Une technique simple pour doser l’activité locomotrice chez la drosophile

Résumé

Le présent protocole évalue l’activité locomotrice de la drosophile en suivant et en analysant le mouvement des mouches dans une arène faite à la main à l’aide du logiciel open source Fiji, compatible avec des plugins pour segmenter les pixels de chaque image sur la base d’un enregistrement vidéo haute définition pour calculer des paramètres de vitesse, de distance, etc.

Résumé

Drosophila melanogaster est un organisme modèle idéal pour l’étude de diverses maladies en raison de son abondance de techniques de manipulation génétique avancées et de diverses caractéristiques comportementales. L’identification des déficiences comportementales dans les modèles animaux est une mesure cruciale de la gravité de la maladie, par exemple, dans les maladies neurodégénératives où les patients présentent souvent des altérations de la fonction motrice. Cependant, avec la disponibilité de divers systèmes pour suivre et évaluer les déficits moteurs dans les modèles de mouches, tels que les personnes traitées par des médicaments ou transgéniques, un système économique et convivial pour une évaluation précise sous plusieurs angles fait toujours défaut. Une méthode basée sur l’interface de programmation d’application (API) AnimalTracker est développée ici, qui est compatible avec le programme de traitement d’image des Fidji, pour évaluer systématiquement les activités de mouvement des individus adultes et larvaires à partir de vidéos enregistrées, permettant ainsi l’analyse de leur comportement de suivi. Cette méthode ne nécessite qu’une caméra haute définition et une intégration matérielle périphérique informatique pour enregistrer et analyser le comportement, ce qui en fait une approche abordable et efficace pour le dépistage de modèles de mouches présentant des déficiences comportementales transgéniques ou environnementales. Des exemples de tests comportementaux utilisant des mouches traitées pharmacologiquement sont donnés pour montrer comment les techniques peuvent détecter les changements de comportement chez les mouches adultes et les larves d’une manière hautement reproductible.

Introduction

Drosophila melanogaster fournit un excellent organisme modèle pour étudier les fonctions cellulaires et moléculaires dans les modèles de maladies neuronales créés par la modification du gène¹, le traitement médicamenteux² et la sénescence³. La conservation élevée des voies biologiques, des propriétés physiques et des gènes homologues associés aux maladies entre les humains et la drosophile fait de la mouche des fruits un imitateur idéal du niveau moléculaire au niveau comportemental⁴. Dans de nombreux modèles de maladies, la déficience comportementale est un indice important, fournissant un modèle utile pour diverses neuropathies humaines ^5,6. La drosophile est maintenant utilisée pour étudier de multiples maladies humaines, le développement neurologique et les maladies neurodégénératives telles que la maladie de Parkinson et la sclérose latérale amyotrophique ^7,8. La détection de la capacité motrice des modèles de maladie est cruciale pour comprendre le progrès pathogène et peut fournir une corrélation phénotypique avec les mécanismes moléculaires sous-jacents au processus de la maladie.

Récemment, des outils logiciels disponibles dans le commerce et des programmes rentables ont été développés pour les stratégies de détection locomotrice de la drosophile, telles que les tests à haut débit chez les mouches groupées^9,10 et la mesure de la locomotion en temps réel^11,12. L’une de ces approches conventionnelles est la géotaxie négative interactive rapide (RING), également appelée test d’escalade, qui comprend plusieurs canaux permettant de contenir une grande population de mouches du même sexe et du même âge, réduisant ainsi la variation tout en collectant ^9,13 données. Une autre méthode de pré-test pour analyser le comportement locomoteur est TriKinetics Drosophila activity monitor (DAM), un dispositif qui utilise plusieurs faisceaux pour détecter le mouvement de l’activité des mouches dans un mince tube^{de verre 14}. L’appareil enregistre la position en continu, ce qui représente la locomotion automatisée en calculant les croisements de faisceaux pour étudier l’activité et le rythme circadien des mouches sur une plus longue période de temps¹⁵. Bien que ces méthodes aient été largement utilisées dans l’analyse des défauts de comportement chez les mouches des fruits pour déterminer les changements dans la locomotion comportementale, elles nécessitent toujours un équipement de test spécial ou des processus d’analyse complexes, et limitent leur application dans certains modèles avec un dispositif simple et limité. Les stratégies de dépistage des animaux basées sur des groupes pour tester la drosophile adulte, telles que FlyGrAM¹¹ et le test de l’île de la drosophile ¹⁰, mettent en œuvre le recrutement social et le suivi individuel dans une zone prédéfinie. Néanmoins, la restriction sociale individuelle dans les zones défiées pourrait avoir un effet négatif sur les identifications dans les images, causée par la collision ou le chevauchement des mouches. Même si certaines méthodes open source basées sur des matériaux, telles que TRex¹⁶, MARGO¹² et FlyPi¹⁷, ont une urgence, elles peuvent accélérer le traçage des mouches avec une utilisation flexible dans les tests comportementaux. Ces approches de test sont associées à des installations d’appareils expérimentaux élaborés, à des exigences logicielles spéciales ou à des langages informatiques professionnels. Pour les larves, la mesure de la distance totale parcourue à travers le nombre de lignes de bordure de la grille par unité de temps¹⁸, ou le comptage approximatif des contractions de la paroi corporelle pour les individus manuellement¹⁹, sont les méthodes prédominantes pour évaluer leur capacité locomotrice. En raison du manque de précision de l’équipement ou des dispositifs et des méthodes d’analyse, une partie de la locomotion comportementale des larves peut échapper à la détection, ce qui rend difficile l’évaluation précise du mouvement comportemental, en particulier le mouvement fin¹⁵.

