Séquençage ultra-rapide de nouvelle génération basé sur l’amplicon dans le cancer du poumon non épidermoïde non à petites cellules

Résumé

L’augmentation du nombre de biomarqueurs moléculaires à tester pour la prise en charge du cancer du poumon non à petites cellules non épidermoïde (NS-NSCLC) a entraîné la mise au point de méthodes de détection moléculaire rapides et fiables. Nous décrivons un flux de travail pour l’évaluation de l’altération génomique chez les patients atteints de NS-CPNPC à l’aide d’une approche de séquençage ultra-rapide de nouvelle génération (NGS).

Résumé

Le nombre d’altérations moléculaires à tester pour le traitement ciblé des patients atteints d’un cancer du poumon non à petites cellules non épidermoïde (NS-CPNPC) a considérablement augmenté ces dernières années. La détection d’anomalies moléculaires est obligatoire pour la prise en charge optimale des patients atteints de NS-NSCLC avancés ou métastatiques, ce qui permet d’administrer des thérapies ciblées avec une amélioration de la survie globale. Néanmoins, ces tumeurs développent des mécanismes de résistance qui sont potentiellement ciblables à l’aide de nouvelles thérapies. Certaines altérations moléculaires peuvent également moduler la réponse au traitement. La caractérisation moléculaire du NS-NSCLC doit être réalisée dans un délai d’exécution court (TAT), en moins de 10 jours ouvrables, comme le recommandent les directives internationales. De plus, l’origine des biopsies tissulaires pour l’analyse génomique est diverse, et leur taille ne cesse de diminuer avec le développement de méthodes et de protocoles moins invasifs. Par conséquent, les pathologistes sont mis au défi d’effectuer des techniques moléculaires efficaces tout en maintenant une stratégie de diagnostic efficace et rapide. Nous décrivons ici le flux de travail ultra-rapide de séquençage de nouvelle génération (NGS) basé sur l’amplicon utilisé dans la pratique quotidienne de routine au moment du diagnostic chez les patients atteints de NS-NSCLC. Nous avons montré que ce système est capable d’identifier les cibles moléculaires actuelles utilisées en médecine de précision en oncologie thoracique dans un TAT approprié.

Introduction

Au cours de la dernière décennie, le développement de thérapies ciblées et d’immunothérapies a considérablement augmenté la survie globale (SG) du cancer du poumon non épidermoïde non à petites cellules (NS-CPNPC)^1,2. À cet égard, le nombre de gènes et de cibles moléculaires obligatoires à analyser lors du traitement du CPNPC a augmenté au cours des dernières années ^3,4.

Les lignes directrices internationales actuelles recommandent de tester l’EGFR, l’ALK, le ROS1, le BRAF, le NTRK, le RET, le MET et le MET lors du diagnostic du NS-NSCLC⁵ avancé. De plus, comme de nouveaux médicaments ont récemment donné des résultats très prometteurs dans les essais cliniques, d’autres altérations génomiques seront prochainement criblées dans un certain nombre de gènes supplémentaires, notamment KRAS et HER2, ainsi que BRAC1/BRAC2, PI3KA, NRG1 et NUT 6,7,8,9. De plus, le statut de différents gènes associés, tels que STK11, KEAP1 et TP53, peut être d’un grand intérêt pour une meilleure prédiction de la réponse ou de la résistance à certaines thérapies ciblées et/ou inhibiteurs de points de contrôle immunitaires (ICI)10,11,12.

Il est important de noter que les altérations moléculaires doivent être signalées sans délai significatif afin d’assurer une prise de décision clinique prudente. L’absence de caractérisation moléculaire d’une tumeur peut conduire à l’instauration de thérapies non ciblées telles que la chimiothérapie avec/sans immunothérapie, conduisant à une stratégie de traitement sous-optimale, car la réponse à la chimiothérapie est limitée chez les patients présentant des altérations exploitables, telles que des mutations de l’EGFR ou des fusions de gènes¹³.

