JoVE Logo
Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

Skuamöz olmayan küçük hücreli dışı akciğer kanseri (NS-NSCLC) bakım yönetimi için test edilecek moleküler biyobelirteçlerin artması, hızlı ve güvenilir moleküler tespit yöntemlerinin geliştirilmesine yol açmıştır. NS-KHDAK hastaları için genomik değişiklik değerlendirmesi için ultra hızlı yeni nesil dizileme (NGS) yaklaşımı kullanan bir iş akışı tanımlıyoruz.

Özet

Skuamöz olmayan küçük hücreli dışı akciğer kanseri (NS-KHDAK) hastalarının hedefe yönelik tedavisi için test edilecek moleküler değişikliklerin sayısı son birkaç yılda önemli ölçüde artmıştır. Moleküler anormalliklerin saptanması, ileri veya metastatik NS-KHDAK hastalarının optimal bakımı için zorunludur ve hedefe yönelik tedavilerin genel sağkalımda bir iyileşme ile uygulanmasına izin verir. Bununla birlikte, bu tümörler, yeni tedaviler kullanılarak potansiyel olarak hedeflenebilen direnç mekanizmaları geliştirir. Bazı moleküler değişiklikler de tedavi yanıtını modüle edebilir. NS-NSCLC'nin moleküler karakterizasyonu, uluslararası kılavuzların önerdiği gibi, 10 iş gününden daha kısa bir sürede kısa bir geri dönüş süresinde (TAT) gerçekleştirilmelidir. Ek olarak, genomik analiz için doku biyopsilerinin kökeni çeşitlidir ve daha az invaziv yöntem ve protokollerin geliştirilmesiyle boyutları sürekli olarak azalmaktadır. Sonuç olarak, patologlar etkili ve hızlı bir tanı stratejisi sürdürürken etkili moleküler teknikler uygulamak zorunda kalmaktadırlar. Burada, NS-KHDAK hastaları için tanıda günlük rutin uygulamada kullanılan ultra hızlı amplikon tabanlı yeni nesil dizileme (NGS) iş akışını açıklıyoruz. Bu sistemin torasik onkolojide hassas tıpta kullanılan mevcut moleküler hedefleri uygun bir TAT'ta tanımlayabildiğini gösterdik.

Giriş

Son on yılda, hedefe yönelik ve immüno-tedavilerin geliştirilmesi, skuamöz olmayan küçük hücreli dışı akciğer kanserinin (NS-NSCLC) genel sağkalımını (OS) önemli ölçüde artırmıştır1,2. Bu bağlamda, NS-KHDAK tedavisinde analiz edilmesi gereken zorunlu genlerin ve moleküler hedeflerin sayısı son birkaç yılda artmıştır 3,4.

Mevcut uluslararası kılavuzlar, ileri NS-NSCLC5 tanısında EGFR, ALK, ROS1, BRAF, NTRK, RET ve MET'in test edilmesini önermektedir. Ayrıca, yeni ilaçlar son zamanlarda klinik çalışmalarda çok umut verici sonuçlar verdiğinden, ek genomik değişiklikler kısa süre içinde BRAC1 / BRAC2, PI3KA, NRG1 ve NUT 6,7,8,9 ile birlikte KRAS ve HER2 olmak üzere bir dizi ek gende taranacaktır. Ek olarak, STK11, KEAP1 ve TP53 gibi farklı ilişkili genlerin durumu, bazı hedefe yönelik tedavilere ve/veya bağışıklık kontrol noktası inhibitörlerine (ICI'ler) yanıtın veya direncin daha iyi tahmin edilmesi için güçlü bir ilgi alanı olabilir10,11,12.

Daha da önemlisi, dikkatli klinik karar vermeyi sağlamak için moleküler değişiklikler önemli bir gecikme olmaksızın rapor edilmelidir. Bir tümörün moleküler karakterizasyonunun olmaması, immünoterapili / immünoterapisiz kemoterapi gibi hedefe yönelik olmayan tedavilerin başlatılmasına yol açabilir ve bu da EGFR mutasyonları veya gen füzyonları gibi eyleme geçirilebilir değişiklikleri olan hastalarda kemoterapi yanıtı sınırlı olduğundan, optimal olmayan bir tedavi stratejisine yol açabilir13.

Ayrıca, neoadjuvan ve/veya adjuvan ortamlarda hedefe yönelik tedavilerin/immünoterapilerin mevcut gelişimi, en azından erken evre NS-KHDAKT'de EGFR ve ALK değişikliklerinin sistematik olarak aranmasına yol açabilir, çünkü ICI'ler sadece EGFR ve ALK14 için vahşi tip tümörlerde uygulanmalıdır. Osimertinib (üçüncü nesil bir EGFR tirozin kinaz inhibitörü) EGFR-mutant NS-NSCLC15'te adjuvan tedavi olarak kullanılabildiğinden, erken evre NS-NSCLC'de EGFR mutasyonlarının varlığını test etmek de zorunludur.

