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摘要

用于非鳞状非小细胞肺癌 （NS-NSCLC） 护理管理的分子生物标志物的增加促使了快速可靠的分子检测方法的发展。我们描述了使用超快速下一代测序 （NGS） 方法对 NS-NSCLC 患者进行基因组改变评估的工作流程。

摘要

在过去几年中，用于非鳞状非小细胞肺癌 （NS-NSCLC） 患者靶向治疗的分子改变数量显着增加。对于晚期或转移性NS-NSCLC患者的最佳护理，必须检测分子异常，从而可以进行靶向治疗，从而改善总生存期。然而，这些肿瘤会产生耐药机制，这些机制可能使用新疗法靶向。一些分子改变也可以调节治疗反应。NS-NSCLC的分子表征必须在短时间内完成，在不到10个工作日的时间内完成，这是国际指南所建议的。此外，用于基因组分析的组织活检的来源是多种多样的，并且随着侵入性较小的方法和方案的发展，其尺寸不断减小。因此，病理学家面临的挑战是执行有效的分子技术，同时保持高效和快速的诊断策略。在这里，我们描述了基于超快速扩增子的下一代测序 （NGS） 工作流程，用于诊断 NS-NSCLC 患者的日常实践。我们发现，该系统能够在适当的TAT中识别当前用于胸部肿瘤学精准医学的分子靶点。

引言

在过去十年中，靶向和免疫疗法的发展显著提高了非鳞状非小细胞肺癌 （NS-NSCLC） 的总生存期 （OS）1,2。在这方面，在过去几年中，治疗NS-NSCLC时需要分析的强制性基因和分子靶点的数量有所增加3,4。

目前的国际指南建议在诊断晚期 NS-NSCLC5 时检测 EGFR、ALK、ROS1、BRAF、NTRK、RET 和 MET。此外，由于新药最近在临床试验中取得了非常有希望的结果，因此不久将在许多其他基因中筛选出额外的基因组改变，特别是KRAS和HER2，以及BRAC1/BRAC2，PI3KA，NRG1和NUT 6,7,8,9。此外，不同相关基因（如 STK11、KEAP1 和 TP53）的状态可能有助于更好地预测对某些靶向治疗和/或免疫检查点抑制剂 （ICI） 的反应或耐药性10,11,12。

重要的是，必须立即报告分子改变，以确保谨慎的临床决策。缺乏肿瘤的分子特征可能导致开始非靶向治疗，例如化疗联合/不联合免疫治疗，导致次优治疗策略，因为化疗反应在具有可操作改变的患者中受到限制，例如 EGFR 突变或基因融合13。

此外，目前在新辅助和/或辅助治疗中靶向治疗/免疫疗法的发展可能导致系统地寻找，至少在早期NS-NSCLC中寻找EGFR和ALK的改变，因为ICI应该只在EGFR和ALK14的野生型肿瘤中给药。由于奥希替尼（第三代EGFR酪氨酸激酶抑制剂）可用作EGFR突变NS-NSCLC的辅助治疗15，因此现在还必须检测早期NS-NSCLC中是否存在EGFR突变。

评估不同生物标志物以预测NS-NSCLC患者对不同靶向治疗和/或免疫治疗的反应的策略正在快速发展，这使得这些生物标志物的顺序识别变得困难3,16。在这方面，下一代测序 （NGS） 现在是 NS-NSCLC 5,17 中基因改变的高通量并行评估的最佳方法。

然而，NGS 工作流程可能难以掌握，并且可能需要更长的 TAT18,19。因此，许多中心仍然采用序贯方法（免疫组化 （IHC）、荧光原位杂交 （FISH） 和/或靶向测序）。然而，在样本量小的情况下，这种策略是有限的，最重要的是，因为在NS-NSCLC20中需要测试的可操作突变数量增加。因此，允许快速评估基因改变的超快速和直接的检测方法对于最佳临床决策变得越来越重要。此外，经批准和认可的分子检测系统正成为特定靶向治疗处方的强制性要求。

在这里，我们描述了一种用于NS-NSCLC分子检测的超快速和自动化的基于扩增子的DNA/RNA NGS测定，该测定用于法国尼斯大学医院临床和实验病理学实验室（LPCE），并根据ISO 15189标准获得法国认可委员会（COFRAC）（https://www.cofrac.fr/）的认可。COFRAC 证明该实验室符合标准 ISO 15189 和 COFRAC 应用规则的要求，即在实验室执行的测序仪上对自动 NGS 分子分析中的测试/校准活动进行测试/校准。根据公认的国际标准 ISO 15189 的认证证明了实验室在规定范围内的技术能力以及该实验室中适当管理体系的正确运行。讨论了该工作流程的优点和局限性，从组织活检样本的制备到获得报告。

