Secuenciación ultrarrápida de próxima generación basada en amplicones en el cáncer de pulmón no escamoso y no microcítico

Resumen

El aumento de los biomarcadores moleculares que se deben probar para el tratamiento del cáncer de pulmón de células no pequeñas no escamosas (NS-NSCLC) ha impulsado el desarrollo de métodos de detección molecular rápidos y fiables. Describimos un flujo de trabajo para la evaluación de la alteración genómica en pacientes con NSCLC-NSCLC utilizando un enfoque de secuenciación ultrarrápida de nueva generación (NGS).

Resumen

El número de alteraciones moleculares que se deben probar para la terapia dirigida de pacientes con cáncer de pulmón de células no pequeñas no escamosas (NSCLC) ha aumentado significativamente en los últimos años. La detección de anomalías moleculares es obligatoria para la atención óptima de los pacientes con CPNM-NS-avanzado o metastásico, lo que permite administrar terapias dirigidas con una mejora de la supervivencia global. Sin embargo, estos tumores desarrollan mecanismos de resistencia que son potencialmente dianas mediante nuevas terapias. Algunas alteraciones moleculares también pueden modular la respuesta al tratamiento. La caracterización molecular del NSCLC debe realizarse en un tiempo de respuesta corto (TAT), en menos de 10 días hábiles, según lo recomendado por las guías internacionales. Además, el origen de las biopsias de tejido para análisis genómico es diverso, y su tamaño disminuye continuamente con el desarrollo de métodos y protocolos menos invasivos. En consecuencia, los patólogos se enfrentan al reto de realizar técnicas moleculares eficaces manteniendo una estrategia de diagnóstico eficiente y rápida. Aquí, describimos el flujo de trabajo ultrarrápido de secuenciación de próxima generación (NGS) basado en amplicones que se utiliza en la práctica rutinaria diaria en el momento del diagnóstico para pacientes con NSCLC. Demostramos que este sistema es capaz de identificar las dianas moleculares actuales utilizadas en medicina de precisión en oncología torácica en un TAT adecuado.

Introducción

Durante la última década, el desarrollo de terapias dirigidas e inmunoterapias ha aumentado significativamente la supervivencia global (SG) del cáncer de pulmón de células no pequeñas no escamosas (NSCLC)^1,2. En este sentido, el número de genes y dianas moleculares obligatorias a analizar en el tratamiento del CPNM-NS ha aumentado en los últimos años ^3,4.

Las guías internacionales actuales recomiendan realizar pruebas de EGFR, ALK, ROS1, BRAF, NTRK, RET y MET en el diagnóstico de NSCLC avanzado⁵. Además, dado que los nuevos fármacos han dado recientemente resultados muy prometedores en ensayos clínicos, en breve se detectarán alteraciones genómicas adicionales en una serie de genes adicionales, en particular KRAS y HER2, junto con BRAC1/BRAC2, PI3KA, NRG1 y NUT 6,7,8,9. Además, el estado de diferentes genes asociados, como STK11, KEAP1 y TP53, puede ser de gran interés para una mejor predicción de la respuesta o resistencia a algunas terapias dirigidas y/o inhibidores de puntos de control inmunitario (ICI)10,11,12.

Es importante destacar que las alteraciones moleculares deben notificarse sin demora significativa para garantizar una toma de decisiones clínicas cuidadosa. La ausencia de caracterización molecular de un tumor puede llevar al inicio de terapias no dirigidas, como la quimioterapia con/sin inmunoterapia, lo que lleva a una estrategia de tratamiento subóptima, ya que la respuesta a la quimioterapia es limitada en pacientes con alteraciones procesables, como mutaciones en EGFR o fusiones génicas¹³.