La présente méthode développée utilise l’interface de programmation d’application (API) AnimalTracker , compatible avec le programme de traitement d’images Fidji (ImageJ), pour évaluer systématiquement l’activité locomotrice des mouches adultes et larvaires en analysant leur comportement de suivi à partir de vidéos haute définition (HD). Fiji est une distribution logicielle open source ImageJ qui peut combiner des bibliothèques logicielles robustes avec de nombreux langages de script, ce qui entraîne un prototypage rapide des algorithmes de traitement d’images, ce qui le rend populaire parmi les biologistes pour ses capacités d’analyse d’images²⁰. Dans l’approche actuelle, l’intégration de Fiji dans l’API AnimalTracker est exploitée pour développer un test comportemental unique sur la drosophile avec insertion d’algorithmes personnalisés, et fournit une étape utile pour une documentation détaillée et des tutoriels afin de soutenir des capacités analytiques robustes du comportement locomoteur (Figure 1). Pour contourner la complication des identifications objectives dans les images causées par la collision ou le chevauchement des mouches, chaque arène est limitée à accueillir une seule mouche. Après avoir évalué la précision du suivi de l’approche, elle a été mise en œuvre pour tracer et quantifier les mouvements locomoteurs de la drosophile qui ont été administrés avec le médicament toxique roténone, qui est généralement utilisé pour les modèles animaux de la maladie de Parkinson, découvrant finalement une altération de la locomotion dans le traitement médicamenteux²¹. Cette méthodologie, qui utilise des logiciels libres et open source, ne nécessite pas d’instrumentation coûteuse et peut analyser avec précision et reproductibilité la locomotion comportementale de la drosophile .

Protocole

W¹¹¹⁸ mouches adultes et larves du troisième stade ont été utilisées pour la présente étude.

1. Préparation expérimentale

REMARQUE: Une arène en plein champ pour le suivi de la locomotion de la drosophile est fabriquée avec un gel de silice incolore et inodore.

1. Mélanger le réactif A et le réactif B dans un rapport de 1:10, conformément aux instructions du fabricant pour le kit de silice (voir le tableau des matériaux). Assurez-vous que le bicarbonate de sodium est ajouté au mélange en remuant jusqu’à ce que la couleur passe au blanc. Transférer le mélange dans une boîte de Petri propre et le placer dans un four à 40 °C pour le séchage pendant 48 h.
2. Réglez la caméra HD (voir Tableau des matériaux) sur un trépied, en l’ajustant de manière à ce que l’objectif de la caméra soit perpendiculaire à la surface de l’arène de silice. En ajustant la distance focale et les ouvertures de la caméra, assurez-vous que la caméra est mise au point sur la surface de la silice et que l’écran est correctement éclairé. La configuration expérimentale est illustrée à la figure 1.
3. Transférez une mouche dans l’arène en plein champ pour enregistrer une vidéo continue d’au moins 61 s.
   REMARQUE: Compte tenu de la nature léthargique des larves, un temps d’enregistrement vidéo de plus de 10 minutes est recommandé.
   1. Ouvrez la vidéo avec Fidji, faites glisser la barre de progression jusqu’à l’image initiale et approuvez tacitement. Choisissez le corps entier de la mouche à l’aide de l’outil « sélection à main levée » (Figure 2B,C).
   2. Cliquez sur l’image > réglez > luminosité et contraste pour régler la balance des blancs jusqu’à ce que la valeur de gris de la zone sélectionnée se rapproche de l’arrière-plan général (Figure 2D-F).
      REMARQUE: L’homogénéisation de l’arrière-plan de la première image permet au logiciel de distinguer l’arrière-plan sans aucun objet et de créer un contraste lorsqu’une mouche est présente, permettant ainsi au logiciel de le suivre.
4. Effectuez l’expérience entière dans un environnement d’essai réglé à 25 °C et 60 % d’humidité relative, dans un endroit calme et dépourvu d’exposition à la lumière vive.

