Optimización de los parámetros de rendimiento del ensayo de longitud de telómeros TAGGG

Resumen

Aquí, describimos en detalle el protocolo para cuantificar la longitud de los telómeros utilizando la detección quimioluminiscente no radiactiva, con un enfoque en la optimización de varios parámetros de rendimiento del kit de ensayo de longitud de telómeros TAGGG, como cantidades de tampón y concentraciones de sonda.

Resumen

Los telómeros son secuencias repetitivas que están presentes en los extremos cromosómicos; Su acortamiento es un rasgo característico de las células somáticas humanas. El acortamiento se produce debido a un problema con la replicación final y la ausencia de la enzima telomerasa, que es responsable de mantener la longitud de los telómeros. Curiosamente, los telómeros también se acortan en respuesta a diversos procesos fisiológicos internos, como el estrés oxidativo y la inflamación, que pueden verse afectados debido a agentes extracelulares como contaminantes, agentes infecciosos, nutrientes o radiación. Por lo tanto, la longitud de los telómeros sirve como un excelente biomarcador del envejecimiento y varios parámetros fisiológicos de salud. El kit de ensayo de longitud de telómeros TAGGG se utiliza para cuantificar longitudes promedio de telómeros utilizando el ensayo de fragmento de restricción de telómeros (TRF) y es altamente reproducible. Sin embargo, es un método costoso, y debido a esto, no se emplea rutinariamente para grandes números de muestra. Aquí, describimos un protocolo detallado para una medición optimizada y rentable de la longitud de los telómeros utilizando Southern blots o análisis TRF y detección basada en quimioluminiscencia no radiactiva.

Introducción

Los telómeros son las secuencias repetitivas de ADN presentes al final de los cromosomas. Tienen repeticiones en tándem de TTAGGG y mantienen la integridad del genoma protegiendo el cromosoma tanto del deshilachado como del problema de replicación final, lo que significa que parte del voladizo 3' no puede ser replicado por la ADN polimerasa ^1,2. Los telómeros cortos conducen a anomalías cromosómicas en las células, debido a lo cual las células se detienen permanentemente en una etapa llamada senescencia replicativa³. Los telómeros cortos también causan una serie de otros problemas, como la disfunción mitocondrial ^4,5 y la disfunción celular.

Las repeticiones teloméricas de ADN se pierden a medida que la célula se divide, con una pérdida promedio de 25 a 200 pb por año 6, lo que resulta en senescencia celular después de un cierto número de divisiones⁶. El envejecimiento se asocia con una mayor frecuencia de comorbilidades, que se caracteriza por un acortamiento en la longitud de los telómeros⁷. El análisis de fragmentos de restricción de telómeros (TRF), descrito por Mender, es un método muy costoso⁸. Debido a esto, no se implementa al cuantificar la longitud de los telómeros en la mayoría de los estudios.

Actualmente, la mayoría de los estudios epidemiológicos emplean mediciones cuantitativas basadas en la reacción en cadena de la polimerasa (qPCR) de la longitud de los telómeros. Sin embargo, el método basado en qPCR es un método de medición relativa, ya que mide la relación entre los telómeros y los productos de amplificación génica de copia única, y no la longitud absoluta de los telómeros. La medición de la longitud de los telómeros utilizando el protocolo TRF es el método estándar de oro, ya que puede medir la distribución de la longitud de los telómeros en la muestra y las mediciones se pueden expresar en valores absolutos en kilobases (kb). Sin embargo, su uso es limitado porque es engorroso, requiere mucha mano de obra y es costoso. Aquí, presentamos un protocolo optimizado para la medición de la longitud de los telómeros utilizando TRF basados en quimioluminiscencia.

El análisis TRF incluye siete pasos principales: 1) cultivo de células para la extracción de ADN genómico, 2) extracción de ADN genómico utilizando el método fenol: cloroformo: alcohol isoamílico (P: C: I), 3) digestión de restricción de ADN genómico, 4) electroforesis en gel de agarosa, 5) transferencia sur del fragmento de ADN de digestión de restricción, 6) hibridación y detección a través de quimioluminiscencia: la sonda de telómeros inmovilizados se visualiza mediante un sustrato quimioluminiscente altamente sensible para fosfatasa alcalina, análisis disódico de 2-cloro-5-(4-metoxiespiro[1,2-dioxetano-3,2′-(5-clorotriciclo[3.3.1.13.7]decan])-4-il]-1-fenil fosfato (CDP-Star)-y 7) para obtener información media sobre la longitud y el rango de los telómeros de estos frotis teloméricos.

