ショウジョウバエの自発運動活性をアッセイする簡単な技術

要約

本プロトコルは、オープンソースソフトウェアフィジーを使用して手作りのアリーナでのハエの動きを追跡および分析することにより、ショ ウジョウバエ の自発運動を評価し、高解像度ビデオ録画に基づいて各フレームのピクセルをセグメント化し、速度、距離などのパラメータを計算するプラグインと互換性があります。

要約

ショウジョウバエは 、高度な遺伝子操作技術が豊富で、多様な行動特徴があるため、さまざまな疾患を研究するための理想的なモデル生物です。動物モデルにおける行動不全の特定は、例えば、患者が運動機能の障害を経験することが多い神経変性疾患において、疾患の重症度の重要な尺度である。しかし、薬物治療やトランスジェニック個体など、ハエモデルの運動障害を追跡および評価するためのさまざまなシステムが利用できるため、複数の角度から正確に評価するための経済的でユーザーフレンドリーなシステムはまだ不足しています。ここでは、フィジーの画像処理プログラムと互換性のある AnimalTracker アプリケーションプログラミングインターフェース(API)に基づく手法を開発し、記録されたビデオから成虫と幼虫の両方の個体の移動活動を体系的に評価し、追跡行動の分析を可能にします。この方法は、行動を記録および分析するために高解像度カメラとコンピューター周辺機器の統合のみを必要とするため、トランスジェニックまたは環境行動障害のあるハエモデルをスクリーニングするための手頃な価格で効果的なアプローチになります。薬理学的に処理されたハエを用いた行動試験の例を挙げて、成虫のハエと幼虫の両方の行動変化を再現性の高い方法で検出する方法を示します。

概要

ショウジョウバエメラノガスターは、遺伝子改変¹、薬物治療²、老化³によって作成された神経疾患モデルにおける細胞および分子機能を調べるための優れたモデル生物を提供します。ヒトとショウジョウバエの間の生物学的経路、物理的特性、および疾患関連ホモログ遺伝子の高い保存により、ショウジョウバエは分子レベルから行動レベル⁴までの理想的な模倣になります。多くの疾患モデルにおいて、行動不全は重要な指標であり、さまざまなヒトニューロパシーに有用なモデルを提供します^5,6。ショウジョウバエは現在、複数のヒト疾患、神経発達、およびパーキンソン病や筋萎縮性側索硬化症などの神経変性疾患の研究に使用されています^7,8。疾患モデルの運動能力を検出することは、病原性の進行を理解するために重要であり、疾患プロセスの根底にある分子メカニズムとの表現型の相関関係を提供する可能性があります。

最近、市販のソフトウェアツールと費用対効果の高いプログラムが、グループ化されたハエ^9,10でのハイスループットテストやリアルタイムでの移動の測定^11,12など、ショウジョウバエの自発運動検出戦略のために開発されました。そのような従来のアプローチの1つは、クライミングアッセイとも呼ばれる迅速なインタラクティブネガティブジオタキシス(RING)であり、同じ性別と年齢の大規模なハエの個体群を封じ込めることを可能にする複数のチャネルを含み、データ収集中の変動を減らします^9,13。自発運動挙動を分析するための別の事前試験方法は、TriKinetics ショウジョウバエ活動モニタ(DAM)であり、これは、薄いガラス管¹⁴内のハエ活動運動を検出するために複数のビームを使用する装置である。この装置は、位置を連続的に記録し、これは、より長い期間にわたるハエの活動および概日リズムを研究するためにビーム交差を計算することによって自動移動を表す¹⁵。これらの方法は、ショウジョウバエの行動欠陥を分析して行動移動の変化を決定する際に広く使用されてきましたが、常に特別な試験装置または複雑な分析プロセスが必要であり、限られた単純な装置で一部のモデルでは適用が制限されています。FlyGrAM¹¹やショウジョウバエアイランドアッセイ¹⁰など、成虫のショウジョウバエをテストするための動物追跡グループベースの戦略は、事前定義された領域で社会的募集と個々の追跡を実装します。それにもかかわらず、反抗された地域での社会的個人的制限は、ハエの衝突または重なりによって引き起こされる画像内の識別に悪影響を与える可能性があります。TRex¹⁶、MARGO 12、FlyPi¹⁷などのオープンソースのマテリアルベースの方法には緊急事態がありますが、行動テストで柔軟に使用することで、ハエを迅速に追跡できます。これらのテストアプローチは、精巧な実験装置の設置、特別なソフトウェア要件、またはプロのコンピューター言語に関連しています。幼虫の場合、単位時間¹⁸あたりのグリッド境界線の数を横切って移動した総距離を測定するか、または個人の体壁収縮を手動で大まかに数えること¹⁹は、自発運動能力を評価するための主要な方法です。機器や装置、分析方法の精度が不足しているため、幼虫の行動移動が検出を逃れ、行動運動、特に微細な動きを正確に評価することが困難になる可能性があります¹⁵。

