JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Настоящий протокол оценивает локомоторную активность дрозофилы путем отслеживания и анализа движения мух на самодельной арене с использованием программного обеспечения с открытым исходным кодом Fiji, совместимого с плагинами для сегментации пикселей каждого кадра на основе видеозаписи высокой четкости для расчета параметров скорости, расстояния и т.д.

Аннотация

Drosophila melanogaster является идеальным модельным организмом для изучения различных заболеваний благодаря обилию передовых методов генетических манипуляций и разнообразным поведенческим особенностям. Выявление поведенческого дефицита на животных моделях является важнейшим показателем тяжести заболевания, например, при нейродегенеративных заболеваниях, когда пациенты часто испытывают нарушения двигательной функции. Однако при наличии различных систем для отслеживания и оценки двигательного дефицита в моделях мух, таких как лекарственные препараты или трансгенные люди, по-прежнему отсутствует экономичная и удобная для пользователя система для точной оценки с разных точек зрения. Здесь разработан метод, основанный на интерфейсе прикладного программирования (API) AnimalTracker , который совместим с программой обработки изображений Фиджи, для систематической оценки двигательной активности как взрослых, так и личиночных особей по записанному видео, что позволяет анализировать их поведение при отслеживании. Этот метод требует только камеры высокой четкости и интеграции компьютерного периферийного оборудования для записи и анализа поведения, что делает его доступным и эффективным подходом для скрининга моделей мух с трансгенными или экологическими поведенческими недостатками. Приведены примеры поведенческих тестов с использованием фармакологически обработанных мух, чтобы показать, как методы могут обнаруживать поведенческие изменения как у взрослых мух, так и у личинок с высокой повторяемостью.

Введение

Drosophila melanogaster является отличным модельным организмом для исследования клеточных и молекулярных функций в моделях нейрональных заболеваний, созданных с помощью модификациигенов 1, медикаментозного лечения2 и старения3. Высокая степень сохранности биологических путей, физических свойств и генов-гомологов, связанных с заболеванием, между человеком и дрозофилой делает плодовую мушку идеальным подражателем от молекулярного до поведенческого уровня4. Во многих моделях заболеваний поведенческий дефицит является важным показателем, обеспечивающим полезную модель для различных невропатийчеловека 5,6. Дрозофила в настоящее время используется для изучения множества заболеваний человека, развития нервной системы и нейродегенеративных заболеваний, таких как болезнь Паркинсона и боковой амиотрофический склероз 7,8. Обнаружение двигательной способности моделей заболевания имеет решающее значение для понимания патогенного прогресса и может обеспечить фенотипическую корреляцию с молекулярными механизмами, лежащими в основе процесса заболевания.

В последнее время были разработаны коммерчески доступные программные инструменты и экономически эффективные программы для стратегий обнаружения локомотора дрозофилы, такие как высокопроизводительные испытания на сгруппированных мухах9,10 и измерение локомоции в режиме реального времени11,12. Одним из таких традиционных подходов является быстрый интерактивный отрицательный геотаксис (RING), также называемый альпинистским анализом, который включает в себя несколько каналов, которые позволяют сдерживать большую популяцию мух того же пола и возраста, уменьшая вариации при сборе данных 9,13. Другим методом предварительного тестирования для анализа двигательного поведения является монитор активности дрозофилы TriKinetics (DAM), устройство, которое использует несколько лучей для обнаружения движения активности мух в тонкой стеклянной трубке14. Устройство непрерывно регистрирует положение, которое представляет собой автоматическую локомоцию путем вычисления пересечений лучей для изучения активности и циркадного ритма мух в течение более длительного периода времени15. Хотя эти методы широко используются при анализе поведенческих дефектов у плодовых мушек для определения изменений в поведенческой локомоции, они всегда требуют специального испытательного оборудования или сложных процессов анализа и ограничивают их применение в некоторых моделях с ограниченным, простым устройством. Групповые стратегии по отслеживанию животных для тестирования взрослых дрозофил, такие как FlyGrAM11 и анализ острова Drosophila 10, реализуют социальный набор и индивидуальное отслеживание в заранее определенной области. Тем не менее, социальные индивидуальные ограничения в неконтролируемых районах могут оказать негативное влияние на идентификацию на изображениях, вызванную столкновением или перекрытием мух. Несмотря на то, что некоторые методы, основанные на материалах с открытым исходным кодом, такие как TRex16, MARGO 12 и FlyPi17, имеют чрезвычайную ситуацию, они могут быстро отслеживать мух с гибким использованием в поведенческом тестировании. Эти подходы к тестированию связаны со сложными экспериментальными установками, специальными требованиями к программному обеспечению или профессиональными компьютерными языками. Для личинок измерение общего расстояния, пройденного по количеству пограничных линий сетки в единицу времени18, или грубый подсчет сокращений стенок тела для особей вручную19 являются преобладающими методами оценки их двигательных способностей. Из-за отсутствия точности в оборудовании или устройствах и методах анализа некоторые поведенческие локомоции личинок могут ускользнуть от обнаружения, что затрудняет точную оценку поведенческих движений, особенно тонких движений15.