Protocolo

NOTA: Consulte la Tabla de materiales para obtener detalles sobre todos los reactivos utilizados en el protocolo a continuación. La Tabla 1 incluye reactivos hechos en laboratorio junto con volúmenes optimizados y la Tabla 2 muestra concentraciones de trabajo de reactivos disponibles comercialmente.

1. Cultivo celular

1. Mantener las células cuya longitud de telómero se debe medir (aquí se usaron células A2780, que es una línea celular de adenocarcinoma de ovario) en el medio completo de águila modificada (DMEM) de Dulbecco suplementado con 10% de suero bovino fetal (FBS), estreptomicina, penicilina y anfotericina B en una placa de Petri de 6 cm. Incubar a 37 °C en un ambiente humidificado y controlado que contenga 5% de dióxido de carbono hasta que las células sean 80% -100% confluentes.
2. Retire el medio y lávese con 5 ml de solución salina tamponada con fosfato (PBS).
3. Tratar las células con 1 ml de ácido tripsina-etilendiaminotetraacético (EDTA) para desprender las células incubando a 37 °C durante 3-5 min.
4. Agregue 2 ml de medios completos DMEM para inactivar la tripsina y recoger las células en un tubo de centrifugación.
5. Granular las células a 2.348 × g durante 5 min.
6. Lavar el pellet con 1x PBS y centrifugar a 2.348 × g durante 5 min.
7. Conservar el pellet a -80 °C hasta su uso posterior.
   NOTA: El recuento de células puede variar dependiendo de la línea celular. Obtuvimos aproximadamente 2,5 × 10⁶ células en el caso de la línea celular A2780, que se utiliza en pasos posteriores.

2. Aislamiento genómico del ADN

1. Añadir 500 μL de tampón de lisis (10 mM tris-Cl, pH 8,0; 25 mM EDTA, pH 8,0; 100 mM NaCl; 0,5% p/v dodecil sulfato de sodio) al pellet celular y mezclar suavemente con una punta cortada (con un diámetro de apertura mínimo de 2 mm). Añadir 20 μg/ml de RNasa A recién preparada y mezclar suavemente por inversión.
2. Incubar a 37 °C durante 30 min y ocasionalmente invertir el tubo durante la incubación.
3. Añadir proteinasa K a una concentración final de 100 μg/ml y mezclar suavemente por inversión 10 veces. Incubar a 55 °C durante 2 h. Invierta el tubo a intervalos regulares (cada 10 minutos) durante la incubación.
4. Añadir 500 μL de fenol:cloroformo:reactivo de alcohol isoamílico (25:24:1) y mezclar suavemente por inversión 20 veces. Centrifugar a 9.391 × g durante 15 min a temperatura ambiente (alrededor de 25 °C).
   NOTA: La Figura 1A muestra las tres capas obtenidas después de la centrifugación.
5. Retire la capa acuosa superior viscosa de las tres capas visibles, colóquela en un tubo nuevo con una punta cortada y agregue una cantidad igual de cloroformo. Mezclar por inversión suave 20 veces.
6. Centrifugar los tubos a 9.391 × g durante 15 min a temperatura ambiente.
7. Recoger la capa acuosa y añadir una cantidad adecuada de 5 M de NaCl para que la concentración final de NaCl sea de 0,2 M.
8. Agregue dos volúmenes de etanol 100%. Mezclar por inversión suave 20-25 veces. Centrifugar a 15.871 × g durante 5 min a temperatura ambiente.
9. Retire el sobrenadante y agregue 500 μL de etanol al 70% para lavar el pellet. Centrifugar a 15.871 × g durante 5 min a temperatura ambiente.
10. Retire el sobrenadante, seque al aire el pellet durante unos minutos y agregue 50 μL de agua estéril libre de nucleasas. Permita que el ADN se rehidrate durante 1-2 días a temperatura ambiente. Mezclar por pipeteo, utilizando la punta cortada.
11. Mida la concentración de ADN utilizando espectrofotometría ultravioleta (UV). Rediluir las muestras, si es necesario, utilizando agua estéril libre de nucleasas para obtener una concentración mínima de 300-500 ng/μL.
12. Verifique la integridad del ADN ejecutándolo en un gel de agarosa al 1% (Figura 1B).
13. Conservar el ADN diluido a -20 °C hasta su uso posterior.