De plus, le développement actuel de thérapies/immunothérapies ciblées dans des contextes néoadjuvants et/ou adjuvants pourrait conduire à rechercher systématiquement, au moins, des altérations de l’EGFR et de l’ALK dans le NS-NSCLC à un stade précoce, car les ICI ne devraient être administrées que dans les tumeurs de type sauvage pour l’EGFR et l’ALK¹⁴. Il est désormais également obligatoire de tester la présence de mutations de l’EGFR dans le NS-NSCLC à un stade précoce, car l’osimertinib (un inhibiteur de la tyrosine kinase de l’EGFR de troisième génération) peut être utilisé comme traitement adjuvant dans le NS-NSCLC¹⁵ mutant de l’EGFR.

La stratégie d’évaluation des différents biomarqueurs pour prédire la réponse à différentes thérapies ciblées et/ou immunothérapies chez les patients atteints de NS-CPNPC évolue rapidement, ce qui rend l’identification de ces biomarqueurs séquentiellement difficile ^3,16. À cet égard, le séquençage de nouvelle génération (NGS) est maintenant l’approche optimale pour l’évaluation parallèle à haut débit des altérations génétiques dans le NS-NSCLC ^5,17.

Cependant, le flux de travail NGS peut être difficile à maîtriser et peut conduire à un TAT^18,19 plus long. Ainsi, de nombreux centres pratiquent encore des approches séquentielles (immunohistochimie (IHC), hybridation in situ par fluorescence (FISH) et/ou séquençage ciblé). Cependant, cette stratégie est limitée dans le cas d’un échantillon de petite taille et, surtout, en raison de l’augmentation du nombre de mutations exploitables qui doivent être testées dans le NS-CPNPC²⁰. Ainsi, les méthodes de test ultra-rapides et simples permettant l’évaluation rapide des altérations génétiques sont devenues de plus en plus importantes pour une prise de décision clinique optimale. De plus, les systèmes approuvés et accrédités pour les tests moléculaires deviennent obligatoires pour la prescription de thérapies ciblées spécifiques.

Nous décrivons ici un test NGS ADN/ARN ultra-rapide et automatisé à base d’amplicon pour les tests moléculaires du NS-NSCLC qui est utilisé dans le Laboratoire de Pathologie Clinique et Expérimentale (LPCE) du CHU de Nice, France et qui est accrédité selon la norme ISO 15189 par le Comité Français d’Accréditation (COFRAC) (https://www.cofrac.fr/). Le COFRAC certifie que le laboratoire répond aux exigences de la norme ISO 15189 et des règles d’application COFRAC pour les activités d’essais/étalonnage en analyse moléculaire en NGS automatisé sur séquenceur avec le panel réalisé par le laboratoire. L’accréditation selon la norme internationale reconnue ISO 15189 atteste de la compétence technique du laboratoire pour un périmètre défini et du bon fonctionnement d’un système de management approprié dans ce laboratoire. Les avantages et les limites de ce flux de travail, depuis la préparation des échantillons de biopsie tissulaire jusqu’à l’obtention du rapport, sont discutés.

Protocole

Toutes les procédures ont été approuvées par le comité d’éthique local (Comité d’éthique de la recherche humaine, Centre Hospitalier Universitaire de Nice, Tumorothèque BB-0033-00025). Le consentement éclairé de tous les patients a été obtenu pour l’utilisation d’échantillons et de données générées. Tous les échantillons ont été prélevés sur des patients diagnostiqués avec NS-NSCLC à LPCE (Nice, France) entre le 20 septembre et le 31 janvier 2022 dans le cadre des soins médicaux.

1. Préparation d’échantillons d’ADN et d’ARN FFPE à l’aide d’un instrument de purification automatisé (API) (Temps de traitement : 5 h 15 min)