В настоящем разработанном способе используется интерфейс прикладного программирования (API) AnimalTracker , совместимый с программой обработки изображений Fiji (ImageJ), для систематической оценки двигательной активности как взрослых, так и личинок мух путем анализа их поведения при отслеживании видео высокой четкости (HD). Fiji — это дистрибутив программного обеспечения ImageJ с открытым исходным кодом, который может сочетать надежные программные библиотеки с многочисленными языками сценариев, что приводит к быстрому прототипированию алгоритмов обработки изображений, что делает его популярным среди биологов благодаря своим возможностям анализа изображений20. В текущем подходе интеграция Фиджи в API AnimalTracker используется для разработки уникального поведенческого анализа дрозофилы с персонализированной вставкой алгоритма и обеспечивает полезный шаг для подробной документации и учебных пособий для поддержки надежных аналитических возможностей локомоторного поведения (рис. 1). Чтобы избежать усложнения объективной идентификации на изображениях, вызванного столкновением или перекрытием мух, каждая арена ограничена приемом только одной мухи. После оценки точности отслеживания подхода был реализован для отслеживания и количественной оценки локомоторных движений дрозофилы , которые вводили с токсичным препаратом ротеноном, который обычно используется для животных моделей болезни Паркинсона, в конечном итоге обнаружив нарушение локомоции при медикаментозном лечении21. Эта методология, использующая открытое и свободное программное обеспечение, не требует дорогостоящих инструментов и может точно и воспроизводимо анализировать поведенческую локомоцию дрозофилы .

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

протокол

Для настоящего исследования использовали W 1118 взрослых мух и личинок третьего возраста.

1. Экспериментальная подготовка

ПРИМЕЧАНИЕ: Открытая арена для отслеживания локомоции дрозофилы изготовлена из бесцветного силикагеля без запаха.

  1. Смешайте реагент А и реагент В в соотношении 1:10 в соответствии с инструкциями производителя к набору кремнезема (см. Таблицу материалов). Убедитесь, что в смесь добавлен бикарбонат натрия, помешивая, пока цвет не изменится на белый. Переложите смесь в чистую чашку Петри и поставьте ее в духовку при температуре 40 °C для сушки на 48 часов.
  2. Установите HD-камеру (см. Таблицу материалов) на штатив, отрегулировав его так, чтобы объектив камеры был перпендикулярен поверхности кварцевой арены. Регулируя фокусное расстояние и диафрагмы камеры, убедитесь, что камера сфокусирована на поверхности кремнезема и что дисплей достаточно освещен. Экспериментальная установка проиллюстрирована на рисунке 1.
  3. Перенесите муху на арену открытого поля, чтобы записать непрерывное видео продолжительностью не менее 61 с.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Учитывая вялый характер личинок, рекомендуется время видеозаписи более 10 минут.
    1. Откройте видео с Фиджи, перетащите индикатор выполнения в начальный кадр и молчаливо одобрите. Выберите все тело мухи с помощью инструмента «выбор от руки» (рис. 2B, C).
    2. Щелкните изображение> > отрегулируйте яркость и контрастность, чтобы настроить баланс белого до тех пор, пока значение серого выбранной области не приблизится к широкому фону (рис. 2D-F).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Гомогенизация фона первого кадра позволяет программному обеспечению различать фон без каких-либо объектов и создавать контраст при наличии мухи, что позволяет программному обеспечению отслеживать ее.
  4. Проведите весь эксперимент в тестовой среде с температурой 25 °C и относительной влажностью 60%, в тихом месте, где нет яркого света.

