TAGGG端粒长度测定性能参数优化

摘要

在这里，我们详细描述了使用非放射性化学发光检测量化端粒长度的方案，重点是优化TAGGG端粒长度测定试剂盒的各种性能参数，例如缓冲液量和探针浓度。

摘要

端粒是存在于染色体末端的重复序列;它们的缩短是人类体细胞的特征。缩短是由于末端复制的问题和端粒酶的缺失而发生的，端粒酶负责维持端粒长度。有趣的是，端粒也会响应各种内部生理过程而缩短，如氧化应激和炎症，这些过程可能由于污染物、传染因子、营养物质或辐射等细胞外因素而受到影响。因此，端粒长度是衰老和各种生理健康参数的极好生物标志物。TAGGG 端粒长度测定试剂盒用于使用端粒限制性片段 （TRF） 测定来量化平均端粒长度，并且具有高度可重复性。然而，这是一种昂贵的方法，因此，它不常规用于大样本数量。在这里，我们描述了一个详细的方案，用于使用南方印迹或TRF分析以及基于非放射性化学发光的检测来优化且经济高效地测量端粒长度。

引言

端粒是存在于染色体末端的重复DNA序列。它们具有TTAGGG的串联重复，并通过保护染色体免受磨损和末端复制问题来维持基因组完整性，这意味着3'突出的部分无法被DNA聚合酶^1，2复制。短端粒导致细胞染色体异常，因此细胞在称为复制衰老³的阶段永久停滞。短端粒还会导致许多其他问题，例如线粒体功能障碍^4，5 和细胞功能障碍。

当细胞分裂时，DNA端粒重复序列丢失，^{平均每年损失}25至200 bp6，导致细胞在一定次数的分裂后衰老⁶。衰老与合并症的频率较高有关，其特征是端粒长度缩短⁷。正如Mender所描述的端粒限制性片段（TRF）分析是一种非常昂贵的方法⁸。因此，在大多数研究中，在量化端粒长度时没有实施。

目前，大多数流行病学研究采用基于定量聚合酶链反应（qPCR）的端粒长度测量。然而，基于qPCR的方法是一种相对测量方法，因为它测量端粒和单拷贝基因扩增产物之间的....

研究方案

注意：有关以下方案中使用的所有试剂的详细信息，请参阅 材料表 。表 1 列出了实验室制造的试剂以及优化的体积， 表2 显示了市售试剂的工作浓度。

1. 细胞培养

1. 在 Dulbecco 的改良鹰培养基 （DMEM） 完全培养基中维持要测量端粒长度的细胞（此处使用的是 A2780 细胞，这是一种卵巢腺癌细胞系），该培养基补充有 10% 胎牛血清 （FBS）、链霉素、青霉素和两性霉素 B 在 6 cm 培养皿中。在含有5%二氧化碳的加湿和受控环境中于37°C孵育，直到细胞80%-100%汇合。
2. 取出培养基并用 5 mL 的 1x 磷酸盐缓冲盐水 （PBS） 洗涤。
3. 用1mL胰蛋白酶 - 乙二胺四乙酸（EDTA）处理细胞，通过在37°C孵育3-5分钟来分离细胞。
4. 加入 2 mL DMEM 完全培养基以灭活胰蛋白酶并将细胞收集在离心管中。
5. 以2，348× g 沉淀细胞5分钟。
6. 用1x PBS洗涤沉淀，并以2，348× g 离心5分钟。
7. 将颗粒储存在-80°C直至进一步使用。
   注意：细胞计数可能因细胞系而异。在A2780细胞系的情况下，我们获得了大约2.5×10^6<....

讨论

我们描述了一种使用南方印迹法测量端粒长度的非放射性、基于化学发光的方法的详细程序。该方案已经过测试，允许明智地使用多种试剂，而不会影响结果质量。预杂交和杂交缓冲液最多可重复使用五次。酶浓度可以在每1.5-2μg基因组DNA的10-20U之间变化，而不会影响结果。其他几种试剂盒组分，如DIG标记的分子量标记物和杂交探针，可以在低于推荐浓度的浓度下使用。优化的卷如 表 2

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Cell Line
A2780 (Ovarian adenocarcinoma cell line)	Received as a gift
Equipment
ChemiDoc XRS+ (for imaging and UV cross linking)	Biorad	Universal hood II (721BR14277)
Nanodrop (Epoch 2)	Biotek	EPOCH2
Software
TeloTool	Version 1.3
Materials
Acetic Acid	Molychem	64-19-7
Agarose	MP	180720
Amphotericin B	Gibco, ThermoFisher Scientific, USA	15240062
DMEM	HyClone, Cytiva, USA	SH30243.01
Ethylenediamine tetraacetic acid	Molychem	6381-92-6
HI FBS	Gibco, ThermoFisher Scientific, USA	10270106
HCl	Molychem	76-47-01-0
NaCl	Molychem	7647-14-5
NaOH	Molychem	1310-73-2
Nylon membrane	Sigma	11209299001
Penicillin	Gibco, ThermoFisher Scientific, USA	15240062
Sodium dodecyl sulfate	Affymetrix	151-21-3
Streptomycin	Gibco, ThermoFisher Scientific, USA	15240062
Tris	BIORAD	77-86-1
Tris HCl	Sigma Aldrich	1185-53-1
Whatman paper	GE healthcare lifesciences	1001-917
Reagents
1 kb ladder	NEB	N3232S
20x SSC	Invitrogen	15557-036
Anti DIG AP	Telo TAGGG Telomere Length Assay kit	12209136001
Blocking solution 10x	Telo TAGGG Telomere Length Assay kit	12209136001
Cutsmart Buffer	NEB	B6004
Detection buffer 10x	Telo TAGGG Telomere Length Assay kit	12209136001
Dig easy hyb	Telo TAGGG Telomere Length Assay kit	12209136001
Digestion Buffer	Telo TAGGG Telomere Length Assay kit	12209136001
Hinf 1	Telo TAGGG Telomere Length Assay kit	12209136001
Hinf 1 (alternative to kit)	NEB	R0155T
Loading Dye	BIOLABS	N3231S
Maleic acid buffer 10x	Telo TAGGG Telomere Length Assay kit	12209136001
Molecular marker	Telo TAGGG Telomere Length Assay kit	12209136001
Probe	Telo TAGGG Telomere Length Assay kit	12209136001
Rsa 1	Telo TAGGG Telomere Length Assay kit	12209136001
Rsa 1 (alternative to kit)	NEB	R0167L
Substrate	Telo TAGGG Telomere Length Assay kit	12209136001
Wash buffer	Telo TAGGG Telomere Length Assay kit	12209136001