本開発手法は,画像処理プログラム「フィジー(ImageJ)」と互換性のあるアプリケーションプログラミングインターフェース(API) AnimalTracker を利用し,高精細(HD)映像からハエの追跡行動を解析し,成虫と仔魚の運動活動を系統的に評価する手法である.フィジーはオープンソースソフトウェアです ImageJディストリビューション 堅牢なソフトウェアライブラリと多数のスクリプト言語を組み合わせることができるため、画像処理アルゴリズムのラピッドプロトタイピングが可能になり、画像分析機能で生物学者の間で人気があります²⁰。現在のアプローチでは、フィジーの AnimalTracker APIへの統合を利用して、パーソナライズされたアルゴリズム挿入を備えた独自の ショウジョウバエ 行動アッセイを開発し、自発運動行動の堅牢な分析機能をサポートするための詳細なドキュメントとチュートリアルの有用なステップを提供します(図1)。ハエの衝突または重なりによって引き起こされる画像内の客観的識別の複雑さを回避するために、各アリーナは1つのハエのみをホストするように制限されています。アプローチの追跡精度を評価した上で、パーキンソン病の動物モデルに一般的に使用されている毒性薬物ロテノンを投与された ショウジョウバエ の運動運動を追跡および定量化するために実施され、最終的に薬物治療における移動障害を発見した²¹。オープンソースでフリーなソフトウェアを採用したこの方法論は、高コストの計測を必要とせず、 ショウジョウバエ の行動運動を正確かつ再現性よく解析することができます。

プロトコル

W¹¹¹⁸ 成虫のハエと3齢幼虫を本研究に用いた。

1. 実験準備

注: ショウジョウバエ の移動追跡のためのオープンフィールドアリーナは、無色無臭のシリカゲルで作られています。

1. 試薬Aと試薬Bを、シリカキットの製造元の説明書に従って1:10の比率で混合します( 材料表を参照)。色が白に変わるまで攪拌することにより、重炭酸ナトリウムが混合物に添加されていることを確認します。混合物をきれいなペトリ皿に移し、40°Cのオーブンに入れて48時間乾燥させます。
2. HDカメラ( 材料表を参照)を三脚にセットし、カメラのレンズがシリカアリーナの表面に垂直になるように調整します。カメラの焦点距離と絞りを調整し、カメラがシリカの表面に焦点を合わせ、ディスプレイが適切に照らされていることを確認します。実験のセットアップを 図1に示します。
3. フライをオープンフィールドアリーナに移して、少なくとも61秒の連続ビデオを録画します。
   注:幼虫の鈍い性質を考慮すると、10分以上のビデオ録画時間をお勧めします。
   1. フィジーでビデオを開き、進行状況バーを最初のフレームにドラッグして、暗黙のうちに承認します。「フリーハンド選択」ツールを使用してフライの全身を選択します(図2B、C)。
   2. 画像をクリックして>明るさとコントラスト>調整し、選択した領域のグレー値が広い背景に近づくまでホワイトバランスを調整します(図2D-F)。
      注:最初のフレームの背景の均質化により、ソフトウェアはオブジェクトなしで背景を区別し、ハエが存在する場合にコントラストを作成できるため、ソフトウェアがそれを追跡できるようになります。
4. 実験全体は、25°C、相対湿度60%に設定されたテスト環境で、静かで明るい光にさらされない場所で実行してください。