1. Exécuter la planification sur l’instrument.
   1. Allumez l’instrument et connectez-vous avec le nom d’utilisateur et le mot de passe (Table des matériaux). Créez un plan d’exécution de purification en cliquant sur Exécuter, puis sur Ajouter un plan et en donnant un nom au plan d’exécution.
   2. Ensuite, sélectionnez le kit de purification et le protocole appropriés pour la purification séquentielle de l’ADN et de l’ARN à partir d’échantillons de paraffine fixés au formol (FFPE). Activer la quantification après purification.
   3. Sélectionnez le volume d’élution souhaité (50 μL) dans la liste déroulante, puis cliquez sur Suivant. Sélectionnez le nombre d’échantillons à extraire.
   4. Sélectionnez ensuite chaque échantillon, cliquez sur Modifier, entrez l’ID de l’échantillon, puis cliquez sur Enregistrer.
2. Préparer des échantillons d’ADN et d’ARN FFPE à l’aide de GPI
   1. Préparer des échantillons de tissus FFPE (4 coupes de 10 μm avec un microtome) ou réaliser une macrodissection directement sur des blocs FFPE. Placer chaque échantillon de tissu FFPE dans des tubes de traitement d’échantillons FFPE séparés et identifiés (tableau des matériaux).
   2. Centrifuger à 2000 x g pendant 1 min pour recueillir le tissu au fond des tubes.
   3. Ajouter à chaque tube de traitement d’échantillons FFPE un mélange maître de digestion de protéase préparé à partir d’un kit de purification d’acides nucléiques et incuber à 60 °C pendant au moins 60 min (Table des matériaux). Incuber les échantillons à 90 °C pendant 60 min.
   4. Après incubation, laisser refroidir les échantillons pendant 5 minutes à température ambiante (RT).
   5. Pour chaque tube de traitement d’échantillons FFPE, soulevez le tube intérieur, verrouillez-le en tournant à gauche, puis centrifugez les échantillons à 2000 x g pendant 10 min.
   6. Déverrouillez les chambres à air en tournant à droite, séparez-les des chambres à air extérieures et jetez-les. Conservez les échantillons dans les tubes extérieurs sur de la glace jusqu’à leur chargement sur l’API.
   7. Préparez un mélange maître de digestion DNase et chargez-le dans une plaque de purification d’ADN et d’ARN FFPE préremplie 2. Ensuite, chargez les échantillons préparés dans la plaque de purification d’ADN et d’ARN FFPE 1 (Table des matériaux).
3. Démarrez l’exécution de purification sur l’API.
   1. Sur l’écran de l’API, cliquez sur Exécuter, sélectionnez le plan d’exécution, puis cliquez sur Suivant.
   2. Suivez les indications à l’écran pour charger l’API avec les consommables et réactifs nécessaires au cycle de purification (tableau des matériaux).
   3. Lorsque tous les réactifs sont chargés, cliquez sur Suivant. Fermez la porte de l’API et cliquez sur Démarrer.
   4. À la fin de l’exécution, cliquez sur « décharger » sur l’écran tactile et retirez immédiatement la plaque d’archive d’acides nucléiques à 48 puits contenant l’échantillon purifié d’ADN et d’ARN.
   5. Exportez les résultats de quantification. Sceller la plaque et conserver les échantillons purifiés à -80 °C. Transférez la plaque à 96 puits dans le séquenceur à analyser.
4. Créez un exemple et créez une exécution.
   1. Ouvrez le logiciel et connectez-vous, puis choisissez dans la barre de menus Exemples et cliquez sur Créer un échantillon.
   2. Entrez le nom de l’échantillon, le sexe et le pourcentage de cellules tumorales, et remplissez les champs obligatoires et facultatifs si nécessaire.
   3. Enregistrez les détails (le sexe et le pourcentage de cellules tumorales sont importants pour l’analyse des variantes du nombre de copies [CNV]).
   4. Choisissez Exécutions et Acide nucléique à obtenir dans la barre de menus.
   5. Entrez le nom de l’exécution à l’étape Configuration . Cliquez sur Suivant.
   6. Sélectionnez le test à l’étape Analyses . Cliquez sur Suivant.
   7. Sélectionnez les échantillons à l’étape Echantillons à exécuter avec le test.
   8. Ensuite, dans la fenêtre Selected Assays (Tests sélectionnés ), cliquez sur Assigner (Attribuer). Cliquez sur Suivant.
   9. Examinez les positions des échantillons sur la plaque d’entrée de l’échantillon. Cliquez sur Suivant.
   10. Passez en revue le récapitulatif du plan d’exécution, puis Enregistrer et imprimer ou Enregistrer.

