אופטימיזציה של פרמטרי ביצועים של בדיקת אורך הטלומרים TAGGG

Summary

כאן, אנו מתארים בפירוט את הפרוטוקול לכימות אורך הטלומרים באמצעות זיהוי כימילומינסנטי לא רדיואקטיבי, תוך התמקדות באופטימיזציה של פרמטרי ביצועים שונים של ערכת בדיקת אורך הטלומרים TAGGG, כגון כמויות חיץ וריכוזי בדיקה.

Abstract

טלומרים הם רצפים חוזרים הנמצאים בקצוות הכרומוזומליים; הקיצור שלהם הוא מאפיין אופייני של תאים סומטיים אנושיים. הקיצור מתרחש עקב בעיה בשכפול הסופי והיעדר אנזים הטלומראז, האחראי על שמירת אורך הטלומרים. באופן מעניין, הטלומרים גם מתקצרים בתגובה לתהליכים פיזיולוגיים פנימיים שונים, כמו עקה חמצונית ודלקת, שעלולים להיות מושפעים מגורמים חוץ-תאיים כמו מזהמים, חומרים זיהומיים, חומרי מזון או קרינה. לפיכך, אורך הטלומרים משמש סמן ביולוגי מצוין להזדקנות ולפרמטרים בריאותיים פיזיולוגיים שונים. ערכת בדיקת אורך הטלומרים TAGGG משמשת לכימות אורכי הטלומרים הממוצעים באמצעות בדיקת מקטע הגבלת הטלומרים (TRF) והיא ניתנת לשחזור ברמה גבוהה. עם זאת, זוהי שיטה יקרה, ובגלל זה, זה לא משמש באופן שגרתי עבור מספרים מדגם גדול. כאן, אנו מתארים פרוטוקול מפורט למדידה אופטימלית וחסכונית של אורך הטלומרים באמצעות כתמים דרומיים או ניתוח TRF וזיהוי מבוסס כימילומינסנציה לא רדיואקטיבית.

Introduction

טלומרים הם רצפי דנ"א חוזרים הנמצאים בקצה הכרומוזומים. יש להם חזרות דו-צדדיות של TTAGGG והם שומרים על שלמות הגנום על ידי הגנה על הכרומוזום הן מפני שחיקה והן מפני בעיית השכפול הסופית, מה שאומר שחלק מ-3' overhang אינו ניתן לשכפול על ידי DNA פולימראז ^1,2. טלומרים קצרים מובילים להפרעות כרומוזומליות בתאים, שבגללן תאים נעצרים לצמיתות בשלב שנקרא הזדקנות משוכפלת³. טלומרים קצרים גורמים גם לשורה של בעיות אחרות, כגון תפקוד לקוי של המיטוכונדריה ^4,5 ותפקוד לקוי של התאים.

חזרות טלומריות של דנ"א אובדות כאשר התא מתחלק, עם אובדן ממוצע של 25 עד 200 bp בשנה 6, וכתוצאה מכך הזדקנות התא לאחר מספר מסוים של חלוקות⁶. הזדקנות קשורה לתדירות גבוהה יותר של תחלואה נלווית, אשר מסומנת על ידי קיצור אורך הטלומרים⁷. ניתוח מקטע הגבלת טלומר (TRF), כפי שתואר על ידי מנדר, הוא שיטה יקרה מאוד⁸. בגלל זה, זה לא מיושם בעת כימות אורך הטלומרים ברוב המחקרים.

כיום, רוב המחקרים האפידמיולוגיים משתמשים במדידות כמותיות מבוססות תגובת שרשרת פולימראז (qPCR) של אורך הטלומרים. עם זאת, השיטה מבוססת qPCR היא שיטת מדידה יחסית, שכן היא מודדת את היחס בין טלומרים לבין תוצרי הגברה של גנים בעותק יחיד, ולא אורך טלומרים מוחלט. מדידת אורך הטלומרים באמצעות פרוטוקול TRF היא שיטת תקן הזהב, מכיוון שהיא יכולה למדוד את התפלגות אורך הטלומרים במדגם וניתן לבטא את המדידות בערכים מוחלטים בקילו-בסיסים (kb). עם זאת, השימוש בו מוגבל מכיוון שהוא מסורבל, עתיר עבודה ויקר. כאן, אנו מציגים פרוטוקול אופטימלי למדידת אורך הטלומרים באמצעות TRF מבוסס כימילומינסנציה.