2. Запись и предварительная обработка видео

  1. После короткого периода анестезии с использованием 95% углекислого газа (CO2) перенесите муху на открытую арену и нажмите кнопку записи в приложении камеры, чтобы начать запись видео.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы свести к минимуму влияние анестетика на передвижение, дайте мухам восстановиться в течение 10 минут, прежде чем начинать видеозапись. Также рекомендуется холодная анестезия путем охлаждения.
    1. Как только мухи оправятся от анестезии, поместите тарелку с мухой под камеру и быстро встряхните пластину из стороны в сторону, чтобы убедиться, что муха находится в движении, когда начинается запись.
  2. По завершении записи нажмите кнопку остановки , чтобы прервать запись видео.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что время записи видео немного превышает время отслеживания пункта назначения с небольшим отрывом. Кроме того, для повышения эффективности эксперимента можно отслеживать несколько мух спонтанно. Это зависит от разрешения камеры, чтобы обеспечить качественную обрезку видео.
  3. Конвертируйте записанные видео в формат AVI с кодировкой MJPEG, чтобы их можно было открывать и анализировать с помощью Fiji. Между тем, установите частоту кадров в секунду (fps) видео на 15 кадров в секунду для взрослых мух и 12 кадров в секунду для личинок.

3. Анализ видео

  1. Откройте видео, которое было преобразовано с помощью «использовать виртуальный стек» и «преобразовать в оттенки серого», двух вариантов во всплывающем окне при открытии видео с Фиджи (рис. 2A).
  2. Сделайте пустой первый кадр, как уже говорилось выше.
  3. Получите окно обработки с помощью инструмента «установить активное изображение» плагина AnimalTracker и создайте область отслеживания, которая окружает арену в исходном видеоокне, используя инструмент «овал» (рис. 3A).
  4. Установите фильтры (рис. 3A,3) и параметры двух фильтров (рис. 4A-G) для первого пустого кадра в окне обработки. Затем выберите следующий кадр в исходном видеоокне и выберите отфильтрованную поверхность окна обработки (рис. 5A-C).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Этап фильтрации служит для уменьшения шума изображения и/или удаления фона, тем самым упрощая отделение переднего плана от фона при бинаризации кадров.
  5. После того, как отфильтрованное окно обработки выбрано, поверните гусеничную муху с красным профилем, закрытым в окне обработки, с помощью инструмента «установить порог» (рис. 3A, 4, рис. 5D-E и рис. 6A).
  6. Используйте «set blob-detector», чтобы компьютер распознал муху с красным профилем, закрытым в окне обработки (рис. 3A, 5 и рис. 6B).
  7. Установите кадр 901 в качестве последнего кадра для взрослой мухи, рассчитанного по длительности записи видео и частоте кадров в секунду (рис. 3A,6, рис. 6C).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Следующий эксперимент с личинками отслеживался в течение 10 минут, поэтому кадр 7200 установлен в качестве последнего кадра.
  8. Используйте инструмент «показать большие двоичные объекты», чтобы представить прямоугольник отслеживания в исходном видеоокне (рис. 3A, 7 и рис. 6D, E). Затем запустите отслеживание и экспортируйте файл отслеживания после завершения мониторинга (рис. 3A, 8, 9 и рис. 7A, B).

4. Отслеживание анализа файлов

  1. Загрузите файлы треков и зон с помощью плагина Animal tracker > Tracking analyzer (рисунок 8A).
  2. Выберите нужный индекс с помощью настроек зоны и измените настройки параметров (рисунок 8). Рассчитайте время интервала кадров, используя частоту кадров.
    ПРИМЕЧАНИЕ: В этом случае частота кадров составляет 15 кадров в секунду, а интервал кадров составляет примерно 0,067 с, что является настройкой по умолчанию (рис. 8D).
  3. Создайте диаграммы количественного анализа с помощью программного обеспечения для работы с электронными таблицами и GraphPad Prism после анализа в анализаторе отслеживания (рис. 9).