2. NGS automatisé sur le séquenceur (Temps de traitement : 30 min)

1. Chargez la plaque d’échantillonnage.
   REMARQUE : La concentration optimale d’acides nucléiques est de 0,5 ng/μL. La plage de concentration d’acides nucléiques validée est de 0,33 à 1 ng/μL. Pour l’ADN et l’ARN, une concentration de 1 ng/μL a été validée en laboratoire.
   1. Le séquenceur nécessite un volume total de 20 μL. Assurez-vous qu’il y a suffisamment de volume pour le chargement de l’échantillon.
   2. Ajouter des témoins positifs (ADN et ARN) et NTC (ADN et ARN) à la 1ère étape de l’instrument de purification sans être extrait. Utilisez des contrôles d’ADN et d’ARN pour chaque essai afin de valider le cycle et de valider les lots utilisés. Ajoutez des contrôles d’ADN et d’ARN à la plaque à la fin de l’exécution de l’API.
2. Chargez le séquenceur et lancez une exécution.
   1. Retirer tous les réactifs de leur boîte au réfrigérateur ou au congélateur et les décongeler à RT pendant une période minimale de 30 min (Table des matériaux) et maximale de 12 h.
   2. Dans le laboratoire, gardez le séquenceur toujours allumé en suivant les conseils donnés par le fournisseur lors de la formation sur site. Connectez-vous au système.
   3. Chargez la plaque à partir de l’instrument de purification, qui contient des échantillons, après avoir scellé la plaque avec une feuille de feuille adhésive pour plaque PCR (Table des matériaux).
   4. Installez tous les consommables dans le pont. Le séquenceur fournit des instructions étape par étape pour charger chaque consommable requis dans une position en surbrillance (Table des matériaux).
   5. Vérifiez qu’il n’y a pas de précipitations sur le tube 3 de la bande 2-HD. Faites glisser le tube ou faites doucement vortex la bande pour dissoudre le précipité si nécessaire.
   6. Les bandes 1 et 3 contiennent des billes magnétiques. Cette étape est très critique : assurez-vous que les billes sont remises en suspension. Il ne devrait plus y avoir de perles dans la partie supérieure du tube.
   7. Retournez la bande et retournez-la 3 à 4 fois pour retirer les perles. Tenez la bande à une extrémité avec le joint de la bande orienté vers le haut. Ensuite, faites pivoter rapidement la bande vers le bas à l’aide d’un mouvement rapide du bras centrifuge et terminez en donnant un coup sec du poignet.
   8. Centrifugeuse à 300 x g pendant 15 s. Répétez l’opération si nécessaire. Centrifuger les bandes à l’aide d’adaptateurs et de porte-bandes afin de minimiser les défaillances observées de manière aléatoire en relation avec les résidus de billes dans la partie supérieure des bandes.
   9. Fermez le système et cliquez sur Suivant. Installez les portes de la baie des réactifs de séquençage (Table des matériaux). Ferme la porte. Le séquenceur démarre automatiquement l’exécution.
3. Nettoyage
   1. Pour le nettoyage après l’exécution, une fois l’exécution terminée, cliquez sur Suivant.
   2. La porte s’ouvre successivement. Suivez les instructions à l’écran pour vider les déchets et retirer tous les consommables. Cliquez sur Suivant.
   3. Fermez le jeu lorsque vous avez terminé, cliquez sur Suivant. Un nettoyage UV de 2 min commence. Le séquenceur est prêt à démarrer une nouvelle exécution.

3. Analyse des résultats à l’aide du logiciel intégré (Temps d’analyse par patient [échantillons ADN et ARN] : 15 min)

NOTE : La technique est accréditée par le Comité Français d’Accréditation (COFRAC) ISO 15189 (https://www.cofrac.fr/)