ניתוח TRF כולל שבעה שלבים עיקריים: 1) תרבית תאים למיצוי DNA גנומי, 2) מיצוי DNA גנומי באמצעות שיטת פנול:כלורופורם:איזואמילאלכוהול (P:C:I), 3) הגבלת עיכול של DNA גנומי, 4) אלקטרופורזה של ג'ל אגרוז, 5) כתם דרומי של מקטע DNA עיכול הגבלה, 6) הכלאה וגילוי באמצעות כימילומינסנציה - בדיקת הטלומרים המשותקת מומחשת על ידי מצע כימילומינסנטי רגיש ביותר עבור פוספטאז אלקליין, דיסודיום 2-כלורו-5-(4-מתוקסיספירו[1,2-דיוקסטאן-3,2′-(5-כלורוטריציקלו[3.3.1.13.7]דקאן])-4-yl]-1-פניל פוספט (CDP-Star)-ו-7) ניתוח לקבלת אורך וטווח טלומרים ממוצע ומידע טווח ממריחות טלומריות אלה.

Protocol

הערה: עיין בטבלת החומרים לקבלת פרטים על כל הריאגנטים המשמשים בפרוטוקול להלן. טבלה 1 מגייסת ריאגנטים מתוצרת מעבדה יחד עם נפחים ממוטבים, וטבלה 2 מציגה ריכוזי עבודה של ריאגנטים זמינים מסחרית.

1. תרבית תאים

1. לשמור על תאים שאורך הטלומרים שלהם יימדד (שימשו כאן תאי A2780, שהוא קו תאי אדנוקרצינומה שחלתי) בתווך הנשר המעובד של דולבקו (DMEM) שלם בתוספת 10% נסיוב בקר עוברי (FBS), סטרפטומיצין, פניצילין ואמפוטריצין B בצלחת פטרי של 6 ס"מ. יש לדגור בטמפרטורה של 37°C בסביבה לחה ומבוקרת המכילה 5% פחמן דו חמצני עד שהתאים יהיו 80%-100% ביחד.
2. הסר את המדיה ושטוף עם 5 מ"ל של 1x פוספט-buffered מלוחים (PBS).
3. טפל בתאים עם 1 מ"ל של חומצה טריפסין-אתילאנדיאמיןטטראצטית (EDTA) לניתוק התאים על ידי דגירה ב 37 ° C למשך 3-5 דקות.
4. הוסף 2 מ"ל של מדיה מלאה DMEM כדי להשבית את הטריפסין ולאסוף את התאים בצינור צנטריפוגה.
5. מטילים את התאים על 2,348 × גרם במשך 5 דקות.
6. שטפו את הגלולה עם 1x PBS וצנטריפוגה ב 2,348 × גרם במשך 5 דקות.
7. יש לאחסן את הגלולה בטמפרטורה של -80°C עד לשימוש נוסף.
   הערה: ספירת התאים עשויה להשתנות בהתאם לקו התא. השגנו כ 2.5 × 10⁶ תאים במקרה של קו התאים A2780, אשר משמש בשלבים נוספים.