NS-KHDAK hastalarında farklı hedefe yönelik tedavilere ve/veya immünoterapilere yanıtı tahmin etmede farklı biyobelirteçlerin değerlendirilmesi stratejisi hızlı ilerlemektedirve bu da bu biyobelirteçlerin tanımlanmasını sırayla zorlaştırmaktadır 3,16. Bu bağlamda, Yeni Nesil Dizileme (NGS), NS-NSCLC 5,17'deki gen değişikliklerinin yüksek verimli paralel değerlendirmesi için artık en uygun yaklaşımdır.

Bununla birlikte, NGS iş akışında ustalaşmak zor olabilir ve daha uzun TAT18,19'a kadar sürebilir. Bu nedenle, birçok merkez hala sıralı yaklaşımlar (immünohistokimya (IHC), floresan in situ hibridizasyon (FISH) ve/veya hedefe yönelik dizileme) uygulamaktadır. Bununla birlikte, bu strateji, küçük örneklem büyüklüğü durumunda ve hepsinden önemlisi, NS-NSCLC20'de test edilmesi gereken eyleme geçirilebilir mutasyon sayısının artması nedeniyle sınırlıdır. Bu nedenle, gen değişikliklerinin hızlı bir şekilde değerlendirilmesine izin veren ultra hızlı ve basit test yöntemleri, optimal klinik karar verme için giderek daha önemli hale gelmiştir. Ayrıca, moleküler testler için onaylanmış ve akredite edilmiş sistemler, spesifik hedefe yönelik tedavilerin reçetelenmesi için zorunlu hale gelmektedir.

Burada, Fransa'daki Nice Üniversite Hastanesi Klinik ve Deneysel Patoloji Laboratuvarı (LPCE) Laboratuvarı'nda kullanılan ve Fransız Akreditasyon Komitesi (COFRAC) (https://www.cofrac.fr/) tarafından ISO 15189 normuna göre akredite edilen NS-NSCLC'nin moleküler testi için ultra hızlı ve otomatik amplikon tabanlı bir DNA/RNA NGS testini açıklıyoruz. COFRAC, laboratuvar tarafından gerçekleştirilen panel ile bir dizileyici üzerinde otomatik NGS'de moleküler analizde test/kalibrasyon faaliyetleri için laboratuvarın ISO 15189 standardının gerekliliklerini ve COFRAC uygulama kurallarını yerine getirdiğini onaylar. Tanınmış uluslararası ISO 15189 standardına göre akreditasyon, laboratuvarın tanımlanmış bir kapsam için teknik yeterliliğini ve bu laboratuvarda uygun bir yönetim sisteminin düzgün bir şekilde işletildiğini gösterir. Doku biyopsi örneklerinin hazırlanmasından başlayarak raporun alınmasına kadar bu iş akışının yararları ve sınırlamaları tartışılmaktadır.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protokol

Tüm prosedürler yerel etik kurul tarafından onaylanmıştır (İnsan Araştırmaları Etik Kurulu, Centre Hospitalier Universitaire de Nice, Tumorothèque BB-0033-00025). Örneklemlerin ve üretilen verilerin kullanılması için tüm hastalardan bilgilendirilmiş onam alındı. Tüm örnekler, tıbbi bakımın bir parçası olarak 20 Eylül ve 31 Ocak 2022 tarihleri arasında LPCE'de (Nice, Fransa) NS-NSCLC tanısı alan hastalardan alındı.

1. FFPE DNA ve RNA örneklerinin otomatik saflaştırma cihazı (API) kullanılarak hazırlanması (İşlem süresi: 5 saat 15 dakika)

