seguinte experimento com larvas foi rastreado por 10 min, portanto, o quadro 7200 é definido como o último quadro.
8. Use a ferramenta "show blobs" para apresentar um retângulo de rastreamento na janela de vídeo original (Figura 3A,7 e Figura 6D,E). Em seguida, inicie o rastreamento e exporte o arquivo de rastreamento após a conclusão do monitoramento (Figura 3A,8,9 e Figura 7A,B).

4. Análise de arquivos de rastreamento

1. Carregue os arquivos de faixa e zona usando o plug-in Animal tracker > Tracking analyzer (Figura 8A).
2. Selecione o índice desejado usando as configurações de zona e altere as configurações de parâmetro (Figura 8). Calcule o tempo do intervalo de quadros usando a taxa de quadros.
   Observação : nessa condição, a taxa de quadros é de 15 fps e o intervalo de quadros é de aproximadamente 0,067 s, que é a configuração padrão (Figura 8D).
3. Produzir os gráficos de análise quantitativa utilizando o software de planilhas eletrônicas e o GraphPad Prism após serem analisados no analisador de rastreamento (Figura 9).

5. Análise por quadro

1. Execute a análise de velocidade por intervalo de quadros. Analise o arquivo de trilha sem Fiji se uma pesquisa mais detalhada for necessária.
   1. Abra o arquivo de controle, copie todas as coordenadas para o Microsoft Office Excel e divida as células usando a chave de espaço.
      Observação : por exemplo, uma vez que o arquivo foi dividido em colunas "C" e "D", a velocidade de Drosophila por intervalo de quadro é calculada pela fórmula SQRT((C5-C4)^2+(D5-D4)^2), que é mostrada na coluna "E" (Figura 10A). Os dados na coluna "E" indicam o número de pixels que a mosca moveu entre dois quadros, com o primeiro quadro não sendo considerado. Selecione todos os resultados calculados e insira um gráfico de linhas para exibir uma velocidade de movimento de voo intuitiva por intervalo de quadros, com um pico no gráfico de linhas (Figura 10B).
2. Calcule o tempo de imobilidade por intervalo de quadros. Depois que o arquivo tiver sido dividido em colunas "C" e "D", calcule o status de imobilidade de Drosophila por intervalo de quadros usando a fórmula IF(SQRT((C6-C5)^2+(D6-D5)^2) <20, 0, 1), que é mostrada na coluna "E". (Figura 10C).
   NOTA: Ao contrário da análise de velocidade, os resultados do primeiro quadro foram definidos. As moscas que se moviam menos de 20 pixels foram consideradas imóveis e registradas como "0" na coluna "E".
   1. Selecione todos os resultados calculados e insira um gráfico de colunas para exibir visualmente o tempo de imobilidade pela margem de todo o gráfico de colunas (Figura 10D).
3. Certifique-se de que o ângulo de direção mude.
   NOTA: A análise de mudança de ângulo de direção representa a escolha de direção das moscas. Uma vez que o arquivo foi dividido em colunas "C" e "D", o ângulo de mudança de direção é calculado pela fórmula ACOS(((SQRT((C7-C6)^2+(D7-D6)^2))^2+(SQRT((C6-C5)^2+(D6-D5)^2))^2-(SQRT((C7-C5)^2+(D7-D5)^2))^2)/(2*SQRT((C6-C5)^2+(D6-D5)^2)) *(SQRT((C7-C6)^2+(D7-D6)^2)))*180/PI(), que é apresentado na coluna "E" (Figura 10E). Os resultados calculados indicam o ângulo entre três coordenadas.
   1. Selecione todos os resultados calculados e insira um diagrama de dispersão para ilustrar o ângulo de mudança de direção do movimento das moscas (Figura 10F).

Resultados

No presente estudo, déficits locomotores em moscas adultas e larvas de terceiro ínstar tratadas com rotenona foram examinados e comparados em sua atividade motora com a de uma mosca controle alimentada com o solvente dimetilsulfóxido (DMSO). Demonstrou-se que o tratamento com rotenona em Drosophila causa perda de neurônios dopaminérgicos no cérebro²² e leva a déficits locomotores significativos²³. Como mostrado na Figura 11 e na Figura 1...

Discussão

Projetamos um método, baseado no material de código aberto AnimalTracker API compatível com o programa de processamento de imagens de Fiji, que pode permitir que os pesquisadores avaliem sistematicamente a atividade locomotora rastreando larvas adultas e individuais. O AnimalTracke é uma ferramenta escrita em Java que pode ser facilmente integrada a bancos de dados existentes ou outras ferramentas para facilitar a análise do comportamento de rastreamento de animais projetado por aplicativos

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Animal tracker	Hungarian Brain Research Program	version: 1.7	pfficial website: http://animaltracker.elte.hu/main/downloads
Camera software	Microsoft	version: 2021.105.10.0	built-in windows 10 system
Computer	DELL	Vostro-14-5480	a comupter running win 10 system is available
Drosophila carbon dioxide anesthesia workstation	Wu han Yihong technology	#YHDFPCO2-018	official website: http://www.yhkjwh.com/
Fiji software	Fiji team	version: 1.53v	official website: https://fiji.sc/
Format factory software	Pcfreetime	version: X64 5.4.5	official website: http://www.pcfreetime.com/formatfactory/CN/index.html
Graph pad prism	GraphPad Software	version: 8.0.2	official website: https://www.graphpad-prism.cn
Hight definition camera	TTQ	Jingwang2 (HD1080P F1.6 6-60mm)	official website: http://www.ttq100.com/product_show.php?id=35
Office software	Microsoft	version: office 2019	official website: https://www.microsoftstore.com.cn/software/office
Petri dish	Bkman	110301003	size: 60 mm
Silica gel	DOW	SYLGARD 184 Silicone Elastomer Kit	Mix well according to the instructions
Sodium bicarbonate	Macklin	#144-55-8	Mix well with silica gel