Sequenziamento ultraveloce di nuova generazione basato su ampliconi nel carcinoma polmonare non squamoso non a piccole cellule

Riepilogo

L'aumento dei biomarcatori molecolari da testare per la gestione della cura del carcinoma polmonare non squamoso non a piccole cellule (NS-NSCLC) ha spinto lo sviluppo di metodi di rilevamento molecolare rapidi e affidabili. Descriviamo un flusso di lavoro per la valutazione dell'alterazione genomica per i pazienti NS-NSCLC utilizzando un approccio di sequenziamento di nuova generazione (NGS) ultraveloce.

Abstract

Il numero di alterazioni molecolari da testare per la terapia mirata dei pazienti con carcinoma polmonare non squamoso non a piccole cellule (NS-NSCLC) è aumentato significativamente negli ultimi anni. L'individuazione di anomalie molecolari è obbligatoria per la cura ottimale dei pazienti NS-NSCLC avanzati o metastatici, consentendo la somministrazione di terapie mirate con un miglioramento della sopravvivenza globale. Tuttavia, questi tumori sviluppano meccanismi di resistenza che sono potenzialmente bersaglio utilizzando nuove terapie. Alcune alterazioni molecolari possono anche modulare la risposta al trattamento. La caratterizzazione molecolare di NS-NSCLC deve essere eseguita in un breve tempo di risposta (TAT), in meno di 10 giorni lavorativi, come raccomandato dalle linee guida internazionali. Inoltre, l'origine delle biopsie tissutali per l'analisi genomica è diversa e le loro dimensioni diminuiscono continuamente con lo sviluppo di metodi e protocolli meno invasivi. Di conseguenza, i patologi sono chiamati a eseguire tecniche molecolari efficaci mantenendo una strategia di diagnosi efficiente e rapida. In questo articolo, descriviamo il flusso di lavoro ultraveloce di sequenziamento di nuova generazione (NGS) basato su ampliconi utilizzato nella pratica di routine quotidiana per la diagnosi dei pazienti con NS-NSCLC. Abbiamo dimostrato che questo sistema è in grado di identificare gli attuali bersagli molecolari utilizzati in medicina di precisione in oncologia toracica in un TAT appropriato.

Introduzione

Nell'ultimo decennio, lo sviluppo di terapie mirate e immunoterapeutiche ha aumentato significativamente la sopravvivenza globale (OS) del carcinoma polmonare non a piccole cellule non squamoso (NS-NSCLC)^1,2. A questo proposito, il numero di geni obbligatori e bersagli molecolari da analizzare nel trattamento di NS-NSCLC è aumentato negli ultimi anni ^3,4.

Le attuali linee guida internazionali raccomandano di testare EGFR, ALK, ROS1, BRAF, NTRK, RET, e MET alla diagnosi di NS-NSCLC⁵ avanzato. Inoltre, poiché nuovi farmaci hanno recentemente dato risultati molto promettenti negli studi clinici, ulteriori alterazioni genomiche saranno presto sottoposte a screening in un certo numero di geni aggiuntivi, in particolare KRAS e HER2, insieme a BRAC1/BRAC2, PI3KA, NRG1 e NUT 6,7,8,9. Inoltre, lo stato di diversi geni associati, come STK11, KEAP1 e TP53 può essere di grande interesse per una migliore previsione della risposta o della resistenza ad alcune terapie mirate e/o inibitori del checkpoint immunitario (ICI)10,11,12.

È importante sottolineare che le alterazioni molecolari devono essere segnalate senza ritardi significativi per garantire un attento processo decisionale clinico. L'assenza di caratterizzazione molecolare di un tumore può portare all'inizio di terapie non mirate come la chemioterapia con/senza immunoterapia, portando a una strategia di trattamento non ottimale, poiché la risposta alla chemioterapia è limitata nei pazienti con alterazioni perseguibili, come mutazioni di EGFR o fusioni geniche¹³.