  1. Cihazda planlamayı çalıştırın.
    1. Cihazı açın ve kullanıcı adı ve şifre ile oturum açın (Malzeme Tablosu). Çalıştır'a, ardından Plan Ekle'ye tıklayarak ve çalıştırma planına bir ad vererek bir arıtma çalıştırma planı oluşturun.
    2. Ardından, formalinle sabitlenmiş parafine gömülü (FFPE) numunelerden DNA ve RNA'yı sıralı olarak saflaştırmak için uygun saflaştırma kitini ve protokolünü seçin. Saflaştırmadan sonra nicelemeyi etkinleştirin.
    3. Açılır listeden istediğiniz elüsyon hacmini (50 μL) seçin, ardından İleri'ye tıklayın. Çıkarılacak örnek sayısını seçin.
    4. Ardından her bir örneği seçin, Düzenle'ye tıklayın, Örnek Kimliği'ni girin ve ardından Kaydet'e tıklayın.
  2. GPI kullanarak FFPE DNA ve RNA örneklerini hazırlayın
    1. FFPE doku örnekleri hazırlayın (mikrotom ile 10 μm'lik 4 kesme kesiti) veya doğrudan FFPE blokları üzerinde makrodiseksiyon yapın. Her FFPE doku örneğini ayrılmış ve tanımlanmış FFPE örnek işleme tüplerine yerleştirin (Malzeme Tablosu).
    2. Tüplerin altındaki dokuyu toplamak için 1 dakika boyunca 2000 x g'da santrifüjleyin.
    3. Her bir FFPE numune işleme tüpüne, bir nükleik asit saflaştırma kitinden hazırlanan bir proteaz digest ana karışımı ekleyin ve 60 °C'de en az 60 dakika inkübe edin (Malzeme Tablosu). Numuneleri 90 °C'de 60 dakika inkübe edin.
    4. İnkübasyondan sonra, numuneleri oda sıcaklığında (RT) 5 dakika soğumaya bırakın.
    5. Her bir FFPE numune işleme tüpü için, iç tüpü kaldırın, sola çevirerek kilitleyin ve ardından numuneleri 2000 x g'da 10 dakika santrifüjleyin.
    6. Sağa çevirerek iç lastiklerin kilidini açın, dış lastiklerden ayırın ve atın. API'ye yüklenene kadar numuneleri dış tüplerde buz üzerinde tutun.
    7. Bir DNase sindirim ana karışımı hazırlayın ve önceden doldurulmuş FFPE DNA ve RNA saflaştırma plakasına 2 yükleyin. Ardından, hazırlanan numuneleri FFPE DNA ve RNA saflaştırma plakası 1'e (Malzeme Tablosu) yükleyin.
  3. API'de temizleme çalıştırmasını başlatın.
    1. API ekranında Çalıştır'a tıklayın, Çalıştırma Planı'nı seçin ve ardından İleri'ye tıklayın.
    2. API'yi saflaştırma çalışması için gereken gerekli sarf malzemeleri ve reaktiflerle yüklemek için ekrandaki göstergeleri izleyin (Malzeme Tablosu).
    3. Tüm reaktifler yüklendiğinde, İleri'ye tıklayın. API kapısını kapatın ve Başlat'a tıklayın.
    4. Çalışmanın sonunda, dokunmatik ekranda « boşalt » düğmesine tıklayın ve saflaştırılmış numune DNA'sını ve RNA'yı içeren 48 oyuklu nükleik asit arşiv plakasını hemen çıkarın.
    5. Niceleme sonuçlarını dışa aktarın. Plakayı kapatın ve saflaştırılmış numuneleri -80 °C'de saklayın. 96 kuyulu plakayı analiz edilecek sıralayıcıya aktarın.
  4. Bir örnek oluşturun ve bir çalıştırma oluşturun.
    1. Yazılımı açın ve oturum açın, ardından menü çubuğunda Örnekler'i seçin ve Örnek Oluştur'a tıklayın.
    2. Numunenin adını, cinsiyetini ve tümör hücrelerinin yüzdesini girin ve gerekirse gerekli alanları ve isteğe bağlı alanları doldurun.
    3. Ayrıntıları kaydedin (cinsiyet ve tümör hücrelerinin yüzdesi, kopya sayısı varyantlarını [CNV'ler] analiz etmek için önemlidir).
    4. Menü çubuğunda Sonuç için Koşular ve Nükleik Asit'i seçin.
    5. Kurulum adımında çalıştırma adını girin. Sonrakine tıkla.
    6. Tahliller adımında tahlili seçin. Sonrakine tıkla.
    7. Tahlil ile çalıştırmak için Örnekler adımındaki örnekleri seçin.
    8. Ardından, Seçili Tahliller bölmesinde Ata'yı tıklatın. Sonrakine tıkla.
    9. Numune giriş plakasındaki numune konumlarını gözden geçirin. Sonrakine tıkla.
    10. Çalıştırma planı özetini gözden geçirin ve ardından Kaydet ve Yazdır veya Kaydet'i tıklatın.