3. Digestión del ADN genómico

1. Preparar una mezcla enzimática de Rsa1 (20 U) y Hinf1 (20 U) y añadir 2 μL de tampón de digestión de restricción por reacción.
2. Tome un volumen apropiado de ADN genómico tal que la cantidad total de ADN sea de 1,5 μg. Enrasar el volumen con agua estéril libre de nucleasas, de modo que el volumen total después de la adición de la enzima sea de 20 μL.
3. Mezclar bien tocando, seguido de un giro de pulso.
4. Incubar la mezcla a 37 °C durante 2 h.

4. Electroforesis en gel de agarosa

1. Prepare un gel de agarosa de 10 cm × 15 cm al 0,8% en 1x tampón EDTA (TAE) de acetato de tris utilizando agarosa de alto grado.
2. Agregue 5 μL de colorante de carga a cada muestra de ADN genómico digerido, haciendo así que el volumen final sea de 25 μL, y cargue las muestras en el gel.
3. Prepare una mezcla de marcadores moleculares utilizando 1 μL de marcador molecular (escalera), 3 μL de agua estéril libre de nucleasa y 1 μL de colorante de carga 5x.
4. Cargue 5 μL de mezcla de marcadores moleculares en ambos lados de las muestras digeridas de ADN genómico si hay un mayor número de muestras (~ 10), o solo en un lado si hay menos o igual a cinco muestras.
5. Hacer correr el gel a 5 V/cm durante 6 h. Una vez que se complete la carrera, haga una muesca en una esquina del gel para marcar el orden de carga.
6. Sumergir el gel en HCl 0,25 M durante 10 min a temperatura ambiente con una agitación suave.
7. Enjuague el gel dos veces con agua destilada.
8. Desnaturalice el ADN sumergiendo el gel en una solución de NaOH 0,5 M y NaCl 1,5 M dos veces durante 15 minutos cada una a temperatura ambiente con agitación suave.
9. Enjuague el gel dos veces con agua destilada.
10. Neutralizar el ADN sumergiendo el gel en una solución de 0,5 M de tris-HCl y 3 M de NaCl (pH 7,5) dos veces durante 15 min a temperatura ambiente con una agitación suave.

5. Southern blot

1. Corte una membrana de nylon de 10 cm × 12 cm de tamaño y haga una muesca en la misma posición que el gel.
2. Active la membrana sumergiendo en agua destilada seguida de un tampón de citrato salino de sodio (SSC) 20x (ver Tabla 1).
3. Configure la transferencia.
   1. Tome una bandeja de vidrio limpia y coloque otra bandeja en ella en posición invertida. Cree una mecha con papel de filtro normal de modo que los extremos toquen la base de la bandeja exterior.
   2. Coloque el gel encima del papel de filtro. Coloque suavemente la membrana de nylon activado sobre el gel, con las muescas superpuestas, y elimine cualquier burbuja de aire rodando sobre una varilla de vidrio.
   3. Coloque un montón de 2 cm de papel de filtro de celulosa de 9,5 cm × 11,5 cm, seguido de un montón de 6 cm de papel de filtro normal de las mismas dimensiones. Coloque un peso encima de esta configuración de tal manera que haya una distribución de peso igual debajo. Llene la bandeja exterior con un búfer SSC 20x (consulte la figura 2).
   4. Deje la configuración para la transferencia nocturna.
4. Después de la transferencia hacia el sur, fije el ADN transferido en la membrana mediante reticulación UV en un transiluminador UV o reticulante UV. Utilice una lámpara de 302 nm 8 W durante 5 min, o una lámpara de 254 nm 8 W durante 2 min, lo que corresponde a aproximadamente 120 mJ. Asegúrese de que el lado de la membrana en el que se transfiere el ADN se enfrenta a la lámpara.
5. Lave la membrana dos veces con 25 ml de tampón SSC 2x.
6. Haga una pausa en el protocolo, si es necesario, secando completamente la secadora y almacenándola a 2-8 °C después de envolverla en papel de aluminio, hasta su posterior procesamiento.