Inoltre, l'attuale sviluppo di terapie/immunoterapie mirate in contesti neoadiuvanti e/o adiuvanti potrebbe portare alla ricerca sistematica, almeno, di alterazioni di EGFR e ALK in NS-NSCLC in fase iniziale, poiché gli ICI dovrebbero essere somministrati solo nei tumori wild-type per EGFR e ALK¹⁴. Ora è anche obbligatorio testare la presenza di mutazioni di EGFR nel NS-NSCLC in fase iniziale, poiché osimertinib (un inibitore tirosin-chinasico di terza generazione di EGFR) può essere utilizzato come terapia adiuvante nel NS-NSCLC¹⁵ con mutazione di EGFR.

La strategia per la valutazione dei diversi biomarcatori nel predire la risposta a diverse terapie mirate e/o immunoterapie nei pazienti NS-NSCLC si sta muovendo rapidamente, il che rende l'identificazione di questi biomarcatori sequenzialmente difficile ^3,16. A questo proposito, il Next-Generation Sequencing (NGS) è ora l'approccio ottimale per la valutazione parallela ad alto rendimento delle alterazioni geniche in NS-NSCLC ^5,17.

Tuttavia, il flusso di lavoro NGS può essere difficile da padroneggiare e può portare a TAT^18,19 più lunghi. Pertanto, molti centri eseguono ancora approcci sequenziali (immunoistochimica (IHC), ibridazione fluorescente in situ (FISH) e/o sequenziamento mirato). Tuttavia, questa strategia è limitata in caso di piccole dimensioni del campione e, soprattutto, a causa dell'aumento del numero di mutazioni utilizzabili che devono essere testate in NS-NSCLC²⁰. Pertanto, i metodi di analisi ultrarapidi e semplici che consentono la valutazione rapida delle alterazioni genetiche sono diventati sempre più importanti per un processo decisionale clinico ottimale. Inoltre, i sistemi approvati e accreditati per i test molecolari stanno diventando obbligatori per la prescrizione di specifiche terapie mirate.

In questo articolo, descriviamo un test NGS basato su ampliconi ultraveloce e automatizzato per l'analisi molecolare di NS-NSCLC che viene utilizzato nel Laboratorio di Patologia Clinica e Sperimentale (LPCE), Ospedale Universitario di Nizza, Francia ed è accreditato secondo la norma ISO 15189 dal Comitato di Accreditamento Francese (COFRAC) (https://www.cofrac.fr/). Il COFRAC certifica che il laboratorio soddisfa i requisiti della norma ISO 15189 e delle norme di applicazione COFRAC per le attività di prova/taratura in analisi molecolare in NGS automatizzato su sequenziatore con il pannello eseguito dal laboratorio. L'accreditamento secondo lo standard internazionale riconosciuto ISO 15189 dimostra la competenza tecnica del laboratorio per un ambito definito e il corretto funzionamento di un sistema di gestione appropriato in questo laboratorio. Vengono discussi i vantaggi e i limiti di questo flusso di lavoro, a partire dalla preparazione dei campioni di biopsia tissutale fino all'ottenimento del referto.

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Protocollo

Tutte le procedure sono state approvate dal comitato etico locale (Comitato etico per la ricerca umana, Centre Hospitalier Universitaire de Nice, Tumorothèque BB-0033-00025). È stato ottenuto il consenso informato da parte di tutti i pazienti per l'utilizzo di campioni e dati generati. Tutti i campioni sono stati prelevati da pazienti con diagnosi di NS-NSCLC in LPCE (Nizza, Francia) tra il 20 settembre e il 31 gennaio 2022 nell'ambito delle cure mediche.

1. Preparazione di campioni di DNA e RNA FFPE utilizzando uno strumento di purificazione automatizzato (API) (Tempo di elaborazione: 5 h 15 min)

