Sequenciamento de última geração baseado em amplicon ultrarrápido em câncer de pulmão de células não pequenas não escamosas

Resumo

O aumento de biomarcadores moleculares a serem testados para o manejo do cuidado do câncer de pulmão não pequenas células não escamosas (CPNPC-NS) tem impulsionado o desenvolvimento de métodos de detecção molecular rápidos e confiáveis. Descrevemos um fluxo de trabalho para avaliação de alterações genômicas para pacientes com CPNPC-NS usando uma abordagem de sequenciamento de próxima geração (NGS) ultrarrápida.

Resumo

O número de alterações moleculares a serem testadas para terapia-alvo de pacientes com câncer de pulmão não pequenas células não escamosas (CPNPC) tem aumentado significativamente nos últimos anos. A detecção de anormalidades moleculares é mandatória para o tratamento ideal de pacientes com CPNPC NS avançado ou metastático, permitindo que terapias-alvo sejam administradas com melhora na sobrevida global. No entanto, esses tumores desenvolvem mecanismos de resistência que são potencialmente direcionáveis usando novas terapias. Algumas alterações moleculares também podem modular a resposta ao tratamento. A caracterização molecular do CPCNP deve ser realizada em um curto tempo de resposta (TAT), em menos de 10 dias úteis, conforme recomendado pelas diretrizes internacionais. Além disso, a origem das biópsias teciduais para análise genômica é diversa, e seu tamanho está diminuindo continuamente com o desenvolvimento de métodos e protocolos menos invasivos. Consequentemente, os patologistas estão sendo desafiados a realizar técnicas moleculares eficazes, mantendo uma estratégia de diagnóstico eficiente e rápida. Aqui, descrevemos o fluxo de trabalho de sequenciamento de próxima geração (NGS) ultrarrápido baseado em amplicon usado na prática diária de rotina no diagnóstico de pacientes com CPNPC-NS. Mostramos que este sistema é capaz de identificar os atuais alvos moleculares utilizados em medicina de precisão em oncologia torácica em um TAT apropriado.

Introdução

Na última década, o desenvolvimento de terapias direcionadas e imunológicas aumentou significativamente a sobrevida global (SG) do câncer de pulmão não escamoso de células não pequenas (CPCNP)^1,2. Nesse sentido, o número de genes obrigatórios e alvos moleculares a serem analisados no tratamento do CPNPC-NS tem aumentado nos últimos anos ^3,4.

As diretrizes internacionais atuais recomendam testar EGFR, ALK, ROS1, BRAF, NTRK, RET, e MET no diagnóstico de NS-NS 5^avançado. Além disso, como novas drogas têm recentemente dado resultados muito promissores em ensaios clínicos, alterações genômicas adicionais serão rastreadas em breve em vários genes adicionais, notadamente KRAS e HER2, juntamente com BRAC1/BRAC2, PI3KA, NRG1 e NUT 6,7,8,9. Além disso, o status de diferentes genes associados, como STK11, KEAP1 e TP53, pode ser de forte interesse para uma melhor predição da resposta ou resistência a algumas terapias-alvo e/ou inibidores de checkpoints imunes (ICIs)10,11,12.

É importante ressaltar que as alterações moleculares devem ser relatadas sem demora significativa para garantir a tomada de decisão clínica cuidadosa. A ausência de caracterização molecular de um tumor pode levar ao início de terapias não direcionadas, como quimioterapia com/sem imunoterapia, levando a uma estratégia de tratamento subótima, uma vez que a resposta à quimioterapia é limitada em pacientes com alterações acionáveis, como mutações no EGFR ou fusões gênicas¹³.

Além disso, o desenvolvimento atual de terapias-alvo/imunoterapias em ambientes neoadjuvantes e/ou adjuvantes poderia levar à busca sistemática, pelo menos, de alterações de EGFR e ALK no CPCNP em estágio inicial, uma vez que as ICIs devem ser administradas apenas em tumores selvagens para EGFR e ALK¹⁴. Agora, também é obrigatório testar a presença de mutações no EGFR no CPCNP (CPCNP com gene e SN em estágio inicial), uma vez que o osimertinibe (um inibidor da tirosina quinase do EGFR de terceira geração) pode ser usado como terapia adjuvante no CPCNP mutante para EGFR ¹⁵.

A estratégia para a avaliação dos diferentes biomarcadores na predição da resposta a diferentes terapias-alvo e/ou imunoterapias em pacientes com CPNPC-NS está avançando rapidamente, o que torna a identificação desses biomarcadores sequencialmente difícil ^3,16. Nesse sentido, o Next-Generation Sequencing (NGS) é atualmente a abordagem ideal para a avaliação paralela de alto rendimento de alterações gênicas no NS-NS-CPNPC ^5,17.