1. Données et résultats
   1. Sélectionnez un résultat d’exécution ou un exemple de résultat dans le menu Résultats . Dans l’écran Résultats/Résultats de l’exécution , toutes les exécutions sont répertoriées.
   2. Effectuez une recherche dans la liste des résultats en filtrant dans un en-tête de colonne.
   3. Cliquez sur Résultats , puis sur Exemples de résultats. Cliquez ensuite sur le nom de l’échantillon qui vous intéresse dans la colonne Nom de l’échantillon pour afficher les résultats de séquençage d’un échantillon unique.
   4. Cliquez sur Colonnes dans le coin supérieur gauche de l’écran ou désélectionnez les colonnes du tableau.
2. Affichez les résultats du contrôle qualité et visualisez la couverture de l’amplicon.
   1. Cliquez sur l’onglet CQ dans l’écran Résultats .
   2. Pour l’ADN, assurez-vous que les différences absolues médianes par paires (MAPD) sont comprises entre 0 et 0,5 pour valider l’analyse des variantes du nombre de copies (CNV). Les lectures mappées doivent être supérieures à 1,5 million.
   3. Pour l’ARN, vérifiez si les lectures mappées sont comprises entre 150 000 et 400 000. En dessous, il y a un risque de faux négatifs, et au-delà, il y a un risque de faux positifs.
   4. Cliquez sur le nom d’un exemple pour ouvrir l’onglet Principaux résultats .
   5. Faites défiler jusqu’aux graphiques de couverture de l’amplicon.
   6. Examinez les graphiques de couverture. Définissez le seuil minimal pour la couverture de l’amplicon, car le fournisseur ne le fournit pas. Pour définir une plage et un seuil, mélangez un échantillon témoin et un échantillon de type sauvage (WT). Ensuite, observez la plus petite valeur de la couverture de l’amplicon pour une ou plusieurs mutations sélectionnées.
3. Affichez les résultats des variantes.
   1. Pour exporter les données sous forme de tableau, cliquez sur Exporter dans le coin supérieur droit de l’écran.
   2. Pour afficher le résultat du variant mononucléotidique/variant d’insertion-délétion (SNV/INDEL), cliquez sur l’onglet Variants , puis sur SNV/Indels. Cliquez sur Modifier les filtres et sélectionnez Aucun filtre.
      NOTE : Le seuil de sensibilité a été défini à 5% selon les recommandations du groupe INCA (Institut National du Cancer) (https://www.e-cancer.fr/Professionnels-de-sante/Les-therapies-ciblees/Les-plateformes-de-genetique-moleculaire-des-cancers/Le-programme-d-assurance-qualite-des-plateformes).
   3. Pour afficher les résultats de fusion et les variants d’exons d’ARN : Cliquez sur l’onglet Variants , puis sur Fusions.
   4. En haut à droite, cliquez sur Visualisation et variante de l’exon de l’ARN, puis examinez le graphique des variantes de l’exon de l’ARN .
   5. Avec ce kit, il est possible de détecter le saut d’exon des gènes EGFR, MET et AR . Cliquez sur Visualisation ; c’est plus facile à analyser.
   6. Pour afficher le déséquilibre de fusion des tuiles d’exons d’ARN : Cliquez sur l’onglet Variantes , puis sur Fusions.
   7. En haut à droite, cliquez sur Visualisation et déséquilibre de fusion des tuiles d’exons d’ARN, puis examinez les diagrammes de déséquilibre de fusion des tuiles d’exons d’ARN . Une fusion de déséquilibre est une fusion entre un partenaire connu et un partenaire qui n’est pas couvert par le panel.
   8. Afficher les résultats CNV : Cliquez sur CNV dans l’onglet Variantes pour afficher les données.
      REMARQUE : Il est nécessaire d’être vigilant avec les résultats de la CNV en informant lors de la préparation des échantillons du sexe et du pourcentage de cellules tumorales de l’échantillon. Le gène AR n’est porté que par le chromosome X . Si le sexe n’est pas spécifié, le sexe masculin pourrait subir des pertes, ce qui entraînerait des résultats faussement positifs chez les patients masculins.
4. Examinez les résultats du plug-in.
   1. Vérifier les résultats du plug-in d’analyse de couverture : en haut à droite, cliquez sur et sélectionnez télécharger les fichiers.
   2. Le plug-in Coverage Analysis génère un rapport d’analyse de couverture.
   3. Passez en revue les résultats du plug-in d’analyse de couverture moléculaire : en haut à droite, cliquez sur et sélectionnez télécharger les fichiers. Cette analyse permet de vérifier si tous les amplicons sont couverts et de confirmer les résultats des variantes de nombre de copies (CNV) fournis par le logiciel.
5. Afficher les métriques de test et le rapport d’exécution
   1. Cliquez sur l’onglet Exécuter le rapport dans le résumé de l’exécution.
   2. Pour afficher le rapport d’exécution, sélectionnez l’option Sélectionner un échantillon dans le menu déroulant.
   3. Métriques d’analyse et rapport d’exécution : recherchez les métriques de séquençage en haut de l’écran, suivies des métriques spécifiques à l’échantillon dans le tableau Exécuter les échantillons .
      REMARQUE : les informations contenues dans le fichier d’archive du support client (CSA) peuvent aider à résoudre les problèmes, mais elles ne peuvent pas être analysées directement. Les fichiers CSA résument les données de l’ensemble des données d’exécution et mettent en évidence les causes d’un problème en cas d’échec de l’exécution.
   4. Pour télécharger un rapport d’exécution : Cliquez sur l’onglet Rapports .
   5. Cliquez sur Télécharger le rapport pour télécharger un résumé du rapport d’exécution au format PDF.
6. Générer un rapport sur les variantes.
   1. Activez l’option Générer un rapport à l’étape Configuration pour générer automatiquement un rapport de variantes pour chaque échantillon lors de l’analyse des données d’une exécution.
   2. Après avoir généré le rapport de variantes pour un échantillon, le système rend le rapport disponible à deux endroits : Tout d’abord, un lien est mis à disposition dans l’écran Résultats/Résultats de l’échantillon . Cliquez sur le lien pour télécharger le PDF.
   3. Deuxièmement, accédez au volet Rapport sur les variantes dans l’onglet Rapports et cliquez sur le bouton Télécharger le rapport . Signez les rapports de variantes électroniquement ou manuellement.
      REMARQUE : Les rapports signés électroniquement ont (Signer) après le nom de l’échantillon dans l’écran Exemples de résultats .