1. Eseguire la pianificazione sullo strumento.
   1. Accendere lo strumento e accedere con il nome utente e la password (Tabella dei materiali). Creare un piano di esecuzione di purificazione facendo clic su Esegui, quindi su Aggiungi piano e assegnando un nome al piano di esecuzione.
   2. Quindi, selezionare il kit di purificazione e il protocollo appropriati per la purificazione sequenziale di DNA e RNA da campioni fissati in formalina e inclusi in paraffina (FFPE). Abilita la quantificazione dopo la purificazione.
   3. Selezionare il volume di eluizione desiderato (50 μL) dall'elenco a discesa, quindi fare clic su Avanti. Selezionare il numero di campioni che verranno estratti.
   4. Selezionare quindi ogni campione, fare clic su Modifica, immettere ID campione e quindi fare clic su Salva.
2. Preparare campioni di DNA e RNA FFPE utilizzando GPI
   1. Preparare campioni di tessuto FFPE (4 sezioni di taglio da 10 μm con un microtomo) o eseguire la macrodissezione direttamente sui blocchi FFPE. Collocare ogni campione di tessuto FFPE in provette separate e identificate per la lavorazione dei campioni FFPE (Tabella dei materiali).
   2. Centrifugare a 2000 x g per 1 minuto per raccogliere il tessuto sul fondo delle provette.
   3. Aggiungere a ciascuna provetta per il trattamento dei campioni FFPE una master mix di proteasi preparata da un kit di purificazione degli acidi nucleici e incubare a 60 °C per almeno 60 minuti (Tabella dei materiali). Incubare i campioni a 90 °C per 60 min.
   4. Dopo l'incubazione, lasciare raffreddare i campioni per 5 minuti a temperatura ambiente (RT).
   5. Per ogni provetta di elaborazione del campione FFPE, sollevare la camera d'aria, bloccarla ruotandola a sinistra, quindi centrifugare i campioni a 2000 x g per 10 minuti.
   6. Sbloccare le camere d'aria girando a destra, separarle dalle camere d'aria esterne e gettarle. Tenere i campioni nelle provette esterne sul ghiaccio fino al caricamento sull'API.
   7. Preparare una miscela master per la digestione della DNasi e caricarla nella piastra di purificazione del DNA e dell'RNA FFPE preriempita 2. Quindi, caricare i campioni preparati nella piastra di purificazione del DNA e dell'RNA FFPE 1 (Tabella dei materiali).
3. Avviare l'esecuzione della purificazione sull'API.
   1. Nella schermata API, fai clic su Esegui, seleziona il piano di esecuzione, quindi fai clic su Avanti.
   2. Seguire le indicazioni sullo schermo per caricare l'API con i materiali di consumo e i reagenti necessari per il ciclo di purificazione (Tabella dei materiali).
   3. Una volta caricati tutti i reagenti, fare clic su Avanti. Chiudi lo sportello dell'API e fai clic su Avvia.
   4. Alla fine della corsa, fare clic su « scarica » sul touchscreen e rimuovere immediatamente la piastra di archiviazione dell'acido nucleico a 48 pozzetti contenente il DNA e l'RNA del campione purificati.
   5. Esportare i risultati della quantificazione. Sigillare la piastra e conservare i campioni purificati a -80 °C. Trasferire la piastra a 96 pozzetti sul sequenziatore da analizzare.
4. Creare un esempio e creare un'esecuzione.
   1. Apri e accedi al software, quindi scegli nella barra dei menu Esempi e fai clic su Crea campione.
   2. Immettere il nome, il sesso e la percentuale di cellule tumorali del campione e, se necessario, compilare i campi obbligatori e facoltativi.
   3. Salvare i dettagli (il sesso e la percentuale di cellule tumorali sono importanti per l'analisi delle varianti del numero di copie [CNV]).
   4. Scegliere Esecuzioni e Acido nucleico per il risultato nella barra dei menu.
   5. Immettere il nome dell'esecuzione nel passaggio di installazione . Fare clic su Next (Avanti).
   6. Selezionare il saggio nel passaggio Saggi . Fare clic su Next (Avanti).
   7. Selezionare i campioni nel passaggio Campioni da eseguire con il saggio.
   8. Quindi, nel riquadro Saggi selezionati , fare clic su Assegna. Fare clic su Next (Avanti).
   9. Esaminare le posizioni del campione sulla piastra di ingresso del campione. Fare clic su Next (Avanti).
   10. Esaminare il riepilogo del piano di esecuzione, quindi Salva e stampa o Salva.