Además, el desarrollo actual de terapias dirigidas/inmunoterapias en entornos neoadyuvantes y/o adyuvantes podría llevar a la búsqueda sistemática, al menos, de alteraciones de EGFR y ALK en el NSCLC en estadio temprano, ya que los ICI deben administrarse solo en tumores de tipo salvaje para EGFR y ALK¹⁴. Ahora también es obligatorio realizar pruebas para detectar la presencia de mutaciones en el CPNM-EGFR en estadio temprano, ya que el osimertinib (un inhibidor de la tirosina cinasa del EGFR de tercera generación) puede utilizarse como terapia adyuvante en el CPNM-NS-mutante en EGFR ¹⁵.

La estrategia para la evaluación de los diferentes biomarcadores en la predicción de la respuesta a diferentes terapias dirigidas y/o inmunoterapias en pacientes con CPNM-NS está avanzando rápidamente, lo que dificulta secuencialmente la identificación de estos biomarcadores ^3,16. En este sentido, la secuenciación de nueva generación (NGS) es ahora el enfoque óptimo para la evaluación paralela de alto rendimiento de las alteraciones genéticas en el NSCLC ^5,17.

Sin embargo, el flujo de trabajo de NGS puede ser difícil de dominar y puede llevar a un TAT^18,19 más largo. Así, muchos centros siguen realizando abordajes secuenciales (inmunohistoquímica (IHQ), hibridación fluorescente in situ (FISH) y/o secuenciación dirigida). Sin embargo, esta estrategia es limitada en caso de que la muestra sea pequeña y, sobre todo, debido al mayor número de mutaciones accionables que deben analizarse en el NS-NSCLC²⁰. Por lo tanto, los métodos de prueba ultrarrápidos y sencillos que permiten la evaluación rápida de las alteraciones genéticas se han vuelto cada vez más importantes para la toma de decisiones clínicas óptimas. Además, los sistemas aprobados y acreditados para las pruebas moleculares se están convirtiendo en obligatorios para la prescripción de terapias dirigidas específicas.

Aquí, describimos un ensayo NGS de ADN/ARN ultrarrápido y automatizado basado en amplicones para pruebas moleculares de NS-NSCLC que se utiliza en el Laboratorio de Laboratorio de Patología Clínica y Experimental (LPCE) del Hospital Universitario de Niza, Francia y está acreditado según la norma ISO 15189 por el Comité de Acreditación Francés (COFRAC) (https://www.cofrac.fr/). El COFRAC certifica que el laboratorio cumple con los requisitos de la norma ISO 15189 y las reglas de aplicación del COFRAC para las actividades de ensayo/calibración en análisis molecular en NGS automatizado en un secuenciador con el panel realizado por el laboratorio. La acreditación según la reconocida norma internacional ISO 15189 demuestra la competencia técnica del laboratorio para un alcance definido y el correcto funcionamiento de un sistema de gestión adecuado en este laboratorio. Se discuten los beneficios y limitaciones de este flujo de trabajo, desde la preparación de muestras de biopsia de tejido hasta la obtención del informe.

Protocolo

Todos los procedimientos han sido aprobados por el comité de ética local (Comité de Ética de la Investigación en Seres Humanos, Centro Hospitalario Universitario de Niza, Tumorothèque BB-0033-00025). Se obtuvo el consentimiento informado de todos los pacientes para el uso de muestras y datos generados. Todas las muestras se obtuvieron de pacientes diagnosticados de NSCLC en LPCE (Niza, Francia) entre el 20 de septiembre y el 31 de enero de 2022 como parte de la atención médica.

1. Preparación de muestras de ADN y ARN FFPE utilizando un instrumento de purificación automatizado (API) (Tiempo de procesamiento: 5 h 15 min)