Résultats

À l’aide de la procédure présentée ici, décrite en détail dans nos publications récentes²¹, nous avons développé un flux de travail optimal pour l’évaluation de l’altération moléculaire en tant que test réflexe dans la pratique clinique de routine pour le diagnostic chez les patients atteints de NSCLC à l’aide d’une approche de séquençage ultra-rapide basée sur l’amplicon de nouvelle génération. Le flux de travail moléculaire de la méthode est illustré à la

Discussion

La mise au point d’une approche NGS ultra-rapide basée sur l’amplicon en tant que test réflexe pour l’évaluation de l’altération moléculaire au diagnostic de n’importe quel stade du NS-NSLC est une option optimale pour la détection de tous les biomarqueurs recommandés et émergents recommandés par les lignes directrices dans NS-NSCLC ^5,22,23. Alors que les méthodes séquentielles (IHC, PCR, FISH) se concentren...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
96 well hard shell plate clear	Thermo Fisher Scientific (Waltham, Massachusetts, USA)	4483354
Adhesive PCR Plate Foil	Thermo Fisher Scientific (Waltham, Massachusetts, USA)	AB0626
AutoLys M tube	Thermo Fisher Scientific (Waltham, Massachusetts, USA)	A38738	FFPE sample processing tubes
Genexus Barcodes 1-32 HD	Thermo Fisher Scientific (Waltham, Massachusetts, USA)	A40261
Genexus GX5 Chip and Genexus Coupler	Thermo Fisher Scientific (Waltham, Massachusetts, USA)	A40269
Genexus Pipette Tips	Thermo Fisher Scientific (Waltham, Massachusetts, USA)	A40266
Genexus Purification Instrument	Thermo Fisher Scientific (Waltham, Massachusetts, USA)	A48148	Automated purification instrument (API)
Genexus Sequencing Kit	Thermo Fisher Scientific (Waltham, Massachusetts, USA)	A40271
Genexus Templating Strips 3-GX5 and 4	Thermo Fisher Scientific (Waltham, Massachusetts, USA)	A40263
Genexus Integrated Sequencer	Thermo Fisher Scientific (Waltham, Massachusetts, USA)	A45727
Ion Torrent  Genexus FFPE DNA/RNA Purification Combo Kit	Thermo Fisher Scientific (Waltham, Massachusetts, USA)	A45539
Oncomine  Precision Assay GX (OPA) Panel (included Strips 1 and 2-HD)	Thermo Fisher Scientific (Waltham, Massachusetts, USA)	A46291