2. Sıralayıcıda otomatik NGS (İşlem süresi: 30 dk)

  1. Numune plakasını yükleyin.
    NOT: Optimal nükleik asit konsantrasyonu 0,5 ng/μL'dir. Doğrulanmış nükleik asit konsantrasyon aralığı 0.33-1 ng/μL'dir. DNA ve RNA için laboratuvarda 1 ng/μL konsantrasyonu doğrulandı.
    1. Sıralayıcı toplam 20 μL hacim gerektirir. Numune yükleme için yeterli hacim olduğundan emin olun.
    2. Ekstrakte edilmeden saflaştırma cihazının 1. aşamasına pozitif kontroller (DNA ve RNA) ve NTC (DNA ve RNA) ekleyin. Çalıştırmayı doğrulamak ve kullanılan partileri doğrulamak için her çalıştırma için DNA ve RNA kontrollerini kullanın. API çalışmasının sonunda plakaya DNA ve RNA kontrolleri ekleyin.
  2. Sıralayıcıyı yükleyin ve bir çalıştırma başlatın.
    1. Tüm reaktifleri buzdolabındaki veya derin dondurucudaki kutularından çıkarın ve RT'de en az 30 dakika (Malzeme Tablosu) ve maksimum 12 saat çözdürün.
    2. Laboratuvarda, yerinde eğitim sırasında tedarikçi tarafından verilen tavsiyelere uyarak sıralayıcıyı her zaman AÇIK tutun. Sistemde oturum açın.
    3. Plakayı bir yapışkan PCR plaka folyosu (Malzeme Tablosu) tabakası ile kapattıktan sonra, numuneleri içeren saflaştırma cihazından plakayı yükleyin.
    4. Tüm sarf malzemelerini güverteye takın. Sıralayıcı, gerekli her sarf malzemesini vurgulanmış bir konumda (Malzeme Tablosu) yüklemek için adım adım talimatlar sağlar.
    5. Strip 2-HD'nin 3. tüpünde çökelme olmadığını kontrol edin. Gerekirse çökeltiyi çözmek için tüpü hafifçe vurun veya şeridi hafifçe girdaplayın.
    6. Şerit 1 ve Şerit 3 manyetik boncuklar içerir. Bu adım çok kritiktir: boncukların yeniden askıya alındığından emin olun. Tüpün üst kısmında boncuk kalmamalıdır.
    7. Boncukları çıkarmak için şeridi 3-4 kez ters çevirin ve geriye doğru çevirin. Şerit contası yukarı bakacak şekilde şeridi bir ucundan tutun. Daha sonra, hızlı, santrifüjlü bir kol hareketi kullanarak şeridi hızla aşağı doğru çevirin ve bileğinize keskin bir fiske vurarak bitirin.
    8. 15 saniye boyunca 300 x g'da santrifüjleyin. Gerekirse tekrarlayın. Şeritlerin üst kısmındaki bilye kalıntıları ile bağlantılı olarak rastgele gözlemlenen arızaları en aza indirmek için şeritleri adaptörler ve şerit tutucularla santrifüjleyin.
    9. Sistemi kapatın ve İleri'ye tıklayın. Sıralama reaktifleri bölme kapılarını takın (Malzeme Tablosu). Kapıyı kapat. Sıralayıcı çalıştırmayı otomatik olarak başlatır.
  3. Temizleme
    1. Koşu sonrası temizlik için, çalışma tamamlandığında Next'e tıklayınız.
    2. Kapı art arda açılır. Atıkları boşaltmak ve tüm sarf malzemelerini çıkarmak için ekrandaki talimatları izleyin. Sonrakine tıkla.
    3. İşiniz bittiğinde desteyi kapatın, İleri'ye tıklayın. 2 dakikalık bir UV temizliği başlar. Sıralayıcı yeni bir çalıştırma başlatmaya hazırdır.

3. Entegre yazılım kullanılarak sonuçların analizi (Hastaya göre analiz süresi [numuneler ADN ve ARN]: 15 dk)

NOT: Teknik, Fransız Akreditasyon Komitesi (COFRAC) ISO 15189 (https://www.cofrac.fr/) tarafından akredite edilmiştir.