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研究方案

所有程序均已获得当地伦理委员会（人类研究伦理委员会，尼斯大学医院中心，Tumorothèque BB-0033-00025）的批准。获得所有患者的知情同意，使用样本和生成的数据。所有样本均来自2022年9月20日至1月31日期间在LPCE（法国尼斯）诊断为NS-NSCLC的患者，作为医疗护理的一部分。

1. 使用自动纯化仪器（API）制备FFPE DNA和RNA样品（处理时间:5小时15分钟）

  1. 在仪器上运行平面化。
    1. 打开仪器电源并使用用户名和密码登录（材料表）。通过单击 "运行"，然后单击 "添加计划"，并为运行计划命名，创建净化运行计划。
    2. 然后，选择合适的纯化试剂盒和方案，从福尔马林固定石蜡包埋 （FFPE） 样品中顺序纯化 DNA 和 RNA。纯化后进行定量分析。
    3. 从下拉列表中选择所需的洗脱体积 （50 μL），然后单击 下一步。选择要提取的样本数。
    4. 然后选择每个样本，单击 "编辑"，输入 "样本 ID"，然后单击" 保存"。
  2. 使用 GPI 制备 FFPE DNA 和 RNA 样品
    1. 制备FFPE组织样品（4个10μm的切片，切片机）或直接在FFPE块上进行宏观切割。将每个FFPE组织样品放入分离和鉴定的FFPE样品处理管（材料表）中。
    2. 以2000× g 离心1分钟以收集管底部的组织。
    3. 向每个FFPE样品处理管中加入由核酸纯化试剂盒制备的蛋白酶消化预混液，并在60°C下孵育至少60分钟（材料表）。将样品在90°C孵育60分钟。
    4. 孵育后，让样品在室温（RT）下冷却5分钟。
    5. 对于每个FFPE样品处理管，提起内管，向左转动将其锁定，然后以2000× g 离心样品10分钟。
    6. 右转解锁内胎，将它们与外胎分开，然后丢弃。将外管中的样品保持在冰上，直到加载到 API 上。
    7. 制备 DNase 消化预混液并将其加载到预填充的 FFPE DNA 和 RNA 纯化板 2 中。然后，将制备的样品加载到 FFPE DNA 和 RNA 纯化板 1（材料表）中。
  3. 在 API 上启动纯化运行。
    1. 在"API"屏幕上，单击" 运行"，选择 "运行计划"，然后单击 "下一步"。
    2. 按照屏幕上的指示，将纯化运行所需的耗材和试剂加载到 API（材料表）。
    3. 加载完所有试剂后，单击 下一步。关闭 API 门，然后单击 启动。
    4. 运行结束时，单击触摸屏上的 "卸载" ，并立即取出含有纯化样品DNA和RNA的48孔核酸存档板。
    5. 导出定量结果。密封板并将纯化的样品储存在-80°C。 将96孔板转移到测序仪进行分析。
  4. 创建示例并创建运行。
    1. 打开并登录软件，然后在菜单栏中选择 "示例" ，然后单击 "创建示例"。
    2. 输入样本的名称、性别和肿瘤细胞百分比，并根据需要填写必填字段和可选字段。
    3. 保存详细信息（肿瘤细胞的性别和百分比对于分析拷贝数变异 [CNV] 很重要）。
    4. 在菜单栏中选择 Runs 和 Nucleic Acid to Result 。
    5. 在 "设置 "步骤中输入运行名称。单击 "下一步"。
    6. 在 "检测 "步骤中选择检测。单击 "下一步"。
    7. 在 "样品" 步骤中选择样品以与检测一起运行。
    8. 然后，在 "所选检测 "窗格中，单击 "分配"。单击 "下一步"。
    9. 查看样品输入板上的样品位置。单击 "下一步"。
    10. 查看运行计划摘要，然后查看" 保存并打印" 或" 保存"。