No entanto, o fluxo de trabalho da SNG pode ser difícil de dominar e pode conduzir a TAT mais longa^18,19. Assim, muitos centros ainda realizam abordagens sequenciais (imunohistoquímica (IHQ), hibridização in situ fluorescente (FISH) e/ou sequenciamento direcionado). No entanto, essa estratégia é limitada em caso de pequeno tamanho de amostra e, sobretudo, devido ao maior número de mutações acionáveis que são necessárias para serem testadas no NS-NSCLC²⁰. Assim, métodos de teste ultrarrápidos e diretos, permitindo a avaliação rápida de alterações gênicas, tornaram-se cada vez mais importantes para a tomada de decisões clínicas ideais. Além disso, sistemas aprovados e acreditados para testes moleculares estão se tornando obrigatórios para a prescrição de terapias-alvo específicas.

Aqui, descrevemos um ensaio DNA/RNA NGS ultrarrápido e automatizado baseado em amplicon para testes moleculares de NS-NSCLC que é usado no Laboratório de Patologia Clínica e Experimental (LPCE), Hospital Universitário de Nice, França e é acreditado de acordo com a norma ISO 15189 pelo Comitê Francês de Acreditação (COFRAC) (https://www.cofrac.fr/). O COFRAC certifica que o laboratório cumpre os requisitos da norma ISO 15189 e as regras de aplicação do COFRAC para as atividades de ensaio/calibração em análises moleculares em NGS automatizado em um sequenciador com o painel realizado pelo laboratório. A acreditação pela reconhecida norma internacional ISO 15189 demonstra a competência técnica do laboratório para um escopo definido e o bom funcionamento de um sistema de gestão adequado neste laboratório. Os benefícios e limitações desse fluxo de trabalho, desde a preparação das amostras de biópsia tecidual até a obtenção do laudo, são discutidos.

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Protocolo

Todos os procedimentos foram aprovados pelo comitê de ética local (Comitê de Ética em Pesquisa com Seres Humanos, Centre Hospitalier Universitaire de Nice, Tumorothèque BB-0033-00025). Consentimento informado foi obtido de todos os pacientes para uso de amostras e dados gerados. Todas as amostras foram obtidas de pacientes diagnosticados com NS-CPNPC em LPCE (Nice, França) entre 20 de setembro e 31 de janeiro de 2022 como parte dos cuidados médicos.

1. Preparação de amostras de DNA e RNA FFPE usando instrumento de purificação automatizado (API) (Tempo de processamento: 5 h 15 min)