1. Ejecute la planificación en el instrumento.
   1. Encienda el instrumento e inicie sesión con el nombre de usuario y la contraseña (Tabla de materiales). Para crear un plan de ejecución de purificación, haga clic en Ejecutar y, a continuación, en Agregar plan y asigne un nombre al plan de ejecución.
   2. A continuación, seleccione el kit de purificación y el protocolo adecuados para purificar secuencialmente el ADN y el ARN de muestras fijadas en formol e incluidas en parafina (FFPE). Habilite la cuantificación después de la purificación.
   3. Seleccione el volumen de elución deseado (50 μL) en la lista desplegable y, a continuación, haga clic en Siguiente. Seleccione el número de muestras que se extraerán.
   4. A continuación, seleccione cada muestra, haga clic en Editar, escriba ID de muestra y, a continuación, haga clic en Guardar.
2. Preparación de muestras de ADN y ARN FFPE utilizando GPI
   1. Preparar muestras de tejido FFPE (4 secciones de corte de 10 μm con un micrótomo) o realizar la macrodisección directamente en bloques FFPE. Coloque cada muestra de tejido FFPE en tubos de procesamiento de muestras FFPE separados e identificados (Tabla de materiales).
   2. Centrifugar a 2000 x g durante 1 min para recoger el tejido en el fondo de los tubos.
   3. Añadir a cada tubo de procesamiento de muestras FFPE una mezcla maestra de digestión de proteasa preparada a partir de un kit de purificación de ácidos nucleicos e incubar a 60 °C durante al menos 60 min (Tabla de materiales). Incubar las muestras a 90 °C durante 60 min.
   4. Después de la incubación, deje que las muestras se enfríen durante 5 minutos a temperatura ambiente (RT).
   5. Para cada tubo de procesamiento de muestras FFPE, levante el tubo interior, bloquéelo girando a la izquierda y, a continuación, centrifugue las muestras a 2000 x g durante 10 minutos.
   6. Desbloquee las cámaras de aire girando a la derecha, sepárelas de las cámaras de aire y deséchelas. Mantenga las muestras en los tubos exteriores en hielo hasta que se carguen en el API.
   7. Prepare una mezcla maestra de digestión de DNasa y cárguela en la placa de purificación de ADN y ARN FFPE precargada 2. A continuación, cargue las muestras preparadas en la placa de purificación de ADN y ARN FFPE 1 (Tabla de materiales).
3. Inicie la ejecución de purificación en la API.
   1. En la pantalla de la API, haga clic en Ejecutar, seleccione el Plan de ejecución y, a continuación, haga clic en Siguiente.
   2. Siga las indicaciones en pantalla para cargar el API con los consumibles y reactivos necesarios para la ejecución de purificación (Tabla de materiales).
   3. Cuando todos los reactivos estén cargados, haga clic en Siguiente. Cierre la puerta de la API y haga clic en Iniciar.
   4. Al final de la carrera, haga clic en «descargar» en la pantalla táctil e inmediatamente retire la placa de archivo de ácido nucleico de 48 pocillos que contiene la muestra purificada de ADN y ARN.
   5. Exporte los resultados de la cuantificación. Selle la placa y almacene las muestras purificadas a -80 °C. Transfiera la placa de 96 pocillos al secuenciador que se va a analizar.
4. Cree un ejemplo y cree una ejecución.
   1. Abra e inicie sesión en el software, luego elija en la barra de menú Muestras y haga clic en Crear muestra.
   2. Ingrese el nombre, el sexo y el porcentaje de células tumorales de la muestra, y complete los campos obligatorios y los campos opcionales si es necesario.
   3. Guarde los detalles (el sexo y el porcentaje de células tumorales son importantes para analizar las variantes del número de copias [CNV]).
   4. Elija Ejecuciones y Ácido nucleico para obtener resultados en la barra de menús.
   5. Introduzca el nombre de la ejecución en el paso Configuración . Haga clic en Siguiente.
   6. Seleccione el ensayo en el paso Ensayos . Haga clic en Siguiente.
   7. Seleccione las muestras en el paso Muestras para ejecutar el ensayo.
   8. A continuación, en el panel Ensayos seleccionados , haga clic en Asignar. Haga clic en Siguiente.
   9. Revise las posiciones de la muestra en la placa de entrada de la muestra. Haga clic en Siguiente.
   10. Revise el resumen del plan de ejecución y, a continuación, Guardar e imprimir o Guardar.