2. 测序仪上的自动NGS（处理时间:30分钟）

  1. 装入样品板。
    注:最佳核酸浓度为 0.5 ng/μL。经验证的核酸浓度范围为 0.33-1 ng/μL。对于 DNA 和 RNA，在实验室中验证了 1 ng/μL 浓度。
    1. 测序仪需要 20 μL 总体积。确保有足够的体积用于样品加载。
    2. 将阳性对照（DNA 和 RNA）和 NTC（DNA 和 RNA）添加到纯化仪器的第一阶段，无需提取。对每次运行使用 DNA 和 RNA 对照来验证运行并验证使用的批次。在 API 运行结束时将 DNA 和 RNA 对照添加到板中。
  2. 加载音序器并开始运行。
    1. 从冰箱或冰柜的盒子中取出所有试剂，并在室温下解冻至少30分钟（材料表），最多12小时。
    2. 在实验室中，在现场培训期间，应按照供应商的建议始终打开测序仪。登录到系统。
    3. 用粘合剂PCR板箔（材料表）密封板后，从包含样品的纯化仪器中加载板。
    4. 在甲板上安装所有耗材。定序器提供分步说明，将每个必需的耗材加载到突出显示的位置（材料表）。
    5. 检查 Strip 2-HD 的管 3 上是否有沉淀。 如果需要，轻弹管或轻轻涡旋管以溶解沉淀物。
    6. 条带 1 和条带 3 包含磁珠。这一步非常关键:确保珠子被重新悬浮。管子的上部不应有珠子。
    7. 将条带倒置并倒置 3-4 次以取出珠子。握住条带的一端，条带密封件朝上。然后，使用快速的离心臂运动迅速向下摆动条带，然后用手腕猛烈一弹来完成。
    8. 以300× g 离心15秒。如果需要，重复上述步骤。用适配器和试纸夹离心试纸，以尽量减少与试纸上部球残留物相关的随机故障。
    9. 关闭系统，然后单击 下一步。安装测序试剂舱门（材料表）。关门。排序器自动开始运行。
  3. 清洗
    1. 若要在运行后进行清理，请在运行完成后单击 "下一步"。
    2. 门陆续打开。按照屏幕上的说明清空废物并取出所有耗材。单击 "下一步"。
    3. 完成后关闭甲板，单击 下一步。开始 2 分钟的紫外线清洁。排序器已准备好开始新的运行。

3. 使用集成软件分析结果（患者分析时间[样本 ADN 和 ARN]:15 分钟）

注意:该技术已获得法国认证委员会 （COFRAC） ISO 15189 （https://www.cofrac.fr/） 的认可

  1. 数据和结果
    1. 在 "结果" 菜单中选择运行结果或示例结果。在 "结果/运行结果" 屏幕中，将列出所有运行。
    2. 通过在列标题中进行筛选来搜索结果列表。
    3. 单击 "结果" ，然后单击 "示例结果"。然后，单击"样品名称"列中目标样品的名称，以查看唯一样品的测序结果。
    4. 单击屏幕左上角 的列 ，或从表格中取消选择列。
  2. 查看 QC 结果并查看扩增子覆盖率。
    1. 单击"结果"屏幕中的"QC"选项卡。
    2. 对于 DNA，确保中位绝对成对差异 （MAPAD） 介于 0 和 0.5 之间，以验证拷贝数变异 （CNV） 分析。映射的读取数必须大于 150 万。
    3. 对于 RNA，检查映射的读数是否在 150,000 到 400,000 之间。低于此值，存在漏报的风险，除此之外，还有误报的风险。
    4. 单击示例名称以打开 "关键发现 "选项卡。
    5. 滚动到扩增子 覆盖图。
    6. 查看覆盖率图表。定义扩增子覆盖率的最小阈值，因为供应商不提供该阈值。若要定义范围和阈值，请混合对照和野生型 （WT） 样本。然后，观察一个或多个选定突变的扩增子覆盖率的最小值。
  3. 查看变体结果。
    1. 若要以表格格式导出数据，请单击屏幕右上角的 "导出 "。
    2. 要查看单核苷变异/插入-缺失变异 （SNV/INDEL） 结果，请单击" 变体 "选项卡，然后单击" SNV/插入缺失"。单击 "编辑过滤器 "，然后选择 "无过滤器"。
      注意:根据 INCA（法国国家癌症研究所）小组 （https://www.e-cancer.fr/Professionnels-de-sante/Les-therapies-ciblees/Les-plateformes-de-genetique-moleculaire-des-cancers/Le-programme-d-assurance-qualite-des-plateformes） 的建议，敏感性阈值已定义为 5%。
    3. 查看 融合 结果并查看 RNA 外显子变异:点按 "变异 "标签，然后点按 "融合"。
    4. 在右上角，单击 可视化 和 RNA 外显子变体，然后查看 RNA 外显子变体 图。
    5. 使用该试剂盒，可以检测 EGFR、MET 和 AR 基因的外显子跳跃。单击可视化;它更容易分析。
    6. 查看 RNA 外显子瓦片融合不平衡:点按 "变体 "选项卡，然后点按 "融合"。
    7. 在右上角，单击 可视化 和 RNA 外显子瓦片融合失衡，然后查看 RNA 外显子瓦片融合失衡 图。不平衡融合是已知伴侣与专家组未涵盖的伴侣之间的融合。
    8. 查看 CNV 结果:单击"变体"选项卡中的"CNV"以显示数据。
      注意:有必要通过在制备样本期间告知性别和样本肿瘤细胞百分比的样本来警惕CNV的结果。 AR 基因仅由 X 染色体携带。如果未指定性别，男性可能会遇到损失，导致男性患者的假阳性结果。
  4. 查看插件结果。
    1. 查看 覆盖率分析 插件结果:点击右上角，选择下载文件。
    2. 覆盖率分析插件会生成覆盖率分析报告。
    3. 查看分子 覆盖率分析 插件结果:单击右上角，选择下载文件。该分析验证是否覆盖了所有扩增子，并确认了软件提供的拷贝数变异 （CNV） 结果。
  5. 查看检测指标和运行报告
    1. 单击"运行摘要"中的"运行报告"选项卡。
    2. 若要查看 "运行报告"，请在下拉菜单中选择 "选择示例 "选项。
    3. 检测指标和运行报告:在屏幕顶部找到测序指标，然后在 "运行样品 "表中找到特定于样品的指标。
      注意:客户支持存档 （CSA） 文件中的信息可以帮助对结果进行故障排除，但无法直接分析它们。CSA 文件汇总了整个运行数据的数据，并在运行失败时突出显示了问题的原因。
    4. 下载运行报告:单击 "报告 "选项卡。
    5. 单击 "下载报告 "以下载 PDF 格式的运行报告摘要。
  6. 生成变体报告。
    1. 在"设置"步骤中启用"生成报告"，以在运行数据分析期间为每个样本自动生成变体报告。
    2. 为样本生成变体报告后，系统会在两个位置提供报告:首先，在 "结果/样品结果 "屏幕中提供链接。单击链接下载 PDF。
    3. 其次，转到"报告"选项卡中的"变体报告"窗格，然后单击"下载报告"按钮。以电子方式或手动方式签署变体报告。
      注意:电子签名报告在"样品结果"屏幕中的样品名称后面有（签字）。

