Otimização dos parâmetros de desempenho do ensaio de comprimento telomérico TAGGG

Resumo

Aqui, descrevemos em detalhes o protocolo de quantificação do comprimento dos telômeros usando detecção quimioluminescente não radioativa, com foco na otimização de vários parâmetros de desempenho do kit de ensaio de comprimento de telômeros TAGGG, tais como quantidades de tampão e concentrações de sonda.

Resumo

Telômeros são sequências repetitivas que estão presentes nas extremidades cromossômicas; seu encurtamento é uma característica das células somáticas humanas. O encurtamento ocorre devido a um problema com a replicação final e à ausência da enzima telomerase, responsável pela manutenção do comprimento dos telômeros. Curiosamente, os telômeros também encurtam em resposta a vários processos fisiológicos internos, como estresse oxidativo e inflamação, que podem ser impactados devido a agentes extracelulares como poluentes, agentes infecciosos, nutrientes ou radiação. Assim, o comprimento dos telômeros serve como um excelente biomarcador do envelhecimento e de vários parâmetros fisiológicos de saúde. O kit de ensaio de comprimento de telômero TAGGG é usado para quantificar comprimentos teloméricos médios usando o ensaio de fragmento de restrição de telômeros (TRF) e é altamente reprodutível. No entanto, é um método caro e, por isso, não é empregado rotineiramente para grandes números amostrais. Aqui, descrevemos um protocolo detalhado para uma medição otimizada e econômica do comprimento dos telômeros usando análise de Southern blots ou TRF e detecção baseada em quimioluminescência não radioativa.

Introdução

Telômeros são as sequências repetitivas de DNA presentes no final dos cromossomos. Eles têm repetições em tandem de TTAGGG e mantêm a integridade do genoma protegendo o cromossomo tanto do desgaste quanto do problema de replicação final, o que significa que parte da saliência 3' não pode ser replicada pela DNA polimerase ^1,2. Telômeros curtos levam a anormalidades cromossômicas nas células, devido às quais as células ficam permanentemente presas em um estágio chamado senescência replicativa³. Os telômeros curtos também causam uma série de outros problemas, como disfunção mitocondrial

Protocolo

NOTA: Consulte a Tabela de Materiais para obter detalhes sobre todos os reagentes usados no protocolo abaixo. A Tabela 1 lista reagentes fabricados em laboratório juntamente com volumes otimizados e a Tabela 2 mostra as concentrações de trabalho dos reagentes disponíveis comercialmente.

1. Cultura celular

1. Manter as células cujo comprimento telomérico deve ser medido (usadas aqui foram células A2780, que é uma linhagem celular de adenocarcinoma ovariano) em meio completo de águia modificado de Dulbecco (DMEM) suplementado com 10% de soro fetal bovino (FBS), estrept....

Discussão

Descrevemos um procedimento detalhado para um método não radioativo, baseado em quimioluminescência, para medição do comprimento dos telômeros usando Southern blotting. O protocolo foi testado para permitir o uso criterioso de vários reagentes sem comprometer a qualidade dos resultados. O tampão de pré-hibridização e hibridização pode ser reutilizado até cinco vezes. A concentração da enzima pode variar entre 10-20 U por 1,5-2 μg de DNA genômico sem afetar os resultados. Vários outros componentes do ki.......

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Cell Line
A2780 (Ovarian adenocarcinoma cell line)	Received as a gift
Equipment
ChemiDoc XRS+ (for imaging and UV cross linking)	Biorad	Universal hood II (721BR14277)
Nanodrop (Epoch 2)	Biotek	EPOCH2
Software
TeloTool	Version 1.3
Materials
Acetic Acid	Molychem	64-19-7
Agarose	MP	180720
Amphotericin B	Gibco, ThermoFisher Scientific, USA	15240062
DMEM	HyClone, Cytiva, USA	SH30243.01
Ethylenediamine tetraacetic acid	Molychem	6381-92-6
HI FBS	Gibco, ThermoFisher Scientific, USA	10270106
HCl	Molychem	76-47-01-0
NaCl	Molychem	7647-14-5
NaOH	Molychem	1310-73-2
Nylon membrane	Sigma	11209299001
Penicillin	Gibco, ThermoFisher Scientific, USA	15240062
Sodium dodecyl sulfate	Affymetrix	151-21-3
Streptomycin	Gibco, ThermoFisher Scientific, USA	15240062
Tris	BIORAD	77-86-1
Tris HCl	Sigma Aldrich	1185-53-1
Whatman paper	GE healthcare lifesciences	1001-917
Reagents
1 kb ladder	NEB	N3232S
20x SSC	Invitrogen	15557-036
Anti DIG AP	Telo TAGGG Telomere Length Assay kit	12209136001
Blocking solution 10x	Telo TAGGG Telomere Length Assay kit	12209136001
Cutsmart Buffer	NEB	B6004
Detection buffer 10x	Telo TAGGG Telomere Length Assay kit	12209136001
Dig easy hyb	Telo TAGGG Telomere Length Assay kit	12209136001
Digestion Buffer	Telo TAGGG Telomere Length Assay kit	12209136001
Hinf 1	Telo TAGGG Telomere Length Assay kit	12209136001
Hinf 1 (alternative to kit)	NEB	R0155T
Loading Dye	BIOLABS	N3231S
Maleic acid buffer 10x	Telo TAGGG Telomere Length Assay kit	12209136001
Molecular marker	Telo TAGGG Telomere Length Assay kit	12209136001
Probe	Telo TAGGG Telomere Length Assay kit	12209136001
Rsa 1	Telo TAGGG Telomere Length Assay kit	12209136001
Rsa 1 (alternative to kit)	NEB	R0167L
Substrate	Telo TAGGG Telomere Length Assay kit	12209136001
Wash buffer	Telo TAGGG Telomere Length Assay kit	12209136001