2.ビデオ録画と前処理

1. を使用して短時間麻酔した後95%二酸化炭素(CO₂)、オープンフィールドのアリーナにハエを移し、カメラアプリケーションの録画ボタンを押してビデオ録画を開始します。
   注意: 移動に対する麻酔薬の影響を最小限に抑えるために、ビデオ録画を開始する前に、ハエが10分間回復するのを待ちます。冷やして冷やす麻酔もおすすめです。
   1. ハエが麻酔から回復したら、ハエが入ったアリーナディッシュをカメラの下に置き、プレートを左右にすばやく振って、記録の開始時にハエが動いていることを確認します。
2. 録画が完了したら、 停止 ボタンを押してビデオ録画を終了します。
   注意: ビデオ録画時間が目的地の追跡時間をわずかに超えていることを確認してください。また、実験効率を向上させ、複数のハエを自発的に追跡することができる。これは、高品質のビデオトリミングを有効にするためのカメラの解像度に依存します。
3. 録画したビデオをMJPEGエンコーディングのAVI形式に変換して、フィジーを使用して開いて分析できるようにします。一方、ビデオのフレーム/秒(fps)レートを、成虫のハエの場合は15 fps、幼虫の場合は12 fpsに設定します。

3.ビデオ分析

1. フィジーでビデオを開くときに、ポップアップウィンドウの2つのオプションである「仮想スタックを使用する」と「グレースケールに変換」で変換されたビデオを開きます(図2A)。
2. 上記のように、空白の最初のフレームを作成します。
3. AnimalTrackerプラグインの「アクティブな画像の設定」ツールを使用して処理ウィンドウを取得し、「楕円形」ツールを使用して元のビデオウィンドウのアリーナを一周する追跡領域を作成します(図3A)。
4. 処理ウィンドウの最初の空白フレームのフィルター(図3A,3)と2つのフィルターのパラメーター(図4A-G)を設定します。次に、元のビデオウィンドウの次のフレームを選択し、処理ウィンドウのフィルタリングされたサーフェスを選択します(図5A-C)。
   注:フィルタリングステップは、画像ノイズを減らしたり、背景を削除したりするのに役立つため、フレームの二値化で前景を背景から分離するのが簡単になります。
5. フィルタリングされた処理ウィンドウを選択したら、「しきい値の設定」ツールを使用して、処理ウィンドウで覆われた赤いプロファイルで追跡されたフライを回転させます(図3A、4、図5D-E、および図6A)。
6. 「ブロブ検出器の設定」を使用して、処理ウィンドウで覆われた赤いプロファイルでコンピューターにハエを認識させます(図3A、5および図6B)。
7. フレーム901を、ビデオの録画時間とfpsによって計算された大人のハエの最後のフレームとして設定します(図3A、6、図6C)。
   注:幼虫を使用した次の実験は10分間追跡されているため、フレーム7200が最後のフレームとして設定されています。
8. "show blobs" ツールを使用して、元のビデオ ウィンドウにトラッキング四角形を表示します (図 3A、7 および図 6D、E)。次に、追跡を開始し、監視が完了したら追跡ファイルをエクスポートします(図3A、8、9および図7A、B)。

4.追跡ファイル分析

1. 動物トラッカー>トラッキングアナライザープラグインを使用して、トラックファイルとゾーンファイルをロードします(図8A)。
2. ゾーン設定を使用して目的のインデックスを選択し、パラメータ設定を変更します(図8)。フレームレートを使用してフレーム間隔の時間を計算します。
   メモ: この状態では、フレームレートは 15 fps で、フレーム間隔は約 0.067 秒で、これはデフォルト設定です(図 8D)。
3. トラッキングアナライザーで分析した後、スプレッドシートソフトウェアとGraphPad Prismを使用して定量分析チャートを作成します(図9)。