2. Enregistrement vidéo et prétraitement

1. Après une courte période d’anesthésie utilisant 95% de dioxyde de carbone (CO₂), transférez une mouche dans l’arène ouverte et appuyez sur le bouton d’enregistrement de l’application de la caméra pour démarrer l’enregistrement vidéo.
   REMARQUE: Pour minimiser l’effet de l’anesthésique sur la locomotion, laissez les mouches récupérer pendant 10 minutes avant de commencer l’enregistrement vidéo. L’anesthésie à froid par refroidissement est également recommandée.
   1. Une fois que les mouches se sont remises de l’anesthésie, placez le plat de l’arène contenant la mouche sous la caméra et secouez rapidement la plaque d’un côté à l’autre pour vous assurer que la mouche est en mouvement lorsque l’enregistrement commence.
2. Une fois l’enregistrement terminé, appuyez sur le bouton d’arrêt pour mettre fin à l’enregistrement vidéo.
   REMARQUE: Assurez-vous que le temps d’enregistrement vidéo dépasse légèrement le temps de suivi de destination par une petite marge. De plus, pour améliorer l’efficacité expérimentale, il est possible de suivre plusieurs mouches spontanément. Cela dépend de la résolution de la caméra pour permettre un recadrage vidéo de haute qualité.
3. Convertissez les vidéos enregistrées au format AVI avec encodage MJPEG, afin qu’elles puissent être ouvertes et analysées à l’aide de Fidji. Pendant ce temps, réglez le taux d’images par seconde (fps) de la vidéo à 15 ips pour les mouches adultes et à 12 ips pour les larves.

3. Analyse vidéo

1. Ouvrez la vidéo qui a été transformée avec « utiliser la pile virtuelle » et « convertir en niveaux de gris », deux options dans la fenêtre contextuelle lors de l’ouverture de la vidéo avec Fidji (Figure 2A).
2. Créez une première image vierge, comme mentionné ci-dessus.
3. Obtenez une fenêtre de traitement à l’aide de l’outil « définir l’image active » du plugin AnimalTracker et créez une zone de suivi qui entoure l’arène dans la fenêtre vidéo d’origine à l’aide de l’outil « ovale » (Figure 3A).
4. Définissez les filtres (Figure 3A,3) et les paramètres des deux filtres (Figure 4A-G) pour la première image vierge de la fenêtre de traitement. Sélectionnez ensuite l’image suivante dans la fenêtre vidéo d’origine et choisissez la surface filtrée de la fenêtre de traitement (Figure 5A-C).
   REMARQUE: L’étape de filtrage sert à diminuer le bruit de l’image et / ou à supprimer l’arrière-plan, ce qui simplifie la séparation du premier plan de l’arrière-plan dans la binarisation des images.
5. Une fois qu’une fenêtre de traitement filtrée est sélectionnée, tournez la mouche suivie avec un profil rouge couvert dans la fenêtre de traitement à l’aide de l’outil « définir le seuil » (Figure 3A, 4, Figure 5D-E et Figure 6A).
6. Utilisez le détecteur de blob défini pour permettre à l’ordinateur de reconnaître la mouche dont le profil rouge est couvert dans la fenêtre de traitement (Figure 3A,5 et Figure 6B).
7. Définissez l’image 901 comme dernière image pour la mouche adulte, calculée par la durée d’enregistrement et les images par seconde de la vidéo (Figure 3A, 6, Figure 6C).
   REMARQUE: L’expérience suivante avec des larves a été suivie pendant 10 minutes, donc l’image 7200 est définie comme dernière image.
8. Utilisez l’outil « Afficher les objets blob » pour présenter un rectangle de suivi dans la fenêtre vidéo d’origine (Figure 3A,7 et Figure 6D,E). Ensuite, démarrez le suivi et exportez le fichier de suivi une fois la surveillance terminée (Figure 3A,8,9 et Figure 7A,B).

4. Analyse des fichiers de suivi

1. Chargez les fichiers de suivi et de zone à l’aide du plug-in Animal tracker > Tracking analyzer (Figure 8A).
2. Sélectionnez l’index souhaité à l’aide des paramètres de zone et modifiez les paramètres (Figure 8). Calculez la durée de l’intervalle d’images à l’aide de la fréquence d’images.
   REMARQUE : dans cette condition, la fréquence d’images est de 15 ips et l’intervalle d’images est d’environ 0,067 s, ce qui est le paramètre par défaut (Figure 8D).
3. Produisez les graphiques d’analyse quantitative à l’aide du tableur et de GraphPad Prism après les avoir analysés dans l’analyseur de suivi (Figure 9).