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结果

使用我们最近的出版物21 中详细描述的此处介绍的程序，我们开发了一种最佳工作流程，用于评估分子改变，作为常规临床实践中的反射测试，用于使用基于超快速扩增子的下一代测序方法诊断 NS-NSCLC 患者。该方法的分子工作流程如 图1所示。该组合中包含的基因列表如 补充图1所示。

对259例NS-NSCLC患者进行了分子分析。?...

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讨论

开发一种基于超快速扩增子的 NGS 方法作为反射测试，用于诊断任何阶段的 NS-NSLC 的分子改变评估，是检测 NS-NSCLC中所有指南推荐和新兴生物标志物的最佳选择5,22,23。虽然序贯方法（IHC、PCR、FISH）仅关注特定基因并可能导致组织材料耗尽，但这种 NGS 工作流程允许对 50 个基因的状态进行特异性和灵敏的评估，包括突变、融合?...

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披露声明

Christophe Bontoux 参加付费演讲者活动，并从赛默飞世尔科技获得福利。Paul Hofman 参加付费演讲者活动，并从赛默飞世尔科技获得福利和资金。

致谢

我们感谢赛默飞世尔科技为我们提供了使用其设备和材料的可能性。

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材料

NameCompanyCatalog NumberComments
96 well hard shell plate clearThermo Fisher Scientific (Waltham, Massachusetts, USA)4483354
Adhesive PCR Plate FoilThermo Fisher Scientific (Waltham, Massachusetts, USA)AB0626
AutoLys M tube Thermo Fisher Scientific (Waltham, Massachusetts, USA)A38738FFPE sample processing tubes
Genexus Barcodes 1-32 HDThermo Fisher Scientific (Waltham, Massachusetts, USA)A40261
Genexus GX5 Chip and Genexus CouplerThermo Fisher Scientific (Waltham, Massachusetts, USA)A40269
Genexus Pipette TipsThermo Fisher Scientific (Waltham, Massachusetts, USA)A40266
Genexus Purification InstrumentThermo Fisher Scientific (Waltham, Massachusetts, USA)A48148Automated purification instrument (API)
Genexus Sequencing KitThermo Fisher Scientific (Waltham, Massachusetts, USA)A40271
Genexus Templating Strips 3-GX5 and 4Thermo Fisher Scientific (Waltham, Massachusetts, USA)A40263
Genexus Integrated SequencerThermo Fisher Scientific (Waltham, Massachusetts, USA)A45727
Ion Torrent  Genexus FFPE DNA/RNA Purification Combo KitThermo Fisher Scientific (Waltham, Massachusetts, USA)A45539
Oncomine  Precision Assay GX (OPA) Panel (included Strips 1 and 2-HD)Thermo Fisher Scientific (Waltham, Massachusetts, USA)A46291

参考文献

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