5.フレームごとの分析

1. フレーム間隔ごとに速度分析を実行します。より詳細な調査が必要な場合は、フィジーなしでトラックファイルを分析してください。
   1. トラック ファイルを開き、すべての座標を Microsoft Office Excel にコピーし、スペース キーを使用してセルを分割します。
      注:たとえば、ファイルが「C」列と「D」列に分割されると、フレーム間隔あたりの ショウジョウバエ の速度は、「E」列に表示される式 SQRT((C5-C4)^2+(D5-D4)^2)によって計算されます(図10A)。列「E」のデータは、フライが2つのフレーム間を移動したピクセル数を示し、最初のフレームは考慮されません。すべての計算結果を選択し、折れ線グラフを挿入して、フレーム間隔ごとの直感的なフライ移動速度を示し、折れ線グラフにピークを示します(図10B)。
2. フレーム間隔ごとの不動時間を計算します。ファイルを「C」列と「D」列に分割した後、「E」列に表示される式IF(SQRT((C6-C5)^2+(D6-D5)^2)<20, 0, 1)を使用して、フレーム間隔ごとのショウジョウバエの不動状態を計算します。(図10C)。
   注: 速度解析とは異なり、最初のフレームの結果が定義されています。20ピクセル未満しか移動しないハエは不動と見なされ、列「E」に「0」として記録されました。
   1. すべての計算結果を選択し、縦棒グラフを挿入して、縦棒グラフ全体の余白で不動時間を視覚的に示します (図 10D)。
3. 方向の角度が変わることを確認します。
   注: 方向変化角度解析は、ハエの方向選択を表します。ファイルが "C" 列と "D" 列に分割されると、方向変化の角度は式 ACOS(((SQRT((C7-C6)^2+(D7-D6)^2))^2+(SQRT((C6-C5)^2+(D6-D5)^2))^2-(SQRT((C7-C5)^2+(D7-D5)^2))^2)/(2*SQRT((C6-C5)^2+(D6-D5)^2))*( SQRT((C7-C6)^2+(D7-D6)^2)))*180/PI()) によって計算され、"E" 列に表示されます (図 10E)。計算結果は、3つの座標間の角度を示します。
   1. すべての計算結果を選択し、ハエの動きの方向変化の角度を示す散布図を挿入します(図10F)。

結果

本研究では、ロテノンで処理された成虫のハエと3齢幼虫の自発運動障害を調べ、薬物溶媒ジメチルスルホキシド(DMSO)を与えられた対照ハエの運動活動と比較しました。ショウジョウバエにおけるロテノンによる治療は、脳²²においてドーパミン作動性ニューロン喪失を引き起こし、重大な自発運動障害²³を引き起こすことが示されている。図

ディスカッション

フィジーの画像処理プログラムと互換性のあるオープンソースの AnimalTracker APIに基づいて、研究者が成虫と個々の幼虫の両方のハエを追跡することにより、自発運動活動を体系的に評価できるようにする方法を設計しました。 AnimalTracke はJavaで書かれたツールであり、既存のデータベースや他のツールに簡単に統合して、アプリケーションで設計された動物の追跡行動の分析を?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Animal tracker	Hungarian Brain Research Program	version: 1.7	pfficial website: http://animaltracker.elte.hu/main/downloads
Camera software	Microsoft	version: 2021.105.10.0	built-in windows 10 system
Computer	DELL	Vostro-14-5480	a comupter running win 10 system is available
Drosophila carbon dioxide anesthesia workstation	Wu han Yihong technology	#YHDFPCO2-018	official website: http://www.yhkjwh.com/
Fiji software	Fiji team	version: 1.53v	official website: https://fiji.sc/
Format factory software	Pcfreetime	version: X64 5.4.5	official website: http://www.pcfreetime.com/formatfactory/CN/index.html
Graph pad prism	GraphPad Software	version: 8.0.2	official website: https://www.graphpad-prism.cn
Hight definition camera	TTQ	Jingwang2 (HD1080P F1.6 6-60mm)	official website: http://www.ttq100.com/product_show.php?id=35
Office software	Microsoft	version: office 2019	official website: https://www.microsoftstore.com.cn/software/office
Petri dish	Bkman	110301003	size: 60 mm
Silica gel	DOW	SYLGARD 184 Silicone Elastomer Kit	Mix well according to the instructions
Sodium bicarbonate	Macklin	#144-55-8	Mix well with silica gel