  1. Veriler ve sonuçlar
    1. Sonuçlar menüsünde bir çalıştırma sonucu veya örnek bir sonuç seçin. Sonuçlar/Çalıştırma Sonuçları ekranında, tüm çalıştırmalar listelenir.
    2. Bir sütun başlığında filtre uygulayarak sonuç listesinde arama yapın.
    3. Sonuçlar'a ve Örnek Sonuçlar'a tıklayın. Ardından, benzersiz bir örneğin sıralama sonuçlarını görüntülemek için örnek adı sütununda ilgilenilen örneğin adını tıklatın.
    4. Ekranın sol üst köşesindeki Sütunlar'a tıklayın veya tablodaki sütunların seçimini kaldırın.
  2. QC sonuçlarını görüntüleyin ve amplikon kapsamını görüntüleyin.
    1. Sonuçlar ekranındaki QC sekmesine tıklayın.
    2. DNA için, kopya sayısı varyantları (CNV) analizini doğrulamak için medyan mutlak ikili farklılıkların (MAPAD'ler) 0 ile 0,5 arasında olduğundan emin olun. Eşlenen okumalar 1,5 milyondan büyük olmalıdır.
    3. RNA için, eşlenen okumaların 150.000 ile 400.000 arasında olup olmadığını kontrol edin. Bunun altında, yanlış negatif riski vardır ve bunun ötesinde yanlış pozitif riski vardır.
    4. Önemli Bulgular sekmesini açmak için örnek bir adı tıklatın.
    5. Amplikon Kapsama Grafikleri'ne gidin.
    6. Kapsam grafiklerini gözden geçirin. Tedarikçi sağlamadığı için amplikon kapsamı için minimum eşiği tanımlayın. Bir aralık ve eşik tanımlamak için, bir denetim ve bir vahşi tip (WT) örneğini karıştırın. Ardından, seçilen bir veya daha fazla mutasyon için amplikon kapsamının en küçük değerini gözlemleyin.
  3. Varyasyon sonuçlarını görüntüleyin.
    1. Verileri tablo biçiminde dışa aktarmak için, ekranın sağ üst köşesindeki Dışa Aktar'a tıklayın.
    2. Tek nükleotis varyantı/ekleme-silme varyantı (SNV/INDEL) sonucunu görüntülemek için Varyantlar sekmesine tıklayın, ardından SNV'ler/Indels'e tıklayın. Filtreleri Düzenle'ye tıklayın ve Filtre Yok'u seçin.
      NOT: Duyarlılık eşiği INCA (Fransız Ulusal Kanser Enstitüsü) grubunun (https://www.e-cancer.fr/Professionnels-de-sante/Les-therapies-ciblees/Les-plateformes-de-genetique-moleculaire-des-cancers/Le-programme-d-assurance-qualite-des-plateformes) önerilerine göre %5 olarak tanımlanmıştır.
    3. Füzyon sonuçlarını görüntüleme ve RNA Ekzon Varyantlarını görüntüleme: Varyantlar sekmesini tıklayın, ardından Füzyonlar'ı tıklayın.
    4. Sağ üstte, Görselleştirme ve RNA Ekzon Varyantı'na tıklayın, ardından RNA Ekzon Varyantları grafiğini inceleyin.
    5. Bu kit ile EGFR, MET ve AR genlerinin ekzon atlaması tespit edilebilir. Görselleştirme'ye tıklayın; analiz etmek daha kolaydır.
    6. RNA ekzon karo füzyon dengesizliğini görüntüleme: Varyasyonlar sekmesini, ardından Füzyonlar'ı tıklayın.
    7. Sağ üstte, Görselleştirme ve RNA Ekzon Karo Füzyon Dengesizliği'ni tıklayın, ardından RNA Ekzon Karo Füzyon Dengesizliği grafiklerini inceleyin. Dengesizlik füzyonu, bilinen bir partner ile panel tarafından kapsanmayan bir partner arasındaki bir füzyondur.
    8. CNV sonuçlarını görüntüleme: Verileri görüntülemek için Varyasyonlar sekmesinde CNV'lere tıklayın.
      NOT: Cinsiyete ait örneklerin hazırlanması sırasında CNV sonuçları ve örneğin tümör hücrelerinin yüzdesi hakkında bilgi vererek uyanık olmak gerekir. AR geni sadece X kromozomu tarafından taşınır. Cinsiyet belirtilmezse, erkek cinsiyet kayıplarla karşılaşabilir ve bu da erkek hastalarda yanlış pozitif sonuçlara yol açabilir.
  4. Eklenti sonuçlarını inceleyin.
    1. Kapsam Analizi eklentisi sonuçlarını gözden geçirin: Sağ üstte, tıklayın ve dosyaları indir'i seçin.
    2. Kapsam Analizi eklentisi bir Kapsam Analizi Raporu oluşturur.
    3. Moleküler Kapsam Analizi eklentisinin sonuçlarını inceleyin: Sağ üstte, tıklayın ve dosyaları indir'i seçin. Bu analiz, tüm amplikonların kapsanıp kapsanmadığını doğrular ve yazılım tarafından sağlanan kopya sayısı varyantları (CNV'ler) sonuçlarını doğrular.
  5. Tahlil ölçümlerini ve çalıştırma raporunu görüntüleme
    1. Çalıştırma Özeti'ndeki Raporu Çalıştır sekmesine tıklayın.
    2. Raporu Çalıştır'ı görüntülemek için, açılır menüden Örnek Seç seçeneğini belirleyin.
    3. Tahlil ölçümleri ve çalıştırma raporu: Ekranın üst kısmında sıralama ölçümlerini ve ardından Çalıştırma Örnekleri tablosunda örneğe özgü ölçümleri bulun.
      NOT: Müşteri destek arşivi (CSA) dosyasındaki bilgiler sonuçlarla ilgili sorunları gidermeye yardımcı olabilir, ancak bunlar doğrudan analiz edilemez. CSA dosyaları, tüm çalıştırma verilerinin verilerini özetler ve başarısız bir çalıştırma durumunda bir sorunun nedenlerini vurgular.
    4. Çalıştırma raporunu indirme: Raporlar sekmesini tıklayın.
    5. Çalıştırma raporu özetini PDF formatında indirmek için Raporu İndir'e tıklayın.
  6. Varyant raporu oluşturun.
    1. Bir çalıştırmanın veri analizi sırasında her örnek için otomatik olarak bir varyant raporu oluşturmak için Kurulum adımında Rapor Oluştur'u etkinleştirin.
    2. Bir örnek için varyant raporu oluşturulduktan sonra, sistem raporu iki yerde kullanılabilir hale getirir: İlk olarak, Sonuçlar/Örnek Sonuçlar ekranında bir bağlantı sağlanır. PDF'yi indirmek için bağlantıya tıklayın.
    3. İkinci olarak, Raporlar sekmesindeki Varyant Raporu bölmesine gidin ve Raporu İndir düğmesine tıklayın. Varyasyon raporlarını elektronik veya manuel olarak imzalayın.
      NOT: Elektronik olarak imzalanan raporlarda, Örnek Sonuçlar ekranındaki örnek adından sonra (Oturumu kapat) ifadesi bulunur.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Sonuçlar