6. Hibridación y detección de quimioluminiscencia

1. Precaliente el tampón de prehibridación a 42 °C.
   NOTA: Los siguientes pasos incluyen volúmenes de soluciones/tampones que se utilizarán por 100^cm2 de blot.
2. Incubar la membrana en 10 ml de tampón de prehibridación durante 1 h a 42 °C con agitación suave para la prehibridación.
3. Agregue 0.5 μL de sonda de telómeros por cada 5 ml de tampón de hibridación precalentada para producir la solución de hibridación.
4. Incubar el blot en 10 ml de solución de hibridación a 42 °C durante 3 h con una agitación suave.
5. Lave la secadora con tampón estricto 1 (Tabla 1) dos veces durante 10 minutos (25 ml cada una) a temperatura ambiente con una agitación suave.
6. Precaliente el tampón estricto 2 (Tabla 1) durante 30 min a 50 °C.
7. Lave la secadora con un tampón estricto 2 dos veces durante 15 minutos (25 ml cada una) a 50 °C con una agitación suave.
8. Enjuagar con 15 ml de tampón de lavado durante 5 min con agitación suave a RT.
9. Incubar la membrana en 10 ml de solución de bloqueo 1x recién preparada durante 30 min a temperatura ambiente con agitación suave.
10. Incubar la membrana en 10 ml de antidigioxigenina conjugada con solución de trabajo de fosfatasa alcalina (ver Tabla 2) durante 30 min a RT con agitación suave.
11. Lave la secadora dos veces con tampón de lavado a temperatura ambiente durante 15 minutos con una agitación suave.
12. Incubar en 10 ml de tampón de detección durante 5 min a RT con agitación suave.
13. Retire el tampón de detección de exceso y mantenga la membrana con el ADN hacia arriba en una bolsa de hibridación o una hoja de acetato. Agregue ~ 1-1.5 ml de solución de sustrato gota a gota sobre la membrana, coloque inmediatamente otra hoja sobre ella e incube durante 5 minutos a RT.
14. Exprima el exceso de solución de sustrato para obtener imágenes.
15. Imagen de la mancha durante aproximadamente 20 minutos en un sistema de imágenes de documentación en gel, recopilando múltiples imágenes en diferentes puntos de tiempo. Seleccione imágenes no saturadas para su posterior análisis.
    NOTA: En caso de que la señal sea débil, las imágenes se pueden llevar a cabo durante un período de tiempo más largo.

7. Análisis

1. Después de obtener los archivos de imagen, expórtelos para su publicación en formato .tif a la resolución más alta posible (600 dpi en este caso).
2. Instale el software Telotool . Esto requiere una versión específica (R2012a) de MATLAB (disponible gratuitamente) para ejecutarse.
3. Abra el software y haga clic en el botón Cargar archivo de imagen en la parte superior derecha.
4. Una vez cargada la imagen, haga clic en Invertir imagen para que el fondo de la imagen sea negro y las manchas/bandas sean blancas.
5. Recorte la imagen con las esquinas superiores a partir de los pozos. Después de realizar la selección de recorte, haga clic derecho dentro de él y seleccione Recortar imagen.
6. Después de recortar la imagen, haga clic en Calcular carriles y permita que la detección de carriles se produzca automáticamente.
7. Si los carriles no se han detectado correctamente, por ejemplo, si ciertos carriles no se han detectado en absoluto, o si se han detectado carriles adicionales o parciales, realice el ajuste de carril como se describe a continuación.
   1. Haga clic en Ajustar carriles y en la ventana emergente que se abre, agregue y / o ajuste carriles según sea necesario, y haga clic en Aplicar y cerrar.
8. Después de ajustar los carriles, asegúrese de que se vea un punto rojo en cada uno de los carriles y ajuste las escaleras con el botón Ajuste de escalera , asegurándose de que el número de picos en ambos carriles de escalera esté en la misma posición. Elimine los picos superfluos con el botón Eliminar extremo .
9. Después de ajustar las escaleras, seleccione Perfiles de carril, haga clic en Ajuste de escalera y seleccione Ajuste polinómico.
10. Haga clic en Línea de tendencia, según lo recomendado por el software, y luego seleccione Corregido en la siguiente opción.
11. Haga clic en Obtener resultados para mostrar los resultados como una tabla, en la que la fila TRF media es la medición de la longitud de los telómeros de las muestras de carril respectivas.
12. Haga clic en Guardar todo para almacenar los resultados en forma de hoja de cálculo.