2. NGS automatizado en el secuenciador (tiempo de procesamiento: 30 min)

1. Cargue la placa de muestra.
   NOTA: La concentración óptima de ácidos nucleicos es de 0,5 ng/μL. El rango de concentración de ácido nucleico validado es de 0,33-1 ng/μL. Para el ADN y el ARN, se validó la concentración de 1 ng/μL en el laboratorio.
   1. El secuenciador requiere un volumen total de 20 μL. Asegúrese de que haya suficiente volumen para la carga de muestras.
   2. Añadir controles positivos (ADN y ARN) y NTC (ADN y ARN) a la 1ª etapa del instrumento de purificación sin ser extraídos. Utilice controles de ADN y ARN para cada ejecución para validar la ejecución y validar los lotes utilizados. Agregue controles de ADN y ARN a la placa al final de la ejecución de API.
2. Cargue el secuenciador e inicie una ejecución.
   1. Retirar todos los reactivos de sus cajas en el frigorífico o congelador y descongelar a RT durante un periodo mínimo de 30 min (Tabla de Materiales) y un máximo de 12 h.
   2. En el laboratorio, mantenga el secuenciador siempre encendido siguiendo los consejos dados por el proveedor durante la formación in situ. Inicie sesión en el sistema.
   3. Cargue la placa del instrumento de purificación, que contiene muestras, después de sellar la placa con una hoja de lámina adhesiva de placa de PCR (Tabla de materiales).
   4. Instala todos los consumibles en la plataforma. El secuenciador proporciona instrucciones paso a paso para cargar cada consumible requerido en una posición resaltada (Tabla de materiales).
   5. Compruebe que no haya precipitaciones en el tubo 3 de la tira 2-HD. Mueva el tubo o haga un vórtice suave de la tira para disolver el precipitado si es necesario.
   6. La tira 1 y la tira 3 contienen perlas magnéticas. Este paso es muy importante: asegúrese de que las cuentas se vuelvan a suspender. No deben quedar cuentas en la parte superior del tubo.
   7. Dale la vuelta a la tira y hacia atrás 3-4 veces para quitar las cuentas. Sostenga la tira en un extremo con el sello de la tira orientado hacia arriba. Después, balancea rápidamente la tira hacia abajo con un movimiento rápido y centrífugo del brazo, y termina dando un movimiento brusco de muñeca.
   8. Centrifugar a 300 x g durante 15 s. Repita si es necesario. Centrifugar las tiras con adaptadores y soportes de tiras para minimizar las fallas observadas aleatoriamente en relación con los residuos de bolas en la parte superior de las tiras.
   9. Cierre el sistema y haga clic en Siguiente. Instale las puertas de la bahía de reactivos de secuenciación (Tabla de materiales). Cierra la puerta. El secuenciador inicia automáticamente la ejecución.
3. Limpieza
   1. Para limpiar después de la ejecución, cuando se complete la ejecución, haga clic en Siguiente.
   2. La puerta se abre sucesivamente. Siga las instrucciones que aparecen en pantalla para vaciar los residuos y retirar todos los consumibles. Haga clic en Siguiente.
   3. Cierre la plataforma cuando haya terminado, haga clic en Siguiente. Comienza una limpieza UV de 2 minutos. El secuenciador está listo para iniciar una nueva ejecución.

3. Análisis de los resultados mediante el software integrado (Tiempo de análisis por paciente [muestras ADN y ARN]: 15 min)

NOTA: La técnica está acreditada por el Comité Francés de Acreditación (COFRAC) ISO 15189 (https://www.cofrac.fr/)

