TAGGG Telomer Uzunluk Testi'nin Performans Parametrelerinin Optimizasyonu

Özet

Burada, tampon miktarları ve prob konsantrasyonları gibi TAGGG telomer uzunluğu tahlil kitinin çeşitli performans parametrelerinin optimizasyonuna odaklanarak, radyoaktif olmayan kemilüminesan tespiti kullanarak telomer uzunluğunu ölçme protokolünü ayrıntılı olarak açıklıyoruz.

Özet

Telomerler, kromozomal uçlarda bulunan tekrarlayan dizilerdir; Kısalmaları, insan somatik hücrelerinin karakteristik bir özelliğidir. Kısalma, son replikasyon ile ilgili bir sorun ve telomer uzunluğunun korunmasından sorumlu olan telomeraz enziminin yokluğu nedeniyle oluşur. İlginç bir şekilde, telomerler, kirleticiler, enfeksiyöz ajanlar, besinler veya radyasyon gibi hücre dışı ajanlar nedeniyle etkilenebilecek oksidatif stres ve inflamasyon gibi çeşitli iç fizyolojik süreçlere yanıt olarak da kısalır. Bu nedenle, telomer uzunluğu yaşlanmanın ve çeşitli fizyolojik sağlık parametrelerinin mükemmel bir biyobelirteci olarak hizmet eder. TAGGG telomer uzunluk tahlil kiti, telomer kısıtlama fragmanı (TRF) testini kullanarak ortalama telomer uzunluklarını ölçmek için kullanılır ve yüksek oranda tekrarlanabilir. Bununla birlikte, pahalı bir yöntemdir ve bu nedenle, büyük örneklem sayıları için rutin olarak kullanılmaz. Burada, Güney lekeleri veya TRF analizi ve radyoaktif olmayan kemilüminesans bazlı algılama kullanılarak telomer uzunluğunun optimize edilmiş ve uygun maliyetli bir ölçümü için ayrıntılı bir protokol açıklanmaktadır.

Giriş

Telomerler, kromozomların sonunda bulunan tekrarlayan DNA dizileridir. TTAGGG'nin tandem tekrarlarına sahiptirler ve kromozomu hem yıpranmadan hem de son replikasyon probleminden koruyarak genom bütünlüğünü korurlar, bu da 3' çıkıntısının bir kısmının DNA polimeraz ^1,2 tarafından kopyalanamayacağı anlamına gelir. Kısa telomerler, hücrelerde kromozomal anormalliklere yol açar, çünkü hücreler replikatif yaşlanma³ adı verilen bir aşamada kalıcı olarak tutuklanır. Kısa telomerler ayrıca mitokondri disfonksiyonu ^4,5 ve hücre disfonks....

Protokol

NOT: Aşağıdaki protokolde kullanılan tüm reaktifler hakkında ayrıntılar için Malzeme Tablosuna bakın. Tablo 1 , laboratuvar yapımı reaktifleri optimize edilmiş hacimlerle birlikte listeler ve Tablo 2 , ticari olarak temin edilebilen reaktiflerin çalışma konsantrasyonlarını gösterir.

1. Hücre kültürü

1. Telomer uzunluğu ölçülecek hücreleri (burada bir yumurtalık adenokarsinom hücre hattı olan A2780 hücreleri vardı), Dulbecco'nun modifiye kartal besiyeri (DMEM) tam ortamında, 6 cm'lik bir Petri kabında% 10 fetal sığır serumu (FBS), streptomisin, penisilin ve amfoterisi....

Tartışmalar

Güney lekelemesi kullanarak telomer uzunluğu ölçümü için radyoaktif olmayan, kemilüminesans bazlı bir yöntem için ayrıntılı bir prosedür tarif ediyoruz. Protokol, sonuçların kalitesinden ödün vermeden birkaç reaktifin akıllıca kullanılmasına izin verecek şekilde test edilmiştir. Prehibridizasyon ve hibridizasyon tamponu beş defaya kadar tekrar kullanılabilir. Enzim konsantrasyonu, sonuçları etkilemeden 1.5-2 μg genomik DNA başına 10-20 U arasında değişebilir. DIG etiketli moleküler a?.......

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Cell Line
A2780 (Ovarian adenocarcinoma cell line)	Received as a gift
Equipment
ChemiDoc XRS+ (for imaging and UV cross linking)	Biorad	Universal hood II (721BR14277)
Nanodrop (Epoch 2)	Biotek	EPOCH2
Software
TeloTool	Version 1.3
Materials
Acetic Acid	Molychem	64-19-7
Agarose	MP	180720
Amphotericin B	Gibco, ThermoFisher Scientific, USA	15240062
DMEM	HyClone, Cytiva, USA	SH30243.01
Ethylenediamine tetraacetic acid	Molychem	6381-92-6
HI FBS	Gibco, ThermoFisher Scientific, USA	10270106
HCl	Molychem	76-47-01-0
NaCl	Molychem	7647-14-5
NaOH	Molychem	1310-73-2
Nylon membrane	Sigma	11209299001
Penicillin	Gibco, ThermoFisher Scientific, USA	15240062
Sodium dodecyl sulfate	Affymetrix	151-21-3
Streptomycin	Gibco, ThermoFisher Scientific, USA	15240062
Tris	BIORAD	77-86-1
Tris HCl	Sigma Aldrich	1185-53-1
Whatman paper	GE healthcare lifesciences	1001-917
Reagents
1 kb ladder	NEB	N3232S
20x SSC	Invitrogen	15557-036
Anti DIG AP	Telo TAGGG Telomere Length Assay kit	12209136001
Blocking solution 10x	Telo TAGGG Telomere Length Assay kit	12209136001
Cutsmart Buffer	NEB	B6004
Detection buffer 10x	Telo TAGGG Telomere Length Assay kit	12209136001
Dig easy hyb	Telo TAGGG Telomere Length Assay kit	12209136001
Digestion Buffer	Telo TAGGG Telomere Length Assay kit	12209136001
Hinf 1	Telo TAGGG Telomere Length Assay kit	12209136001
Hinf 1 (alternative to kit)	NEB	R0155T
Loading Dye	BIOLABS	N3231S
Maleic acid buffer 10x	Telo TAGGG Telomere Length Assay kit	12209136001
Molecular marker	Telo TAGGG Telomere Length Assay kit	12209136001
Probe	Telo TAGGG Telomere Length Assay kit	12209136001
Rsa 1	Telo TAGGG Telomere Length Assay kit	12209136001
Rsa 1 (alternative to kit)	NEB	R0167L
Substrate	Telo TAGGG Telomere Length Assay kit	12209136001
Wash buffer	Telo TAGGG Telomere Length Assay kit	12209136001