Resultados

El ADN genómico extraído (ADNg), que se ejecutó con un gel de agarosa al 1%, mostró una buena integridad, como se muestra en la Figura 1B, lo que indica que la muestra podría usarse para el procesamiento posterior de TRF. El ensayo TRF se llevó a cabo modificando los volúmenes de soluciones requeridas en cada paso (ver Tabla 1 y Tabla 2). La señal TRF era claramente visible (Figura 3). Por lo tanto, al modificar los vol?...

Discusión

Describimos un procedimiento detallado para un método no radiactivo basado en la quimioluminiscencia para la medición de la longitud de los telómeros mediante Southern blotting. El protocolo ha sido probado para permitir el uso juicioso de varios reactivos sin comprometer la calidad de los resultados. El tampón de prehibridación e hibridación se puede reutilizar hasta cinco veces. La concentración de enzimas puede variar entre 10-20 U por 1,5-2 μg de ADN genómico sin afectar los resultados. Varios otros componen...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Cell Line
A2780 (Ovarian adenocarcinoma cell line)	Received as a gift
Equipment
ChemiDoc XRS+ (for imaging and UV cross linking)	Biorad	Universal hood II (721BR14277)
Nanodrop (Epoch 2)	Biotek	EPOCH2
Software
TeloTool	Version 1.3
Materials
Acetic Acid	Molychem	64-19-7
Agarose	MP	180720
Amphotericin B	Gibco, ThermoFisher Scientific, USA	15240062
DMEM	HyClone, Cytiva, USA	SH30243.01
Ethylenediamine tetraacetic acid	Molychem	6381-92-6
HI FBS	Gibco, ThermoFisher Scientific, USA	10270106
HCl	Molychem	76-47-01-0
NaCl	Molychem	7647-14-5
NaOH	Molychem	1310-73-2
Nylon membrane	Sigma	11209299001
Penicillin	Gibco, ThermoFisher Scientific, USA	15240062
Sodium dodecyl sulfate	Affymetrix	151-21-3
Streptomycin	Gibco, ThermoFisher Scientific, USA	15240062
Tris	BIORAD	77-86-1
Tris HCl	Sigma Aldrich	1185-53-1
Whatman paper	GE healthcare lifesciences	1001-917
Reagents
1 kb ladder	NEB	N3232S
20x SSC	Invitrogen	15557-036
Anti DIG AP	Telo TAGGG Telomere Length Assay kit	12209136001
Blocking solution 10x	Telo TAGGG Telomere Length Assay kit	12209136001
Cutsmart Buffer	NEB	B6004
Detection buffer 10x	Telo TAGGG Telomere Length Assay kit	12209136001
Dig easy hyb	Telo TAGGG Telomere Length Assay kit	12209136001
Digestion Buffer	Telo TAGGG Telomere Length Assay kit	12209136001
Hinf 1	Telo TAGGG Telomere Length Assay kit	12209136001
Hinf 1 (alternative to kit)	NEB	R0155T
Loading Dye	BIOLABS	N3231S
Maleic acid buffer 10x	Telo TAGGG Telomere Length Assay kit	12209136001
Molecular marker	Telo TAGGG Telomere Length Assay kit	12209136001
Probe	Telo TAGGG Telomere Length Assay kit	12209136001
Rsa 1	Telo TAGGG Telomere Length Assay kit	12209136001
Rsa 1 (alternative to kit)	NEB	R0167L
Substrate	Telo TAGGG Telomere Length Assay kit	12209136001
Wash buffer	Telo TAGGG Telomere Length Assay kit	12209136001