1. Datos y resultados
   1. Seleccione un resultado de ejecución o un resultado de muestra en el menú Resultados . En la pantalla Resultados/Resultados de ejecución , se enumeran todas las ejecuciones.
   2. Busque en la lista de resultados filtrando en el encabezado de una columna.
   3. Haga clic en Resultados y, a continuación, haga clic en Resultados de muestra. A continuación, haga clic en el nombre de la muestra de interés en la columna de nombre de muestra para ver los resultados de secuenciación de una muestra única.
   4. Haga clic en Columnas en la esquina superior izquierda de la pantalla o anule la selección de las columnas de la tabla.
2. Vea los resultados del control de calidad y vea la cobertura del amplicón.
   1. Haga clic en la pestaña Control de calidad en la pantalla Resultados .
   2. En el caso del ADN, asegúrese de que la mediana de las diferencias absolutas por pares (MAPD) esté entre 0 y 0,5 para validar el análisis de variantes del número de copias (CNV). Las lecturas asignadas deben ser superiores a 1,5 millones.
   3. En el caso del ARN, compruebe si las lecturas asignadas están entre 150.000 y 400.000. Por debajo de esto, existe el riesgo de falsos negativos, y más allá de eso, existe el riesgo de falsos positivos.
   4. Haga clic en el nombre de un ejemplo para abrir la pestaña Hallazgos clave .
   5. Desplácese hasta los gráficos de cobertura del amplicón.
   6. Revise los gráficos de cobertura. Defina el umbral mínimo para la cobertura del amplicón, ya que el proveedor no lo proporciona. Para definir un intervalo y un umbral, mezcle un control y una muestra de tipo salvaje (WT). A continuación, observe el valor más pequeño de la cobertura del amplicón para una o más mutaciones seleccionadas.
3. Ver los resultados de las variantes.
   1. Para exportar los datos en formato tabular, haga clic en Exportar en la esquina superior derecha de la pantalla.
   2. Para ver el resultado de la variante de nucleótido único/variante de inserción-deleción (SNV/INDEL), haga clic en la pestaña Variantes y, a continuación, haga clic en SNV/Indels. Haga clic en Editar filtros y seleccione Sin filtro.
      NOTA: El umbral de sensibilidad se ha definido en un 5% según las recomendaciones del grupo INCA (Instituto Nacional del Cáncer de Francia) (https://www.e-cancer.fr/Professionnels-de-sante/Les-therapies-ciblees/Les-plateformes-de-genetique-moleculaire-des-cancers/Le-programme-d-assurance-qualite-des-plateformes).
   3. Ver los resultados de la fusión y ver las variantes de exones de ARN: haga clic en la pestaña Variantes y, a continuación, haga clic en Fusiones.
   4. En la parte superior derecha, haga clic en Visualización y variante de exón de ARN y, a continuación, revise la gráfica Variantes de exón de ARN .
   5. Con este kit, se puede detectar la omisión de exones de los genes EGFR, MET y AR . Haga clic en Visualización; Es más fácil de analizar.
   6. Ver el desequilibrio de fusión de mosaicos de exones de ARN: haz clic en la pestaña Variantes y, a continuación, haz clic en Fusiones.
   7. En la parte superior derecha, haga clic en Visualización y desequilibrio de fusión de teselas de exones de ARN y, a continuación, revise las gráficas de desequilibrio de fusión de teselas de exones de ARN . Una fusión de desequilibrio es una fusión entre un socio conocido y un socio que no está cubierto por el panel.
   8. Ver resultados de CNV: Haga clic en CNV en la pestaña Variantes para mostrar los datos.
      NOTA: Es necesario estar atentos a los resultados de la NVC informando durante la preparación de las muestras el sexo y el porcentaje de células tumorales de la muestra. El gen AR solo es portado por el cromosoma X . Si no se especifica el sexo, el sexo masculino podría sufrir pérdidas, lo que llevaría a resultados falsos positivos en pacientes masculinos.
4. Revisa los resultados del plugin.
   1. Revisa los resultados del plugin Coverage Analysis : En la parte superior derecha, haz clic y selecciona descargar archivos.
   2. El plugin Análisis de cobertura genera un informe de análisis de cobertura.
   3. Revisa los resultados del plugin de análisis de cobertura molecular: En la parte superior derecha, haz clic y selecciona descargar archivos. Este análisis verifica si todos los amplicones están cubiertos y confirma los resultados de las variantes del número de copias (CNV) proporcionados por el software.
5. Ver las métricas del ensayo y el informe de ejecución
   1. Haga clic en la pestaña Informe de ejecución en el Resumen de ejecución.
   2. Para ver el informe de ejecución, seleccione la opción Seleccionar muestra en el menú desplegable.
   3. Métricas de ensayo y el informe de ejecución: busque las métricas de secuenciación en la parte superior de la pantalla, seguidas de las métricas específicas de la muestra en la tabla Muestras de ejecución .
      NOTA: La información del archivo de archivo de soporte al cliente (CSA) puede ayudar a solucionar los resultados, pero no se pueden analizar directamente. Los archivos CSA resumen los datos de todos los datos de ejecución y resaltan las causas de un problema en caso de una ejecución fallida.
   4. Descargar un informe de ejecución: haga clic en la pestaña Informes .
   5. Haga clic en Descargar informe para descargar un resumen del informe de ejecución en formato PDF.
6. Generar informe de variantes.
   1. Habilite Generar informe en el paso Configuración para generar automáticamente un informe de variantes para cada muestra durante el análisis de datos de una ejecución.
   2. Después de generar el informe de variantes para una muestra, el sistema hace que el informe esté disponible en dos lugares: En primer lugar, se pone a disposición un enlace en la pantalla Resultados/Resultados de muestra . Haga clic en el enlace para descargar el PDF.
   3. En segundo lugar, vaya al panel Informe de variantes en la pestaña Informes y haga clic en el botón Descargar informe . Firme los informes de variantes de forma electrónica o manual.
      NOTA: Los informes firmados electrónicamente tienen (Firmar) después del nombre de la muestra en la pantalla Resultados de la muestra .

