Optimización de los parámetros de rendimiento del ensayo de longitud de telómeros TAGGG

Resumen

Aquí, describimos en detalle el protocolo para cuantificar la longitud de los telómeros utilizando la detección quimioluminiscente no radiactiva, con un enfoque en la optimización de varios parámetros de rendimiento del kit de ensayo de longitud de telómeros TAGGG, como cantidades de tampón y concentraciones de sonda.

Resumen

Los telómeros son secuencias repetitivas que están presentes en los extremos cromosómicos; Su acortamiento es un rasgo característico de las células somáticas humanas. El acortamiento se produce debido a un problema con la replicación final y la ausencia de la enzima telomerasa, que es responsable de mantener la longitud de los telómeros. Curiosamente, los telómeros también se acortan en respuesta a diversos procesos fisiológicos internos, como el estrés oxidativo y la inflamación, que pueden verse afectados debido a agentes extracelulares como contaminantes, agentes infecciosos, nutrientes o radiación. Por lo tanto, la longitud de los telómeros sirve como un excelente biomarcador del envejecimiento y varios parámetros fisiológicos de salud. El kit de ensayo de longitud de telómeros TAGGG se utiliza para cuantificar longitudes promedio de telómeros utilizando el ensayo de fragmento de restricción de telómeros (TRF) y es altamente reproducible. Sin embargo, es un método costoso, y debido a esto, no se emplea rutinariamente para grandes números de muestra. Aquí, describimos un protocolo detallado para una medición optimizada y rentable de la longitud de los telómeros utilizando Southern blots o análisis TRF y detección basada en quimioluminiscencia no radiactiva.

Introducción

Los telómeros son las secuencias repetitivas de ADN presentes al final de los cromosomas. Tienen repeticiones en tándem de TTAGGG y mantienen la integridad del genoma protegiendo el cromosoma tanto del deshilachado como del problema de replicación final, lo que significa que parte del voladizo 3' no puede ser replicado por la ADN polimerasa ^1,2. Los telómeros cortos conducen a anomalías cromosómicas en las células, debido a lo cual las células se detienen permanentemente en una etapa llamada senescencia replicativa³. Los telómeros cortos también causan una serie de otros problemas, como....

Protocolo

NOTA: Consulte la Tabla de materiales para obtener detalles sobre todos los reactivos utilizados en el protocolo a continuación. La Tabla 1 incluye reactivos hechos en laboratorio junto con volúmenes optimizados y la Tabla 2 muestra concentraciones de trabajo de reactivos disponibles comercialmente.

1. Cultivo celular

1. Mantener las células cuya longitud de telómero se debe medir (aquí se usaron células A2780, que es una línea celular de adenocarcinoma de ovario) en el medio completo de águila modificada (DMEM) de Dulbecco suplementado con 10% de suero bovino fetal ....

Discusión

Describimos un procedimiento detallado para un método no radiactivo basado en la quimioluminiscencia para la medición de la longitud de los telómeros mediante Southern blotting. El protocolo ha sido probado para permitir el uso juicioso de varios reactivos sin comprometer la calidad de los resultados. El tampón de prehibridación e hibridación se puede reutilizar hasta cinco veces. La concentración de enzimas puede variar entre 10-20 U por 1,5-2 μg de ADN genómico sin afectar los resultados. Varios otros componen.......

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Cell Line
A2780 (Ovarian adenocarcinoma cell line)	Received as a gift
Equipment
ChemiDoc XRS+ (for imaging and UV cross linking)	Biorad	Universal hood II (721BR14277)
Nanodrop (Epoch 2)	Biotek	EPOCH2
Software
TeloTool	Version 1.3
Materials
Acetic Acid	Molychem	64-19-7
Agarose	MP	180720
Amphotericin B	Gibco, ThermoFisher Scientific, USA	15240062
DMEM	HyClone, Cytiva, USA	SH30243.01
Ethylenediamine tetraacetic acid	Molychem	6381-92-6
HI FBS	Gibco, ThermoFisher Scientific, USA	10270106
HCl	Molychem	76-47-01-0
NaCl	Molychem	7647-14-5
NaOH	Molychem	1310-73-2
Nylon membrane	Sigma	11209299001
Penicillin	Gibco, ThermoFisher Scientific, USA	15240062
Sodium dodecyl sulfate	Affymetrix	151-21-3
Streptomycin	Gibco, ThermoFisher Scientific, USA	15240062
Tris	BIORAD	77-86-1
Tris HCl	Sigma Aldrich	1185-53-1
Whatman paper	GE healthcare lifesciences	1001-917
Reagents
1 kb ladder	NEB	N3232S
20x SSC	Invitrogen	15557-036
Anti DIG AP	Telo TAGGG Telomere Length Assay kit	12209136001
Blocking solution 10x	Telo TAGGG Telomere Length Assay kit	12209136001
Cutsmart Buffer	NEB	B6004
Detection buffer 10x	Telo TAGGG Telomere Length Assay kit	12209136001
Dig easy hyb	Telo TAGGG Telomere Length Assay kit	12209136001
Digestion Buffer	Telo TAGGG Telomere Length Assay kit	12209136001
Hinf 1	Telo TAGGG Telomere Length Assay kit	12209136001
Hinf 1 (alternative to kit)	NEB	R0155T
Loading Dye	BIOLABS	N3231S
Maleic acid buffer 10x	Telo TAGGG Telomere Length Assay kit	12209136001
Molecular marker	Telo TAGGG Telomere Length Assay kit	12209136001
Probe	Telo TAGGG Telomere Length Assay kit	12209136001
Rsa 1	Telo TAGGG Telomere Length Assay kit	12209136001
Rsa 1 (alternative to kit)	NEB	R0167L
Substrate	Telo TAGGG Telomere Length Assay kit	12209136001
Wash buffer	Telo TAGGG Telomere Length Assay kit	12209136001