5. Analyse par base de sondage

1. Effectuez une analyse de vitesse par intervalle d’image. Analysez le fichier de suivi sans Fidji si des recherches plus détaillées sont nécessaires.
   1. Ouvrez le fichier de suivi, copiez toutes les coordonnées dans Microsoft Office Excel et divisez les cellules à l’aide de la touche espace.
      Remarque : Par exemple, une fois que le fichier a été divisé en colonnes « C » et « D », la vitesse de la drosophile par intervalle d’image est calculée par la formule SQRT((C5-C4)^2+(D5-D4)^2), qui est indiquée dans la colonne « E » (Figure 10A). Les données de la colonne « E » indiquent le nombre de pixels que la mouche a déplacés entre deux images, la première image n’étant pas prise en compte. Sélectionnez tous les résultats calculés et insérez un graphique linéaire pour afficher une vitesse de déplacement intuitive de la mouche par intervalle d’image, avec un pic sur le graphique linéaire (Figure 10B).
2. Calculez le temps d’immobilité par intervalle d’image. Une fois le fichier divisé en colonnes « C » et « D », calculez l’état d’immobilité de la drosophile par intervalle d’image en utilisant la formule IF(SQRT((C6-C5)^2+(D6-D5)^2) <20, 0, 1), qui est affichée dans la colonne « E ». (figure 10C).
   REMARQUE: Contrairement à l’analyse de vitesse, les résultats de la première image ont été définis. Les mouches qui se déplaçaient à moins de 20 pixels étaient considérées comme immobiles et enregistrées comme « 0 » dans la colonne « E ».
   1. Sélectionnez tous les résultats calculés et insérez un histogramme pour afficher visuellement le temps d’immobilité par la marge de l’ensemble du graphique à colonnes (Figure 10D).
3. Assurez-vous que l’angle de direction change.
   NOTE: L’analyse de l’angle de changement de direction représente le choix de direction des mouches. Une fois le fichier divisé en colonnes « C » et « D », l’angle de changement de direction est calculé par la formule ACOS(((SQRT((C7-C6)^2+(D7-D6)^2))^2+(SQRT((C6-C5)^2+(D6-D5)^2))^2-(SQRT((C7-C5)^2+(D7-D5)^2))^2)/(2*SQRT((C6-C5)^2+(D6-D5)^2))*( SQRT((C7-C6)^2+(D7-D6)^2)))*180/PI(), qui est présentée dans la colonne « E » (Figure 10E). Les résultats calculés indiquent l’angle entre trois coordonnées.
   1. Sélectionnez tous les résultats calculés et insérez un diagramme de dispersion pour illustrer l’angle de changement de direction du mouvement des mouches (Figure 10F).

Résultats

Dans la présente étude, les déficits locomoteurs chez les mouches adultes et les larves du troisième stade traitées à la roténone ont été examinés et comparés dans leur activité motrice à celle d’une mouche témoin nourrie avec le solvant diméthylsulfoxyde (DMSO). Il a été démontré que le traitement par roténone chez la drosophile provoque une perte de neurones dopaminergiques dans le cerveau²² et entraîne des déficits locomoteurs importants²³

Discussion

Nous avons conçu une méthode, basée sur le matériel open source AnimalTracker API compatible avec le programme de traitement d’images des Fidji, qui peut permettre aux chercheurs d’évaluer systématiquement l’activité locomotrice en suivant les mouches larvaires adultes et individuelles. AnimalTracke est un outil écrit en Java qui peut être facilement intégré dans des bases de données existantes ou d’autres outils pour faciliter l’analyse du comportement de suivi des animaux conçu ...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Animal tracker	Hungarian Brain Research Program	version: 1.7	pfficial website: http://animaltracker.elte.hu/main/downloads
Camera software	Microsoft	version: 2021.105.10.0	built-in windows 10 system
Computer	DELL	Vostro-14-5480	a comupter running win 10 system is available
Drosophila carbon dioxide anesthesia workstation	Wu han Yihong technology	#YHDFPCO2-018	official website: http://www.yhkjwh.com/
Fiji software	Fiji team	version: 1.53v	official website: https://fiji.sc/
Format factory software	Pcfreetime	version: X64 5.4.5	official website: http://www.pcfreetime.com/formatfactory/CN/index.html
Graph pad prism	GraphPad Software	version: 8.0.2	official website: https://www.graphpad-prism.cn
Hight definition camera	TTQ	Jingwang2 (HD1080P F1.6 6-60mm)	official website: http://www.ttq100.com/product_show.php?id=35
Office software	Microsoft	version: office 2019	official website: https://www.microsoftstore.com.cn/software/office
Petri dish	Bkman	110301003	size: 60 mm
Silica gel	DOW	SYLGARD 184 Silicone Elastomer Kit	Mix well according to the instructions
Sodium bicarbonate	Macklin	#144-55-8	Mix well with silica gel