Resultados

Utilizando el procedimiento aquí presentado, descrito en detalle en nuestras publicaciones recientes²¹, desarrollamos un flujo de trabajo óptimo para la evaluación de la alteración molecular como prueba refleja en la práctica clínica realizada de forma rutinaria para el diagnóstico en pacientes con NSCLC utilizando un enfoque de secuenciación de próxima generación ultrarrápido basado en amplicones. El flujo de trabajo molecular del método se muestra en la Figura 1<...

Discusión

El desarrollo de un enfoque de NGS ultrarrápido basado en amplicones como prueba refleja para la evaluación de la alteración molecular en el diagnóstico de cualquier NS-NSLC en estadio es una opción óptima para la detección de todos los biomarcadores recomendados y emergentes recomendados por las guías en el NSCLC ^5,22,23. Mientras que los métodos secuenciales (IHC, PCR, FISH) se centran solo en genes específicos y pue...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
96 well hard shell plate clear	Thermo Fisher Scientific (Waltham, Massachusetts, USA)	4483354
Adhesive PCR Plate Foil	Thermo Fisher Scientific (Waltham, Massachusetts, USA)	AB0626
AutoLys M tube	Thermo Fisher Scientific (Waltham, Massachusetts, USA)	A38738	FFPE sample processing tubes
Genexus Barcodes 1-32 HD	Thermo Fisher Scientific (Waltham, Massachusetts, USA)	A40261
Genexus GX5 Chip and Genexus Coupler	Thermo Fisher Scientific (Waltham, Massachusetts, USA)	A40269
Genexus Pipette Tips	Thermo Fisher Scientific (Waltham, Massachusetts, USA)	A40266
Genexus Purification Instrument	Thermo Fisher Scientific (Waltham, Massachusetts, USA)	A48148	Automated purification instrument (API)
Genexus Sequencing Kit	Thermo Fisher Scientific (Waltham, Massachusetts, USA)	A40271
Genexus Templating Strips 3-GX5 and 4	Thermo Fisher Scientific (Waltham, Massachusetts, USA)	A40263
Genexus Integrated Sequencer	Thermo Fisher Scientific (Waltham, Massachusetts, USA)	A45727
Ion Torrent  Genexus FFPE DNA/RNA Purification Combo Kit	Thermo Fisher Scientific (Waltham, Massachusetts, USA)	A45539
Oncomine  Precision Assay GX (OPA) Panel (included Strips 1 and 2-HD)	Thermo Fisher Scientific (Waltham, Massachusetts, USA)	A46291