Burada sunulan ve son yayınlarımızda21 ayrıntılı olarak açıklanan prosedürü kullanarak, ultra hızlı amplikon tabanlı yeni nesil dizileme yaklaşımı kullanarak NS-KHDAK hastalarında tanı için rutin olarak gerçekleştirilen klinik uygulamada bir refleks testi olarak moleküler değişikliğin değerlendirilmesi için optimal bir iş akışı geliştirdik. Yöntemin moleküler iş akışı Şekil 1'de gösterilmiştir. Panelde yer alan genlerin listesi...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Tartışmalar

NS-NSLC'nin herhangi bir evresinde tanı konulduğunda moleküler değişiklik değerlendirmesi için refleks testi olarak ultra hızlı amplikon tabanlı bir NGS yaklaşımının geliştirilmesi, NS-NSCLC 5,22,23'te kılavuz tarafından önerilen ve ortaya çıkan tüm biyobelirteçlerin saptanması için en uygun seçenektir. Ardışık yöntemler (IHC, PCR, FISH) yalnızca belirli genlere odaklanır ve doku materyalinin tüke...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Açıklamalar

Christophe Bontoux, ücretli konuşmacı etkinliklerine katılır ve Thermo Fisher Scientific'ten yararlanır. Paul Hofman, ücretli konuşmacı etkinliklerine katılır ve Thermo Fisher Scientific'ten fayda ve fon alır.

Teşekkürler

Thermo Fisher Scientific'e bize cihazlarını ve malzemelerini kullanma imkanı verdiği için teşekkür ederiz.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
96 well hard shell plate clearThermo Fisher Scientific (Waltham, Massachusetts, USA)4483354
Adhesive PCR Plate FoilThermo Fisher Scientific (Waltham, Massachusetts, USA)AB0626
AutoLys M tube Thermo Fisher Scientific (Waltham, Massachusetts, USA)A38738FFPE sample processing tubes
Genexus Barcodes 1-32 HDThermo Fisher Scientific (Waltham, Massachusetts, USA)A40261
Genexus GX5 Chip and Genexus CouplerThermo Fisher Scientific (Waltham, Massachusetts, USA)A40269
Genexus Pipette TipsThermo Fisher Scientific (Waltham, Massachusetts, USA)A40266
Genexus Purification InstrumentThermo Fisher Scientific (Waltham, Massachusetts, USA)A48148Automated purification instrument (API)
Genexus Sequencing KitThermo Fisher Scientific (Waltham, Massachusetts, USA)A40271
Genexus Templating Strips 3-GX5 and 4Thermo Fisher Scientific (Waltham, Massachusetts, USA)A40263
Genexus Integrated SequencerThermo Fisher Scientific (Waltham, Massachusetts, USA)A45727
Ion Torrent  Genexus FFPE DNA/RNA Purification Combo KitThermo Fisher Scientific (Waltham, Massachusetts, USA)A45539
Oncomine  Precision Assay GX (OPA) Panel (included Strips 1 and 2-HD)Thermo Fisher Scientific (Waltham, Massachusetts, USA)A46291