5. Анализ каждого кадра

  1. Выполняйте анализ скорости для каждого интервала кадров. Проанализируйте файл трека без Фиджи, если требуется более подробное исследование.
    1. Откройте файл трека, скопируйте все координаты в Microsoft Office Excel и разделите ячейки с помощью клавиши пробела.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Например, после того, как файл был разделен на столбцы «C» и «D», скорость дрозофилы за интервал кадра рассчитывается по формуле SQRT ((C5-C4) ^ 2 + (D5-D4) ^ 2), которая показана в столбце «E» (рис. 10A). Данные в столбце «E» указывают количество пикселей, на которое муха переместилась между двумя кадрами, при этом первый кадр не учитывается. Выберите все вычисленные результаты и вставьте линейную диаграмму, чтобы показать интуитивно понятную скорость движения мухи за интервал кадра с пиком на линейном графике (рис. 10B).
  2. Рассчитайте время неподвижности за интервал кадра. После того, как файл был разбит на столбцы «C» и «D», рассчитайте состояние неподвижности дрозофилы за интервал кадров по формуле ЕСЛИ(SQRT((C6-C5)^2+(D6-D5)^2) <20, 0, 1), которая показана в столбце «E». (Рисунок 10С).
    ПРИМЕЧАНИЕ: В отличие от анализа скорости, результаты первого кадра были определены. Мухи, которые переместились менее чем на 20 пикселей, считались неподвижными и записывались как «0» в столбце «E».
    1. Выберите все вычисленные результаты и вставьте гистограмму, чтобы визуально отобразить время неподвижности на полях всей гистограммы (рис. 10D).
  3. Убедитесь, что угол направления изменился.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Анализ угла изменения направления представляет собой выбор направления мухами. После того, как файл был разбит на столбцы «C» и «D», угол изменения направления вычисляется по формуле ACOS(((SQRT((C7-C6)^2+(D7-D6)^2))^2+(SQRT((C6-C5)^2+(D6-D5)^2))^2-(SQRT((C7-C5)^2+(D7-D5)^2))^2)/(2*SQRT((C6-C5)^2 +(D6-D5)^2))*(SQRT((C7-C6)^2+(D7-D6)^2)))*180/PI(), которая представлена в столбце «E» (рис. 10E). В вычисленных результатах указывается угол между тремя координатами.
    1. Выберите все вычисленные результаты и вставьте точечную диаграмму, чтобы проиллюстрировать угол изменения направления движения мух (рис. 10F).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Результаты

В настоящем исследовании был изучен двигательный дефицит у взрослых мух и личинок третьего возраста, обработанных ротеноном, и их двигательная активность сравнивалась с таковой у контрольной мухи, получавшей лекарственный растворитель диметилсульфоксид (ДМСО). Было показано, что леч?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Обсуждение

Мы разработали метод, основанный на материалах с открытым исходным кодом AnimalTracker API, совместимых с программой обработки изображений Фиджи, который может позволить исследователям систематически оценивать двигательную активность, отслеживая как взрослых, так и отдельных личинок м?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Раскрытие информации

Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих финансовых интересов.

Благодарности

Эта работа была поддержана специальным стартовым фондом Университета Сучжоу и Национальным научным фондом Китая (NSFC) (82171414). Мы благодарим сотрудников лаборатории профессора Чуньфэн Лю за их обсуждение и комментарии.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
Animal trackerHungarian Brain Research Programversion: 1.7pfficial website: http://animaltracker.elte.hu/main/downloads
Camera softwareMicrosoftversion: 2021.105.10.0built-in windows 10 system
ComputerDELLVostro-14-5480a comupter running win 10 system is available
Drosophila carbon dioxide anesthesia workstationWu han Yihong technology#YHDFPCO2-018official website: http://www.yhkjwh.com/
Fiji softwareFiji teamversion: 1.53vofficial website: https://fiji.sc/
Format factory softwarePcfreetimeversion: X64 5.4.5official website: http://www.pcfreetime.com/formatfactory/CN/index.html
Graph pad prismGraphPad Softwareversion: 8.0.2official website: https://www.graphpad-prism.cn
Hight definition cameraTTQJingwang2 (HD1080P F1.6 6-60mm)official website: http://www.ttq100.com/product_show.php?id=35
Office softwareMicrosoftversion: office 2019official website: https://www.microsoftstore.com.cn/software/office
Petri dishBkman110301003size: 60 mm
Silica gelDOWSYLGARD 184 Silicone Elastomer KitMix well according to the instructions
Sodium bicarbonateMacklin#144-55-8Mix well with silica gel