1. Execute a planificação no instrumento.
   1. Ligue o instrumento e faça login com o nome de usuário e senha (Tabela de Materiais). Crie um plano de execução de purificação clicando em Executar, em Adicionar Plano e dando um nome ao plano de execução.
   2. Em seguida, selecione o kit de purificação apropriado e o protocolo para purificar sequencialmente o DNA e o RNA de amostras fixadas em formalina e emblocadas em parafina (FFPE). Permitir a quantificação após a purificação.
   3. Selecione o volume de eluição desejado (50 μL) na lista suspensa e clique em Avançar. Selecione o número de amostras que serão extraídas.
   4. Em seguida, selecione cada amostra, clique em Editar, insira ID de Exemplo e clique em Salvar.
2. Preparar amostras de DNA e RNA FFPE usando GPI
   1. Preparar amostras de tecido FFPE (4 cortes de 10 μm com micrótomo) ou realizar macrodissecção diretamente em blocos FFPE. Colocar cada amostra de tecido FFPE em tubos de processamento de amostra FFPE separados e identificados (Tabela de Materiais).
   2. Centrifugar a 2000 x g por 1 min para coletar o tecido no fundo dos tubos.
   3. Adicionar a cada tubo de processamento de amostras FFPE uma mistura mestre de protease digest preparada a partir de um kit de purificação de ácido nucleico e incubar a 60 °C durante, pelo menos, 60 min (Tabela de Materiais). Incubar as amostras a 90 °C durante 60 min.
   4. Após a incubação, deixar as amostras arrefecerem durante 5 minutos à temperatura ambiente (TR).
   5. Para cada tubo de processamento de amostras FFPE, levante o tubo interno, bloqueie-o virando à esquerda e, em seguida, centrifugue as amostras a 2000 x g por 10 min.
   6. Destrave os tubos internos virando à direita, separe-os dos tubos externos e descarte-os. Mantenha as amostras nos tubos externos sobre gelo até o carregamento no API.
   7. Prepare uma mistura mestre de digestão DNase e carregue-a na placa de purificação de DNA e RNA FFPE pré-cheia 2. Em seguida, carregar as amostras preparadas em FFPE DNA e placa de purificação de RNA 1 (Tabela de Materiais).
3. Inicie a execução de purificação na API.
   1. Na tela API, clique em Executar, selecione o Plano de Execução e clique em Avançar.
   2. Siga as indicações na tela para carregar a API com os consumíveis e reagentes necessários para a execução de purificação (Tabela de Materiais).
   3. Quando todos os reagentes estiverem carregados, clique em Avançar. Feche a porta da API e clique em Iniciar.
   4. No final da corrida, clique em "descarregar" na tela sensível ao toque e remova imediatamente a placa de arquivo de ácido nucleico de 48 poços contendo o DNA e o RNA da amostra purificada.
   5. Exporte os resultados da quantificação. Selar a placa e armazenar amostras purificadas a -80 °C. Transfira a placa de 96 poços para o sequenciador a ser analisado.
4. Crie um exemplo e crie uma execução.
   1. Abra e inicie sessão no software, selecione na barra de menus Exemplos e clique em Criar Amostra.
   2. Insira o nome, o sexo e a porcentagem de células tumorais da amostra e preencha os campos obrigatórios e opcionais, se necessário.
   3. Salve os detalhes (o sexo e a porcentagem de células tumorais são importantes para analisar variantes de número de cópias [CNVs]).
   4. Escolha Execuções e Ácido Nucleico para Resultar na barra de menus.
   5. Insira o nome da execução na etapa de instalação . Clique em Avançar.
   6. Selecione ensaio na etapa Ensaios . Clique em Avançar.
   7. Selecione as amostras na etapa Amostras para executar com o ensaio.
   8. Em seguida, no painel Ensaios Selecionados , clique em Atribuir. Clique em Avançar.
   9. Revise as posições da amostra na placa de entrada da amostra. Clique em Avançar.
   10. Revise o resumo do plano de execução e Salvar & Imprimir ou Salvar.

2. NGS automatizado no sequenciador (Tempo de processamento: 30 min)

1. Carregue a placa de amostra.
   NOTA: A concentração ideal de ácido nucleico é de 0,5 ng/μL. A faixa de concentração de ácido nucleico validada é de 0,33-1 ng/μL. Para DNA e RNA, a concentração de 1 ng/μL foi validada em laboratório.
   1. O sequenciador requer 20 μL de volume total. Verifique se há volume suficiente para o carregamento da amostra.
   2. Adicionar controles positivos (DNA e RNA) e NTC (DNA e RNA) ao 1º estágio do instrumento de purificação sem ser extraído. Use controles de DNA e RNA para cada execução para validar a execução e validar os lotes usados. Adicione controles de DNA e RNA à placa no final da execução da API.
2. Carregue o sequenciador e inicie uma execução.
   1. Retire todos os reagentes de suas caixas na geladeira ou freezer e descongele em RT por um período mínimo de 30 min (Tabela de Materiais) e máximo de 12 h.
   2. No laboratório, mantenha o sequenciador sempre ligado seguindo as orientações dadas pelo fornecedor durante o treinamento presencial. Faça login no sistema.
   3. Carregue a placa do instrumento de purificação, que contém amostras, depois de selar a placa com uma folha de folha de placa de PCR adesiva (Tabela de Materiais).
   4. Instale todos os consumíveis no deck. O sequenciador fornece instruções passo a passo para carregar cada consumível necessário em uma posição destacada (Tabela de Materiais).
   5. Verifique se não há precipitações no tubo 3 da Tira 2-HD. Agite o tubo ou agite suavemente a tira para dissolver o precipitado, se necessário.
   6. A tira 1 e a tira 3 contêm esferas magnéticas. Essa etapa é muito crítica: garantir que as contas sejam ressuspensas. Não deve haver contas deixadas na parte superior do tubo.
   7. Vire a tira de cabeça para baixo e para trás 3-4 vezes para remover as contas. Segure a tira em uma extremidade com o selo da tira orientado para cima. Depois, gire rapidamente a tira para baixo usando um movimento rápido e centrífugo do braço e termine dando um movimento brusco do pulso.
   8. Centrifugar a 300 x g por 15 s. Repita se necessário. Centrifugar as tiras com adaptadores e suportes de tiras para minimizar falhas observadas aleatoriamente em relação a resíduos de esferas na parte superior das tiras.
   9. Feche o sistema e clique em Avançar. Instale as portas do compartimento de reagentes de sequenciamento (Tabela de Materiais). Feche a porta. O sequenciador inicia automaticamente a execução.
3. Limpeza
   1. Para limpeza após a execução, quando a execução estiver concluída, clique em Avançar.
   2. A porta abre-se sucessivamente. Siga as instruções na tela para esvaziar os resíduos e remover todos os consumíveis. Clique em Avançar.
   3. Feche o deck quando terminar, clique em Avançar. Uma limpeza UV de 2 minutos é iniciada. O sequenciador está pronto para iniciar uma nova execução.

3. Análise dos resultados utilizando o software integrado (Tempo de análise por paciente [amostras ADN e ARN]: 15 min)

NOTA: A técnica é acreditada pelo Comitê Francês de Acreditação (COFRAC) ISO 15189 (https://www.cofrac.fr/)

1. Dados e resultados
   1. Selecione um resultado de execução ou um resultado de amostra no menu Resultados . Na tela Resultados/Resultados da Execução , todas as execuções são listadas.
   2. Pesquise a lista de resultados filtrando em um cabeçalho de coluna.
   3. Clique em Resultados e clique em Resultados de Exemplo. Em seguida, clique no nome da amostra de interesse na coluna de nome da amostra para exibir os resultados de sequenciamento de uma amostra exclusiva.
   4. Clique em Colunas no canto superior esquerdo da tela ou desmarque as colunas da tabela.
2. Veja os resultados do CQ e veja a cobertura do amplicon.
   1. Clique na guia QC na tela Resultados .
   2. Para o DNA, certifique-se de que as diferenças absolutas medianas entre pares (MAPDs) estejam entre 0 e 0,5 para validar a análise das variantes do número de cópias (CNV). As leituras mapeadas devem ser superiores a 1,5 milhão.
   3. Para o RNA, verifique se as leituras mapeadas estão entre 150.000 e 400.000. Abaixo disso, há o risco de falsos negativos e, além disso, há o risco de falsos positivos.
   4. Clique em um nome de exemplo para abrir a guia Principais descobertas .
   5. Role até os gráficos de cobertura do amplicon.
   6. Revise os gráficos de cobertura. Defina o limite mínimo para a cobertura amplicon, pois o fornecedor não o fornece. Para definir um intervalo e um limite, misture um controle e uma amostra de tipo selvagem (WT). Em seguida, observe o menor valor da cobertura do amplicon para uma ou mais mutações selecionadas.
3. Exibir resultados de variantes.
   1. Para exportar os dados em formato tabular, clique em Exportar no canto superior direito da tela.
   2. Para exibir o resultado da variante de nucleotídeo único/variante de inserção-exclusão (SNV/INDEL), clique na guia Variantes e, em seguida, clique em SNVs/Indels. Clique em Editar filtros e selecione Sem filtro.
      NOTA: O limiar de sensibilidade foi definido em 5% de acordo com as recomendações do grupo (https://www.e-cancer.fr/Professionnels-de-sante/Les-therapies-ciblees/Les-plateformes-de-genetique-moleculaire-des-cancers/Le-programme-d-assurance-qualite-des-plateformes) do INCA (Instituto Nacional de Câncer).
   3. Exibir resultados do Fusion e exibir Variantes de Exon de RNA: Clique na guia Variantes e, em seguida, clique em Fusões.
   4. No canto superior direito, clique em Visualização e Variante de Exon de RNA e, em seguida, revise o gráfico de Variantes de Exon de RNA .
   5. Com este kit, o pulo de exon dos genes EGFR, MET, e AR pode ser detectado. Clique em Visualização; é mais fácil de analisar.
   6. Exibir desequilíbrio de fusão de blocos de exons de RNA: clique na guia Variantes e, em seguida, clique em Fusões.
   7. No canto superior direito, clique em Visualização e Desequilíbrio de Fusão de Blocos de Exon de RNA e, em seguida, revise os gráficos de Desequilíbrio de Fusão de Blocos de Exon de RNA . Uma fusão de desequilíbrio é uma fusão entre um parceiro conhecido e um parceiro que não é coberto pelo painel.
   8. Exibir resultados CNV: Clique em CNVs na guia Variantes para exibir os dados.
      OBS: É necessário ficar atento aos resultados da CNV, informando durante o preparo das amostras o sexo e a porcentagem de células tumorais da amostra. O gene AR é transportado apenas pelo cromossomo X . Se o sexo não for especificado, o sexo masculino pode encontrar perdas, levando a resultados falso-positivos em pacientes do sexo masculino.
4. Revise os resultados do plugin.
   1. Revise os resultados do plug-in Análise de cobertura : no canto superior direito, clique e selecione baixar arquivos.
   2. O plugin Análise de Cobertura gera um Relatório de Análise de Cobertura.
   3. Revise os resultados do plugin Análise de Cobertura molecular: No canto superior direito, clique e selecione baixar arquivos. Essa análise verifica se todos os amplicons estão cobertos e confirma os resultados das variantes de número de cópias (CNVs) fornecidos pelo software.
5. Exibir métricas de ensaio e o relatório de execução
   1. Clique na guia Executar Relatório no Resumo da Execução.
   2. Para exibir o Relatório de Execução, selecione a opção Selecionar Amostra no menu suspenso.
   3. Métricas de ensaio e o relatório de execução: localize as métricas de sequenciamento na parte superior da tela, seguidas por métricas específicas de amostra na tabela Executar amostras .
      Observação : informações no arquivo de suporte ao cliente (CSA) podem ajudar a solucionar problemas de resultados, mas eles não podem ser analisados diretamente. Os arquivos CSA resumem os dados de todos os dados de execução e destacam as causas de um problema em caso de falha na execução.
   4. Baixar um relatório de execução: clique na guia Relatórios .
   5. Clique em Baixar relatório para baixar um resumo de relatório de execução em formato PDF.
6. Gerar relatório de variantes.
   1. Habilite Gerar relatório na etapa Instalação para gerar automaticamente um relatório de variante para cada amostra durante a análise de dados de uma execução.
   2. Depois de gerar o relatório de variante para uma amostra, o sistema disponibiliza o relatório em dois locais: primeiro, um link é disponibilizado na tela Resultados/Resultados da amostra . Clique no link para baixar o PDF.
   3. Em segundo lugar, vá para o painel Relatório de Variante na guia Relatórios e clique no botão Baixar Relatório . Assine os relatórios de variantes eletronicamente ou manualmente.
      Observação : relatórios assinados eletronicamente têm (aprovação) após o nome do exemplo na tela resultados de exemplo .

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Resultados

Usando o procedimento aqui apresentado, descrito em detalhes em nossas publicações recentes²¹, desenvolvemos um fluxo de trabalho ideal para a avaliação de alterações moleculares como um teste reflexo na prática clínica rotineiramente realizada para o diagnóstico em pacientes com CPNPC NS usando uma abordagem de sequenciamento de última geração baseada em amplicon ultrarrápido. O fluxo de trabalho molecular do método é mostrado na Figura 1. A lista de g...

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Discussão

O desenvolvimento de uma abordagem NGS ultrarrápida baseada em amplicon como teste reflexo para avaliação de alterações moleculares no diagnóstico de qualquer estágio NS-NSLC é uma opção ideal para a detecção de todos os biomarcadores emergentes e recomendados pelas diretrizes em NS-NS ^5,22,23. Enquanto os métodos sequenciais (IHC, PCR, FISH) se concentram apenas em genes específicos e podem resultar em exaustão d...

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Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
96 well hard shell plate clear	Thermo Fisher Scientific (Waltham, Massachusetts, USA)	4483354
Adhesive PCR Plate Foil	Thermo Fisher Scientific (Waltham, Massachusetts, USA)	AB0626
AutoLys M tube	Thermo Fisher Scientific (Waltham, Massachusetts, USA)	A38738	FFPE sample processing tubes
Genexus Barcodes 1-32 HD	Thermo Fisher Scientific (Waltham, Massachusetts, USA)	A40261
Genexus GX5 Chip and Genexus Coupler	Thermo Fisher Scientific (Waltham, Massachusetts, USA)	A40269
Genexus Pipette Tips	Thermo Fisher Scientific (Waltham, Massachusetts, USA)	A40266
Genexus Purification Instrument	Thermo Fisher Scientific (Waltham, Massachusetts, USA)	A48148	Automated purification instrument (API)
Genexus Sequencing Kit	Thermo Fisher Scientific (Waltham, Massachusetts, USA)	A40271
Genexus Templating Strips 3-GX5 and 4	Thermo Fisher Scientific (Waltham, Massachusetts, USA)	A40263
Genexus Integrated Sequencer	Thermo Fisher Scientific (Waltham, Massachusetts, USA)	A45727
Ion Torrent  Genexus FFPE DNA/RNA Purification Combo Kit	Thermo Fisher Scientific (Waltham, Massachusetts, USA)	A45539
Oncomine  Precision Assay GX (OPA) Panel (included Strips 1 and 2-HD)	Thermo Fisher Scientific (Waltham, Massachusetts, USA)	A46291