Referanslar

  1. Howlader, N., et al. The effect of advances in lung-cancer treatment on population mortality. New England Journal of Medicine. 383 (7), 640-649 (2020).
  2. Melosky, B., et al. The rapidly evolving landscape of novel targeted therapies in advanced non-small cell lung cancer. Lung Cancer. 160, 136-151 (2021).
  3. Hanna, N. H., et al. Therapy for stage IV non-small-cell lung cancer with driver alterations: ASCO and OH (CCO) joint guideline update. Journal of Clinical Oncology. 39 (9), 1040-1091 (2021).
  4. Kerr, K. M., et al. The evolving landscape of biomarker testing for non-small cell lung cancer in Europe. Lung Cancer. 154, 161-175 (2021).
  5. Mosele, F., et al. Recommendations for the use of next-generation sequencing (NGS) for patients with metastatic cancers: a report from the ESMO precision medicine working group. Annals of Oncology. 31 (11), 1491-1505 (2020).
  6. Kazdal, D., Hofman, V., Christopoulos, P., Ilié, M., Stenzinger, A., Hofman, P. Fusion-positive non-small cell lung carcinoma: Biological principles, clinical practice, and diagnostic implications. Genes Chromosomes and Cancer. 61 (5), 244-260 (2022).
  7. Li, B. T., et al. Trastuzumab deruxtecan in HER2 -mutant non-small-cell lung cancer. New England Journal of Medicine. 386 (3), 241-251 (2022).
  8. Bontoux, C., Hofman, V., Brest, P., Ilié, M., Mograbi, B., Hofman, P. Daily practice assessment of KRAS status in NSCLC patients: A new challenge for the thoracic pathologist is right around the corner. Cancers. 14 (7), 1628(2022).
  9. Skoulidis, F., et al. Sotorasib for lung cancers with KRAS p.G12C mutation. New England Journal of Medicine. 384 (25), 2371-2381 (2021).
  10. Hellyer, J. A., et al. Impact of tumor suppressor gene co-mutations on differential response to EGFR TKI therapy in EGFR L858R and Exon 19 deletion lung cancer. Clinical Lung Cancer. 23 (3), 264-272 (2022).
  11. Mograbi, B., Heeke, S., Hofman, P. The importance of stk11/lkb1 assessment in non-small cell lung carcinomas. Diagnostics. 11 (2), 196(2021).
  12. Nadal, E., et al. Two patients with advanced-stage lung adenocarcinoma with radiologic complete response to nivolumab treatment harboring an STK11/LKB1 mutation. JCO Precision Oncology. 4, 1239-1245 (2022).
  13. Smeltzer, M. P., et al. The international association for the study of lung cancer global survey on molecular testing in lung cancer. Journal of Thoracic Oncology. 15 (9), 1434-1448 (2020).
  14. Ahern, E., Solomon, B. J., Hui, R., Pavlakis, N., O'Byrne, K., Hughes, B. G. M. Neoadjuvant immunotherapy for non-small cell lung cancer: Right drugs, right patient, right time. Journal for ImmunoTherapy of Cancer. 9 (6), e002248(2021).
  15. Wu, Y. -L., et al. Osimertinib in resected EGFR-mutated non-small-cell lung cancer. New England Journal of Medicine. 383 (18), 1711-1723 (2020).
  16. Hanna, N. H., et al. Therapy for stage IV non-small-cell lung cancer without driver alterations: ASCO and OH (CCO) joint guideline update. J Clin Oncol. 38 (14), 1608-1632 (2020).
  17. de Maglio, G., et al. The storm of NGS in NSCLC diagnostic-therapeutic pathway: How to sun the real clinical practice. Critical Reviews in Oncology/Hematology. 169, 103561(2022).
  18. DiStasio, M., Chen, Y., Rangachari, D., Costa, D. B., Heher, Y. K., VanderLaan, P. A. Molecular testing turnaround time for non-small cell lung cancer in routine clinical practice confirms feasibility of CAP/IASLC/AMP guideline recommendations: A single-center analysis. Clinical Lung Cancer. 18 (5), e349-e356 (2017).
  19. Heeke, S., et al. Use of the ion PGM and the genereader NGS systems in daily routine practice for advanced lung adenocarcinoma patients: A practical point of view reporting a comparative study and assessment of 90 patients. Cancers. 10 (4), 88(2018).
  20. Hofman, P. The challenges of evaluating predictive biomarkers using small biopsy tissue samples and liquid biopsies from non-small cell lung cancer patients. Journal of Thoracic Disease. 11, S57-S64 (2019).
  21. Ilié, M., et al. Setting up an ultra-fast next-generation sequencing approach as reflex testing at diagnosis of non-squamous non-small cell lung cancer; experience of a single center (LPCE, Nice, France). Cancers. 14 (9), 2258(2022).