Ссылки

  1. Ham, S. J., et al. Loss of UCHL1 rescues the defects related to Parkinson's disease by suppressing glycolysis. Science Advances. 7 (28), (2021).
  2. Algarve, T. D., Assmann, C. E., Aigaki, T., da Cruz, I. B. M. Parental and preimaginal exposure to methylmercury disrupts locomotor activity and circadian rhythm of adult Drosophila melanogaster. Drug and Chemical Toxicology. 43 (3), 255-265 (2020).
  3. Jones, M. A., Grotewiel, M. Drosophila as a model for age-related impairment in locomotor and other behaviors. Experimental Gerontology. 46 (5), 320-325 (2011).
  4. Yamaguchi, M., Yoshida, H. Drosophila as a model organism. Advances in Experimental Medicine and Biology. 1076, 1-10 (2018).
  5. Rothenfluh, A., Heberlein, U. Drugs, files, and videotape: the effects of ethanol and cocaine on Drosophila locomotion. Current Opinion in Neurobiology. 12 (6), 639-645 (2002).
  6. Tsuda, L., Lim, Y. M. Alzheimer's disease model system using Drosophila. Advances in Experimental Medicine and Biology. 1076, 25-40 (2018).
  7. Dung, V. M., Thao, D. T. P. Parkinson's disease model. Advances in Experimental Medicine and Biology. 1076, 41-61 (2018).
  8. Liguori, F., Amadio, S., Volonte, C. Fly for ALS: Drosophila modeling on the route to amyotrophic lateral sclerosis modifiers. Cellular and Molecular Life Sciences. 78 (17-18), 6143-6160 (2021).
  9. Cao, W., et al. An automated rapid iterative negative geotaxis assay for analyzing adult climbing behavior in a Drosophila model of neurodegeneration. Journal of Visualized Experiments. (127), 56507(2017).
  10. Eidhof, I., et al. High-throughput analysis of locomotor behavior in the Drosophila island assay. Journal of Visualized Experiments. (129), 55892(2017).
  11. Scaplen, K. M., et al. Automated real-time quantification of group locomotor activity in Drosophila melanogaster. Scientific Reports. 9 (1), 4427(2019).
  12. Werkhoven, Z., Rohrsen, C., Qin, C., Brembs, B., de Bivort, B. MARGO (Massively Automated Real-time GUI for Object-tracking), a platform for high-throughput ethology. PLoS One. 14 (11), e0224243(2019).
  13. Gargano, J. W., Martin, I., Bhandari, P., Grotewiel, M. S. Rapid iterative negative geotaxis (RING): a new method for assessing age-related locomotor decline in Drosophila. Experimental Gerontology. 40 (5), 386-395 (2005).
  14. Cichewicz, K., Hirsh, J. ShinyR-DAM: a program analyzing Drosophila activity, sleep and circadian rhythms. Communications Biology. 1, 25(2018).
  15. McParland, A. L., Follansbee, T. L., Ganter, G. K. Measurement of larval activity in the Drosophila activity monitor. Journal of Visualized Experiments. 98, e52684(2015).
  16. Walter, T., Couzin, I. D. TRex, a fast multi-animal tracking system with markerless identification, and 2D estimation of posture and visual fields. eLife. 10, (2021).
  17. Maia Chagas, A., Prieto-Godino, L. L., Arrenberg, A. B., Baden, T. The €100 lab: A 3D-printable open-source platform for fluorescence microscopy, optogenetics, and accurate temperature control during behaviour of zebrafish, Drosophila, and Caenorhabditis elegans. PLoS Biology. 15 (7), e2002702(2017).
  18. Nichols, C. D., Becnel, J., Pandey, U. B. Methods to assay Drosophila behavior. Journal of Visualized Experiments. (61), (2012).
  19. Xiao, G. Methods to assay the behavior of Drosophila melanogaster for toxicity study. Methods in Molecular Biology. 2326, 47-54 (2021).
  20. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  21. Johnson, M. E., Bobrovskaya, L. An update on the rotenone models of Parkinson's disease: their ability to reproduce the features of clinical disease and model gene-environment interactions. Neurotoxicology. 46, 101-116 (2015).
  22. Coulom, H., Birman, S. Chronic exposure to rotenone models sporadic Parkinson's disease in Drosophila melanogaster. The Journal of Neuroscience. 24 (48), 10993-10998 (2004).
  23. Kumar, P. P., Bawani, S. S., Anandhi, D. U., Prashanth, K. V. H. Rotenone mediated developmental toxicity in Drosophila melanogaster. Environmental Toxicology and Pharmacology. 93, 103892(2022).
  24. Gulyas, M., Bencsik, N., Pusztai, S., Liliom, H., Schlett, K. AnimalTracker: an ImageJ-based tracking API to create a customized behaviour analyser program. Neuroinformatics. 14 (4), 479-481 (2016).
  25. Qu, S. EasyFlyTracker: a simple video tracking Python package for analyzing adult Drosophila locomotor and sleep activity to facilitate revealing the effect of psychiatric drugs. Frontiers in Behavioral Neuroscience. 15, 809665(2022).
  26. Yarwais, Z. H., Najmalddin, H. O., Omar, Z. J., Mohammed, S. A. Automated data collection of Drosophila movement behaviour assays using computer vision in Python. International Journal of Innovative Approaches in Science Research. 4 (1), 15-22 (2020).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

JoVE192Drosophila melanogasterAnimalTracker API

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены