Optimisation des paramètres de performance du test de longueur des télomères TAGGG

Résumé

Ici, nous décrivons en détail le protocole de quantification de la longueur des télomères à l’aide de la détection chimiluminescente non radioactive, en mettant l’accent sur l’optimisation de divers paramètres de performance du kit de dosage de longueur des télomères TAGGG, tels que les quantités tampons et les concentrations de sonde.

Résumé

Les télomères sont des séquences répétitives qui sont présentes aux extrémités chromosomiques; Leur raccourcissement est une caractéristique des cellules somatiques humaines. Le raccourcissement se produit en raison d’un problème de réplication terminale et de l’absence de l’enzyme télomérase, responsable du maintien de la longueur des télomères. Fait intéressant, les télomères raccourcissent également en réponse à divers processus physiologiques internes, tels que le stress oxydatif et l’inflammation, qui peuvent être affectés par des agents extracellulaires tels que les polluants, les agents infectieux, les nutriments ou les radiations. Ainsi, la longueur des télomères sert d’excellent biomarqueur du vieillissement et de divers paramètres physiologiques de santé. Le kit de dosage de longueur des télomères TAGGG est utilisé pour quantifier les longueurs moyennes des télomères à l’aide du test du fragment de restriction des télomères (TRF) et est hautement reproductible. Cependant, il s’agit d’une méthode coûteuse et, pour cette raison, elle n’est pas utilisée systématiquement pour les grands nombres d’échantillons. Ici, nous décrivons un protocole détaillé pour une mesure optimisée et rentable de la longueur des télomères à l’aide de transferts de Southern ou d’analyse TRF et d’une détection non radioactive basée sur la chimiluminescence.

Introduction

Les télomères sont les séquences d’ADN répétitives présentes à l’extrémité des chromosomes. Ils ont des répétitions en tandem de TTAGGG et maintiennent l’intégrité du génome en protégeant le chromosome à la fois de l’effilochage et du problème de réplication finale, ce qui signifie qu’une partie du surplomb 3' est incapable d’être répliquée par l’ADN polymérase ^1,2. Les télomères courts entraînent des anomalies chromosomiques dans les cellules, en raison desquelles les cellules sont arrêtées de façon permanente dans un stade appelé sénescence^{réplicative 3}. Les télomères courts causent é....

Protocole

REMARQUE: Voir le tableau des matériaux pour plus de détails sur tous les réactifs utilisés dans le protocole ci-dessous. Le tableau 1 fait appel à des réactifs fabriqués en laboratoire ainsi qu’à des volumes optimisés et le tableau 2 montre les concentrations de travail des réactifs disponibles dans le commerce.

1. Culture cellulaire

1. Maintenir les cellules dont la longueur des télomères doit être mesurée (utilisées ici étaient des cellules A2780, qui est une lignée cellulaire d’adénocarcinome ovarien) dans le milieu complet du milieu aigle modifié (DMEM) de Dulbe....

Discussion

Nous décrivons une procédure détaillée pour une méthode non radioactive, basée sur la chimiluminescence, pour la mesure de la longueur des télomères par transfert de Southern. Le protocole a été testé pour permettre l’utilisation judicieuse de plusieurs réactifs sans compromis sur la qualité des résultats. Le tampon de préhybridation et d’hybridation peut être réutilisé jusqu’à cinq fois. La concentration enzymatique peut varier entre 10 et 20 U par 1,5 à 2 μg d’ADN génomique sans affecter l.......

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Cell Line
A2780 (Ovarian adenocarcinoma cell line)	Received as a gift
Equipment
ChemiDoc XRS+ (for imaging and UV cross linking)	Biorad	Universal hood II (721BR14277)
Nanodrop (Epoch 2)	Biotek	EPOCH2
Software
TeloTool	Version 1.3
Materials
Acetic Acid	Molychem	64-19-7
Agarose	MP	180720
Amphotericin B	Gibco, ThermoFisher Scientific, USA	15240062
DMEM	HyClone, Cytiva, USA	SH30243.01
Ethylenediamine tetraacetic acid	Molychem	6381-92-6
HI FBS	Gibco, ThermoFisher Scientific, USA	10270106
HCl	Molychem	76-47-01-0
NaCl	Molychem	7647-14-5
NaOH	Molychem	1310-73-2
Nylon membrane	Sigma	11209299001
Penicillin	Gibco, ThermoFisher Scientific, USA	15240062
Sodium dodecyl sulfate	Affymetrix	151-21-3
Streptomycin	Gibco, ThermoFisher Scientific, USA	15240062
Tris	BIORAD	77-86-1
Tris HCl	Sigma Aldrich	1185-53-1
Whatman paper	GE healthcare lifesciences	1001-917
Reagents
1 kb ladder	NEB	N3232S
20x SSC	Invitrogen	15557-036
Anti DIG AP	Telo TAGGG Telomere Length Assay kit	12209136001
Blocking solution 10x	Telo TAGGG Telomere Length Assay kit	12209136001
Cutsmart Buffer	NEB	B6004
Detection buffer 10x	Telo TAGGG Telomere Length Assay kit	12209136001
Dig easy hyb	Telo TAGGG Telomere Length Assay kit	12209136001
Digestion Buffer	Telo TAGGG Telomere Length Assay kit	12209136001
Hinf 1	Telo TAGGG Telomere Length Assay kit	12209136001
Hinf 1 (alternative to kit)	NEB	R0155T
Loading Dye	BIOLABS	N3231S
Maleic acid buffer 10x	Telo TAGGG Telomere Length Assay kit	12209136001
Molecular marker	Telo TAGGG Telomere Length Assay kit	12209136001
Probe	Telo TAGGG Telomere Length Assay kit	12209136001
Rsa 1	Telo TAGGG Telomere Length Assay kit	12209136001
Rsa 1 (alternative to kit)	NEB	R0167L
Substrate	Telo TAGGG Telomere Length Assay kit	12209136001
Wash buffer	Telo TAGGG Telomere Length Assay kit	12209136001