  22. Zacharias, M., et al. Reflex testing in non-small cell lung carcinoma using DNA-and RNA-based next-generation sequencing-a single-center experience. Translational Lung Cancer Research. 10 (11), 4221-4234 (2021).
  23. Miller, T. E., et al. Clinical utility of reflex testing using focused nextgeneration sequencing for management of patients with advanced lung adenocarcinoma. Journal of Clinical Pathology. 71 (12), 1108-1115 (2018).
  24. Al-Ahmadi, A., et al. Next generation sequencing of advanced non-small cell lung cancer: utilization based on race and impact on survival. Clinical Lung Cancer. 22 (1), 16.e1-22.e1 (2021).
  25. Kim, J. H., Yoon, S., Lee, D. H., Jang, S. J., Chun, S. M., Kim, S. W. Real-world utility of next-generation sequencing for targeted gene analysis and its application to treatment in lung adenocarcinoma. Cancer Medicine. 10 (10), 3197-3204 (2021).
  26. Sheffield, B. S., et al. Point of care molecular testing: Community-based rapid next-generation sequencing to support cancer care. Current Oncology. 29 (3), 1326-1334 (2022).
  27. Camidge, D. R., Doebele, R. C., Kerr, K. M. Comparing and contrasting predictive biomarkers for immunotherapy and targeted therapy of NSCLC. Nature Reviews Clinical Oncology. 16 (6), 341-355 (2019).
  28. Rosas, D., Raez, L. E., Russo, A., Rolfo, C. Neuregulin 1 gene (Nrg1). A potentially new targetable alteration for the treatment of lung cancer. Cancers. 13 (20), 5038(2021).
  29. Shapiro, G. I., et al. A Phase 1 study of RO6870810, a novel bromodomain and extra-terminal protein inhibitor, in patients with NUT carcinoma, other solid tumours, or diffuse large B-cell lymphoma. British Journal of Cancer. 124 (4), 744-753 (2021).
  30. Schoenfeld, A. J., et al. The genomic landscape of SMARCA4 alterations and associations with outcomes in patients with lung cancer. Clinical Cancer Research. 26 (21), 5701-5708 (2021).
  31. Zhang, K., et al. Identification of deleterious NOTCH mutation as novel predictor to efficacious immunotherapy in NSCLC. Clinical Cancer Research. 26 (14), 3649-3661 (2020).
  32. Shen, C. I., et al. Real-world evidence of the intrinsic limitations of PCR-based EGFR mutation assay in non-small cell lung cancer. Scientific Reports. 12 (1), 13566(2022).
  33. Zou, D., et al. Diagnostic value and cost-effectiveness of next-generation sequencing-based testing for treatment of patients with advanced/metastatic non-squamous non-small-cell lung cancer in the United States. Journal of Molecular Diagnostics. 24 (8), 901-914 (2022).
  34. Zhong, Y., Xu, F., Wu, J., Schubert, J., Li, M. M. Application of next generation sequencing in laboratory medicine. Annals of Laboratory Medicine. 41 (1), 25-43 (2020).
  35. Bruno, R., Fontanini, G. Next generation sequencing for gene fusion analysis in lung cancer: A literature review. Diagnostics. 10 (8), 521(2020).
  36. Hofman, V., et al. Ultra-fast gene fusion assessment for non-squamous non-small cell lung cancer. JTO Clinical and Research Reports. 4 (2), 100457(2022).
  37. Horgan, D., et al. Personalized medicine perspective identifying the steps required to effectively implement next-generation sequencing in oncology at a national level in Europe. Journal of Personalized Medicine. 12 (1), 72(2022).
  38. Cohen, D., et al. Optimizing mutation and fusion detection in NSCLC by sequential DNA and RNA sequencing. Journal of Thoracic Oncology. 15 (6), 1000-1014 (2020).
  39. Goswami, R. S., et al. Identification of factors affecting the success of next-generation sequencing testing in solid tumors. American Journal of Clinical Pathology. 145 (2), 222-237 (2016).
  40. Ilie, M., Hofman, P. Pitfalls in Lung Cancer Molecular Pathology: How to Limit them in Routine Practice. Current Medicinal Chemistry. 19 (16), 2638-2651 (2012).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

Ultra H zl Amplikon Tabanl Yeni Nesil DizilemeSkuam z Olmayan K k H creli D Akci er KanseriMolek ler De i ikliklerHedefe Y nelik TedaviMolek ler Anormalliklerin Saptanmasleri Veya Metastatik NS KHDAK TedavisiHedefe Y nelik TedavilerGenel Sa kal mDiren MekanizmalarYeni TedavilerTedavi Yan tMolek ler KarakterizasyonK sa Geri D n S resi TATUluslararas K lavuzlarDoku BiyopsileriGenomik AnalizDaha Az nvaziv Y ntemler ve ProtokollerPatologlarEtkili ve H zl Tan Stratejisi

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır