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Sequenciamento de última geração baseado em amplicon ultrarrápido em câncer de pulmão de células não pequenas não escamosas
Neste Artigo
Resumo
O aumento de biomarcadores moleculares a serem testados para o manejo do cuidado do câncer de pulmão não pequenas células não escamosas (CPNPC-NS) tem impulsionado o desenvolvimento de métodos de detecção molecular rápidos e confiáveis. Descrevemos um fluxo de trabalho para avaliação de alterações genômicas para pacientes com CPNPC-NS usando uma abordagem de sequenciamento de próxima geração (NGS) ultrarrápida.
Resumo
O número de alterações moleculares a serem testadas para terapia-alvo de pacientes com câncer de pulmão não pequenas células não escamosas (CPNPC) tem aumentado significativamente nos últimos anos. A detecção de anormalidades moleculares é mandatória para o tratamento ideal de pacientes com CPNPC NS avançado ou metastático, permitindo que terapias-alvo sejam administradas com melhora na sobrevida global. No entanto, esses tumores desenvolvem mecanismos de resistência que são potencialmente direcionáveis usando novas terapias. Algumas alterações moleculares também podem modular a resposta ao tratamento. A caracterização molecular do CPCNP deve ser realizada em um curto tempo de resposta (TAT), em menos de 10 dias úteis, conforme recomendado pelas diretrizes internacionais. Além disso, a origem das biópsias teciduais para análise genômica é diversa, e seu tamanho está diminuindo continuamente com o desenvolvimento de métodos e protocolos menos invasivos. Consequentemente, os patologistas estão sendo desafiados a realizar técnicas moleculares eficazes, mantendo uma estratégia de diagnóstico eficiente e rápida. Aqui, descrevemos o fluxo de trabalho de sequenciamento de próxima geração (NGS) ultrarrápido baseado em amplicon usado na prática diária de rotina no diagnóstico de pacientes com CPNPC-NS. Mostramos que este sistema é capaz de identificar os atuais alvos moleculares utilizados em medicina de precisão em oncologia torácica em um TAT apropriado.
Introdução
Na última década, o desenvolvimento de terapias direcionadas e imunológicas aumentou significativamente a sobrevida global (SG) do câncer de pulmão não escamoso de células não pequenas (CPCNP)1,2. Nesse sentido, o número de genes obrigatórios e alvos moleculares a serem analisados no tratamento do CPNPC-NS tem aumentado nos últimos anos 3,4.
As diretrizes internacionais atuais recomendam testar EGFR, ALK, ROS1, BRAF, NTRK, RET, e MET no diagnóstico de NS-NS 5
Protocolo
Todos os procedimentos foram aprovados pelo comitê de ética local (Comitê de Ética em Pesquisa com Seres Humanos, Centre Hospitalier Universitaire de Nice, Tumorothèque BB-0033-00025). Consentimento informado foi obtido de todos os pacientes para uso de amostras e dados gerados. Todas as amostras foram obtidas de pacientes diagnosticados com NS-CPNPC em LPCE (Nice, França) entre 20 de setembro e 31 de janeiro de 2022 como parte dos cuidados médicos.
1. Preparação de amostras de DNA e RNA FFPE usando instrumento de purificação automatizado (API) (Tempo de processamento: 5 h 15 min)
- Execute a planificação no instrum....
Resultados Representativos
Usando o procedimento aqui apresentado, descrito em detalhes em nossas publicações recentes21, desenvolvemos um fluxo de trabalho ideal para a avaliação de alterações moleculares como um teste reflexo na prática clínica rotineiramente realizada para o diagnóstico em pacientes com CPNPC NS usando uma abordagem de sequenciamento de última geração baseada em amplicon ultrarrápido. O fluxo de trabalho molecular do método é mostrado na Figura 1. A lista de g.......
Discussão
O desenvolvimento de uma abordagem NGS ultrarrápida baseada em amplicon como teste reflexo para avaliação de alterações moleculares no diagnóstico de qualquer estágio NS-NSLC é uma opção ideal para a detecção de todos os biomarcadores emergentes e recomendados pelas diretrizes em NS-NS 5,22,23. Enquanto os métodos sequenciais (IHC, PCR, FISH) se concentram apenas em genes específicos e podem resultar em exaustão d.......
Divulgações
Christophe Bontoux participa de atividades de palestrante pago e recebe benefícios da Thermo Fisher Scientific. Paul Hofman participa de atividades de palestrante remunerado e recebe benefícios e financiamento da Thermo Fisher Scientific.
Agradecimentos
Agradecemos à Thermo Fisher Scientific por nos dar a possibilidade de usar seu dispositivo e materiais.
....Materiais
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 96 well hard shell plate clear | Thermo Fisher Scientific (Waltham, Massachusetts, USA) | 4483354 | |
| Adhesive PCR Plate Foil | Thermo Fisher Scientific (Waltham, Massachusetts, USA) | AB0626 | |
| AutoLys M tube | Thermo Fisher Scientific (Waltham, Massachusetts, USA) | A38738 | FFPE sample processing tubes |
| Genexus Barcodes 1-32 HD | Thermo Fisher Scientific (Waltham, Massachusetts, USA) | A40261 | |
| Genexus GX5 Chip and Genexus Coupler | Thermo Fisher Scientific (Waltham, Massachusetts, USA) | A40269 | |
| Genexus Pipette Tips | Thermo Fisher Scientific (Waltham, Massachusetts, USA) | A40266 | |
| Genexus Purification Instrument | Thermo Fisher Scientific (Waltham, Massachusetts, USA) | A48148 | Automated purification instrument (API) |
| Genexus Sequencing Kit | Thermo Fisher Scientific (Waltham, Massachusetts, USA) | A40271 | |
| Genexus Templating Strips 3-GX5 and 4 | Thermo Fisher Scientific (Waltham, Massachusetts, USA) | A40263 | |
| Genexus Integrated Sequencer | Thermo Fisher Scientific (Waltham, Massachusetts, USA) | A45727 | |
| Ion Torrent Genexus FFPE DNA/RNA Purification Combo Kit | Thermo Fisher Scientific (Waltham, Massachusetts, USA) | A45539 | |
| Oncomine Precision Assay GX (OPA) Panel (included Strips 1 and 2-HD) | Thermo Fisher Scientific (Waltham, Massachusetts, USA) | A46291 |
Referências
- Howlader, N., et al. The effect of advances in lung-cancer treatment on population mortality. New England Journal of Medicine. 383 (7), 640-649 (2020).
- Melosky, B., et al. The rapidly....
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