基于扩增子的超快速二代测序在非鳞状非小细胞肺癌中的应用

摘要

用于非鳞状非小细胞肺癌 （NS-NSCLC） 护理管理的分子生物标志物的增加促使了快速可靠的分子检测方法的发展。我们描述了使用超快速下一代测序 （NGS） 方法对 NS-NSCLC 患者进行基因组改变评估的工作流程。

摘要

在过去几年中，用于非鳞状非小细胞肺癌 （NS-NSCLC） 患者靶向治疗的分子改变数量显着增加。对于晚期或转移性NS-NSCLC患者的最佳护理，必须检测分子异常，从而可以进行靶向治疗，从而改善总生存期。然而，这些肿瘤会产生耐药机制，这些机制可能使用新疗法靶向。一些分子改变也可以调节治疗反应。NS-NSCLC的分子表征必须在短时间内完成，在不到10个工作日的时间内完成，这是国际指南所建议的。此外，用于基因组分析的组织活检的来源是多种多样的，并且随着侵入性较小的方法和方案的发展，其尺寸不断减小。因此，病理学家面临的挑战是执行有效的分子技术，同时保持高效和快速的诊断策略。在这里，我们描述了基于超快速扩增子的下一代测序 （NGS） 工作流程，用于诊断 NS-NSCLC 患者的日常实践。我们发现，该系统能够在适当的TAT中识别当前用于胸部肿瘤学精准医学的分子靶点。

引言

在过去十年中，靶向和免疫疗法的发展显著提高了非鳞状非小细胞肺癌 （NS-NSCLC） 的总生存期 （OS）^1,2。在这方面，在过去几年中，治疗NS-NSCLC时需要分析的强制性基因和分子靶点的数量有所增加^3,4。

目前的国际指南建议在诊断晚期 NS-NSCLC⁵ 时检测 EGFR、ALK、ROS1、BRAF、NTRK、RET 和 MET。此外，由于新药最近在临床试验中取得了非常有希望的结果，因此不久将在许多其他基因中筛选出额外的基因组改变，特别是KRAS和HER2，以及BRAC1/BRAC2，PI3KA，NRG1和NUT 6,7,8,9。

研究方案

所有程序均已获得当地伦理委员会（人类研究伦理委员会，尼斯大学医院中心，Tumorothèque BB-0033-00025）的批准。获得所有患者的知情同意，使用样本和生成的数据。所有样本均来自2022年9月20日至1月31日期间在LPCE（法国尼斯）诊断为NS-NSCLC的患者，作为医疗护理的一部分。

1. 使用自动纯化仪器（API）制备FFPE DNA和RNA样品（处理时间：5小时15分钟）

1. 在仪器上运行平面化。
   1. 打开仪器电源并使用用户名和密码登录（材料表）。通过单击 “运行”，然后单击 “添加计划”，并为运行计划命名，创建净化运行计划。
   2. 然后，选择合适的纯化试剂盒和方案，从福尔马林固定石蜡包埋 （FFPE） 样品中顺序纯化 DNA 和 RNA。纯化后进行定量分析。
   3. 从下拉列表中选择所需的洗脱体积 （50 μL），然后单击 下一步。选择要提取的样本数。
   4. 然后选择每个样本，单击 “编辑”，输入 “样本 ID”，然后单击“ 保存”。
2. 使用 GPI 制备 FFPE DNA....

讨论

开发一种基于超快速扩增子的 NGS 方法作为反射测试，用于诊断任何阶段的 NS-NSLC 的分子改变评估，是检测 NS-NSCLC^中所有指南推荐和新兴生物标志物的最佳选择^5,22,23。虽然序贯方法（IHC、PCR、FISH）仅关注特定基因并可能导致组织材料耗尽，但这种 NGS 工作流程允许对 50 个基因的状态进行特异性和灵敏的评估，包括突变、融合?.......

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
96 well hard shell plate clear	Thermo Fisher Scientific (Waltham, Massachusetts, USA)	4483354
Adhesive PCR Plate Foil	Thermo Fisher Scientific (Waltham, Massachusetts, USA)	AB0626
AutoLys M tube	Thermo Fisher Scientific (Waltham, Massachusetts, USA)	A38738	FFPE sample processing tubes
Genexus Barcodes 1-32 HD	Thermo Fisher Scientific (Waltham, Massachusetts, USA)	A40261
Genexus GX5 Chip and Genexus Coupler	Thermo Fisher Scientific (Waltham, Massachusetts, USA)	A40269
Genexus Pipette Tips	Thermo Fisher Scientific (Waltham, Massachusetts, USA)	A40266
Genexus Purification Instrument	Thermo Fisher Scientific (Waltham, Massachusetts, USA)	A48148	Automated purification instrument (API)
Genexus Sequencing Kit	Thermo Fisher Scientific (Waltham, Massachusetts, USA)	A40271
Genexus Templating Strips 3-GX5 and 4	Thermo Fisher Scientific (Waltham, Massachusetts, USA)	A40263
Genexus Integrated Sequencer	Thermo Fisher Scientific (Waltham, Massachusetts, USA)	A45727
Ion Torrent  Genexus FFPE DNA/RNA Purification Combo Kit	Thermo Fisher Scientific (Waltham, Massachusetts, USA)	A45539
Oncomine  Precision Assay GX (OPA) Panel (included Strips 1 and 2-HD)	Thermo Fisher Scientific (Waltham, Massachusetts, USA)	A46291