2. NGS automatizzato sul sequenziatore (tempo di elaborazione: 30 min)

1. Caricare la piastra del campione.
   NOTA: La concentrazione ottimale di acido nucleico è di 0,5 ng/μL. L'intervallo di concentrazione di acidi nucleici convalidato è 0,33-1 ng/μL. Per il DNA e l'RNA, la concentrazione di 1 ng/μL è stata convalidata in laboratorio.
   1. Il sequenziatore richiede un volume totale di 20 μL. Assicurarsi che vi sia un volume sufficiente per il caricamento del campione.
   2. Aggiungere i controlli positivi (DNA e RNA) e NTC (DNA e RNA) al 1° stadio dello strumento di purificazione senza essere estratto. Utilizzare i controlli DNA e RNA per ogni esecuzione per convalidare l'esecuzione e convalidare i batch utilizzati. Aggiungere i controlli del DNA e dell'RNA alla piastra alla fine dell'esecuzione dell'API.
2. Caricare il sequencer e avviare un'esecuzione.
   1. Rimuovere tutti i reagenti dalle loro scatole in frigorifero o congelatore e scongelare a RT per un periodo minimo di 30 minuti (Tabella dei materiali) e un massimo di 12 ore.
   2. In laboratorio, tenere il sequenziatore sempre acceso seguendo i consigli dati dal fornitore durante la formazione in loco. Accedere al sistema.
   3. Caricare la piastra dallo strumento di purificazione, che contiene i campioni, dopo aver sigillato la piastra con un foglio di pellicola adesiva per piastre PCR (Tabella dei materiali).
   4. Installare tutti i materiali di consumo nel deck. Il sequencer fornisce istruzioni passo-passo per caricare ogni materiale di consumo richiesto in una posizione evidenziata (Tabella dei materiali).
   5. Verificare che non vi siano precipitazioni sulla provetta 3 della Strip 2-HD. Muovere la provetta o far vorticare delicatamente la striscia per sciogliere il precipitato, se necessario.
   6. La striscia 1 e la striscia 3 contengono perline magnetiche. Questo passaggio è molto critico: assicurarsi che le perline siano risospese. Non dovrebbero essere rimaste perline nella parte superiore del tubo.
   7. Capovolgere la striscia e tornare indietro 3-4 volte per rimuovere le perline. Tenere la striscia a un'estremità con la guarnizione della striscia orientata verso l'alto. Successivamente, fai oscillare rapidamente la striscia verso il basso con un rapido movimento centrifugo del braccio e termina con un forte movimento del polso.
   8. Centrifugare a 300 x g per 15 s. Ripetere l'operazione se necessario. Centrifugare le strisce con adattatori e portastrisce per ridurre al minimo i guasti osservati in modo casuale in relazione a residui di sfere nella parte superiore delle strisce.
   9. Chiudere il sistema e fare clic su Next (Avanti). Installare gli sportelli dell'alloggiamento dei reagenti per il sequenziamento (Tabella dei materiali). Chiudere la porta. Il sequencer avvia automaticamente l'esecuzione.
3. Pulitura
   1. Per la pulizia dopo l'esecuzione, al termine dell'esecuzione fare clic su Avanti.
   2. La porta si apre in successione. Seguire le istruzioni sullo schermo per svuotare i rifiuti e rimuovere tutti i materiali di consumo. Fare clic su Next (Avanti).
   3. Al termine, chiudere il mazzo, fare clic su Avanti. Inizia una pulizia UV di 2 minuti. Il sequencer è pronto per iniziare una nuova esecuzione.

3. Analisi dei risultati tramite il software integrato (Tempo di analisi per paziente [campioni ADN e ARN]: 15 min)

NOTA: La tecnica è accreditata dal Comitato di Accreditamento Francese (COFRAC) ISO 15189 (https://www.cofrac.fr/)

1. Dati e risultati
   1. Selezionare un risultato di esecuzione o un risultato di esempio nel menu Risultati . Nella schermata Risultati/Risultati esecuzione , vengono elencate tutte le esecuzioni.
   2. Eseguire una ricerca nell'elenco dei risultati filtrando in base all'intestazione di una colonna.
   3. Fare clic su Risultati , quindi su Risultati di esempio. Quindi, fare clic sul nome del campione di interesse nella colonna del nome del campione per visualizzare i risultati della sequenziazione per un campione univoco.
   4. Fai clic su Colonne nell'angolo in alto a sinistra dello schermo o deseleziona le colonne dalla tabella.
2. Visualizzare i risultati del controllo qualità e visualizzare la copertura dell'amplicone.
   1. Fare clic sulla scheda QC nella schermata Risultati .
   2. Per il DNA, assicurarsi che le differenze mediane assolute a coppie (MAPD) siano comprese tra 0 e 0,5 per convalidare l'analisi delle varianti del numero di copie (CNV). Le letture mappate devono essere maggiori di 1,5 milioni.
   3. Per l'RNA, controlla se le letture mappate sono comprese tra 150.000 e 400.000. Al di sotto di questo, c'è il rischio di falsi negativi e, oltre a questo, c'è il rischio di falsi positivi.
   4. Fare clic sul nome di un esempio per aprire la scheda Risultati chiave .
   5. Scorri fino ai grafici di copertura dell'amplicone.
   6. Esamina i grafici di copertura. Definire la soglia minima per la copertura dell'amplicone, in quanto il fornitore non la fornisce. Per definire un intervallo e una soglia, combinare un campione di controllo e un campione di tipo selvaggio (WT). Quindi, osservare il valore più piccolo della copertura dell'amplicone per una o più mutazioni selezionate.
3. Visualizzare i risultati delle varianti.
   1. Per esportare i dati in formato tabulare, fare clic su Esporta nell'angolo in alto a destra dello schermo.
   2. Per visualizzare il risultato della variante a singolo nucleotide/variante di inserzione-delezione (SNV/INDEL), fare clic sulla scheda Varianti , quindi fare clic su SNV/Indel. Fare clic su Modifica filtri e selezionare Nessun filtro.
      NOTA: La soglia di sensibilità è stata definita al 5% secondo le raccomandazioni del gruppo INCA (Istituto Nazionale Francese dei Tumori (https://www.e-cancer.fr/Professionnels-de-sante/Les-therapies-ciblees/Les-plateformes-de-genetique-moleculaire-des-cancers/Le-programme-d-assurance-qualite-des-plateformes).
   3. Visualizzare i risultati di Fusion e visualizzare le varianti di esoni dell'RNA: fai clic sulla scheda Varianti , quindi fai clic su Fusioni.
   4. In alto a destra, fai clic su Visualizzazione e variante dell'esone dell'RNA, quindi esamina il grafico delle varianti dell'esone dell'RNA .
   5. Con questo kit è possibile rilevare lo skipping esonele dei geni EGFR, MET e AR . Fare clic su Visualizzazione; è più facile da analizzare.
   6. Visualizzare lo squilibrio di fusione delle tessere dell'esone dell'RNA: fai clic sulla scheda Varianti , quindi fai clic su Fusioni.
   7. In alto a destra, fai clic su Visualizzazione e Squilibrio di fusione delle piastrelle dell'esone dell'RNA, quindi esamina i grafici dello squilibrio della fusione delle piastrelle dell'esone dell'RNA . Una fusione di squilibrio è una fusione tra un partner noto e un partner che non è coperto dal pannello.
   8. Visualizzare i risultati CNV: fai clic su CNV nella scheda Varianti per visualizzare i dati.
      NOTA: È necessario essere vigili con i risultati della CNV informando durante la preparazione dei campioni del sesso e della percentuale di cellule tumorali del campione. Il gene AR è trasportato solo dal cromosoma X . Se il sesso non è specificato, il sesso maschile potrebbe subire perdite, portando a risultati falsi positivi nei pazienti di sesso maschile.
4. Esamina i risultati del plug-in.
   1. Rivedi i risultati del plug-in Coverage Analysis : in alto a destra, fai clic su e seleziona Scarica file.
   2. Il plug-in Analisi della copertura genera un rapporto di analisi della copertura.
   3. Esamina i risultati del plug-in per l'analisi della copertura molecolare: in alto a destra, fai clic e seleziona Scarica file. Questa analisi verifica se tutti gli ampliconi sono coperti e conferma i risultati delle varianti del numero di copie (CNV) forniti dal software.
5. Visualizzare le metriche del saggio e il report di esecuzione
   1. Fare clic sulla scheda Esegui report nel riepilogo dell'esecuzione.
   2. Per visualizzare il report Esegui, selezionare l'opzione Seleziona esempio nel menu a discesa.
   3. Metriche del saggio e rapporto di esecuzione: individuare le metriche di sequenziazione nella parte superiore dello schermo, seguite dalle metriche specifiche del campione nella tabella Campioni di esecuzione .
      NOTA: le informazioni contenute nel file CSA (Customer Support Archive) possono aiutare a risolvere i risultati, ma non possono essere analizzate direttamente. I file CSA riepilogano i dati dell'intera esecuzione ed evidenziano le cause di un problema in caso di esecuzione non riuscita.
   4. Scaricare un report di esecuzione: fare clic sulla scheda Report .
   5. Fare clic su Scarica report per scaricare un riepilogo del report di esecuzione in formato PDF.
6. Genera un rapporto sulle varianti.
   1. Abilitare Genera report nel passaggio di configurazione per generare automaticamente un report di variante per ogni campione durante l'analisi dei dati di un'esecuzione.
   2. Dopo aver generato il report delle varianti per un campione, il sistema rende disponibile il report in due posizioni: in primo luogo, viene reso disponibile un collegamento nella schermata Risultati/Risultati campione . Clicca sul link per scaricare il PDF.
   3. In secondo luogo, vai al riquadro Report varianti nella scheda Report e fai clic sul pulsante Scarica report . Firmare i rapporti di variante elettronicamente o manualmente.
      NOTA: i report firmati elettronicamente hanno (Sign off) dopo il nome del campione nella schermata Risultati di esempio .

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Risultati

Utilizzando la procedura qui presentata, descritta in dettaglio nelle nostre recenti pubblicazioni²¹, abbiamo sviluppato un flusso di lavoro ottimale per la valutazione dell'alterazione molecolare come test riflesso nella pratica clinica di routine per la diagnosi in pazienti con NS-NSCLC utilizzando un approccio di sequenziamento di nuova generazione basato su ampliconi ultraveloci. Il flusso di lavoro molecolare del metodo è mostrato nella Figura 1. L'elenco dei ge...

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Discussione

Lo sviluppo di un approccio NGS ultraveloce basato su ampliconi come test riflesso per la valutazione dell'alterazione molecolare alla diagnosi di NS-NSLC in qualsiasi stadio è un'opzione ottimale per la rilevazione di tutti i biomarcatori raccomandati dalle linee guida ed emergenti in NS-NSCLC ^5,22,23. Mentre i metodi sequenziali (IHC, PCR, FISH) si concentrano solo su geni specifici e possono causare l'esaurimento del materia...

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Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
96 well hard shell plate clear	Thermo Fisher Scientific (Waltham, Massachusetts, USA)	4483354
Adhesive PCR Plate Foil	Thermo Fisher Scientific (Waltham, Massachusetts, USA)	AB0626
AutoLys M tube	Thermo Fisher Scientific (Waltham, Massachusetts, USA)	A38738	FFPE sample processing tubes
Genexus Barcodes 1-32 HD	Thermo Fisher Scientific (Waltham, Massachusetts, USA)	A40261
Genexus GX5 Chip and Genexus Coupler	Thermo Fisher Scientific (Waltham, Massachusetts, USA)	A40269
Genexus Pipette Tips	Thermo Fisher Scientific (Waltham, Massachusetts, USA)	A40266
Genexus Purification Instrument	Thermo Fisher Scientific (Waltham, Massachusetts, USA)	A48148	Automated purification instrument (API)
Genexus Sequencing Kit	Thermo Fisher Scientific (Waltham, Massachusetts, USA)	A40271
Genexus Templating Strips 3-GX5 and 4	Thermo Fisher Scientific (Waltham, Massachusetts, USA)	A40263
Genexus Integrated Sequencer	Thermo Fisher Scientific (Waltham, Massachusetts, USA)	A45727
Ion Torrent  Genexus FFPE DNA/RNA Purification Combo Kit	Thermo Fisher Scientific (Waltham, Massachusetts, USA)	A45539
Oncomine  Precision Assay GX (OPA) Panel (included Strips 1 and 2-HD)	Thermo Fisher Scientific (Waltham, Massachusetts, USA)	A46291