2. בידוד DNA גנומי

1. הוסף 500 μL של חיץ ליזיס (10 mM tris-Cl, pH 8.0; 25 mM EDTA, pH 8.0; 100 mM NaCl; 0.5% w/v נתרן דודציל סולפט) לכדורית התא וערבב בעדינות באמצעות קצה חתוך (עם קוטר פתיחה של מינימום 2 מ"מ). מוסיפים 20 מיקרוגרם/מ"ל RNase A טרי מוכן ומערבבים בעדינות על ידי היפוך.
2. יש לדגור בטמפרטורה של 37°C למשך 30 דקות ומדי פעם להפוך את הצינור במהלך הדגירה.
3. מוסיפים פרוטאינאז K לריכוז סופי של 100 מק"ג/מ"ל ומערבבים בעדינות בהיפוך 10 פעמים. לדגור ב 55 ° C במשך 2 שעות. הפוך את הצינור במרווחי זמן קבועים (כל 10 דקות) במהלך הדגירה.
4. הוסף 500 μL של פנול:כלורופורם:מגיב אלכוהול איזואמיל (25:24:1) וערבב בעדינות על ידי היפוך 20 פעמים. צנטריפוגה ב 9,391 × גרם במשך 15 דקות בטמפרטורת החדר (סביב 25 ° C).
   הערה: איור 1A מראה את שלוש השכבות המתקבלות לאחר צנטריפוגה.
5. מוציאים את השכבה המימית העליונה הצמיגה משלוש השכבות הגלויות, מניחים בצינור טרי בעזרת קצה חתוך, ומוסיפים כמות שווה של כלורופורם. מערבבים בהיפוך עדין 20 פעמים.
6. צנטריפוגה את הצינורות ב 9,391 × גרם במשך 15 דקות בטמפרטורת החדר.
7. אספו את השכבה המימית והוסיפו כמות מתאימה של 5 M NaCl כך שהריכוז הסופי של NaCl יהיה 0.2 M.
8. הוסף שני כרכים של 100% אתנול. מערבבים בהיפוך עדין 20-25 פעמים. צנטריפוגה ב 15,871 × גרם במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר.
9. הסר את supernatant ולהוסיף 500 μL של 70% אתנול לשטוף את הכדור. צנטריפוגה ב 15,871 × גרם במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר.
10. מוציאים את הסופרנטנט, מייבשים את הגלולה באוויר למשך מספר דקות, ומוסיפים 50 מיקרוליטר מים סטריליים ללא נוקלאז. תנו לדנ"א להתייבש למשך 1-2 ימים בטמפרטורת החדר. מערבבים על ידי pipetting, באמצעות קצה החתוך.
11. למדוד את ריכוז הדנ"א באמצעות ספקטרופוטומטריה אולטרה סגולה (UV). דללו מחדש את הדגימות, במידת הצורך, באמצעות מים סטריליים נטולי נוקלאז כדי לקבל ריכוז מינימלי של 300-500 ננוגרם/μL.
12. בדקו את שלמות הדנ"א על-ידי הרצתו על ג'ל אגרוז 1% (איור 1B).
13. אחסנו את הדנ"א המדולל בטמפרטורה של -20°C עד לשימוש נוסף.

3. עיכול של DNA גנומי

1. הכינו תערובת אנזימים של Rsa1 (20 U) ו-Hinf1 (20 U) והוסיפו 2 מיקרוליטר של חיץ הגבלת עיכול לכל תגובה.
2. קח נפח מתאים של DNA גנומי כך שהכמות הכוללת של DNA היא 1.5 מיקרוגרם. לפצות את הנפח עם מים סטריליים ללא נוקלאז, כך שהנפח הכולל לאחר הוספת האנזים הוא 20 μL.
3. מערבבים היטב על ידי הקשה, ואחריה סיבוב דופק.
4. לדגור על התערובת ב 37 ° C במשך 2 שעות.

4. אלקטרופורזה ג'ל אגרוז

1. הכינו ג'ל אגרוז בגודל 10 ס"מ × 15% 0.8% בחיץ 1x tris אצטט EDTA (TAE) באמצעות אגרוז באיכות גבוהה.
2. הוסף 5 μL של צבע העמסה לכל דגימת DNA גנומי מעוכל, ובכך להפוך את נפח הסופי 25 μL, ולטעון את הדגימות על הג'ל.
3. הכינו תערובת סמנים מולקולריים באמצעות 1 μL של סמן מולקולרי (סולם), 3 μL של מים סטריליים ללא נוקלאז, ו 1 μL של צבע העמסה פי 5.
4. עומס 5 μL של תערובת סמן מולקולרי משני צידי הדגימות הגנומיות של הדנ"א הגנומי אם יש מספר גבוה יותר של דגימות (~10), או רק בצד אחד אם יש פחות או שווה לחמש דגימות.
5. הפעל את הג'ל ב 5 V / cm במשך 6 שעות. לאחר סיום הריצה, עשו חריץ בפינה אחת של הג'ל כדי לסמן את סדר הטעינה.
6. יש לטבול את הג'ל ב-0.25M HCl למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר עם תסיסה עדינה.
7. יש לשטוף את הג'ל פעמיים במים מזוקקים.
8. נטרל את הדנ"א על ידי טבילת הג'ל בתמיסה של 0.5 M NaOH ו- 1.5 M NaCl פעמיים למשך 15 דקות כל אחת בטמפרטורת החדר עם תסיסה עדינה.
9. יש לשטוף את הג'ל פעמיים במים מזוקקים.
10. נטרלו את הדנ"א על ידי טבילת הג'ל בתמיסה של 0.5 M tris-HCl ו-3M NaCl (pH 7.5) פעמיים למשך 15 דקות בטמפרטורת החדר עם תסיסה עדינה.

5. כתם דרומי

1. חותכים קרום ניילון בגודל 10 ס"מ × 12 ס"מ ויוצרים חריץ באותו מיקום כמו הג'ל.
2. הפעל את הממברנה על-ידי טבילה במים מזוקקים ולאחר מכן חיץ 20x נתרן ציטראט (SSC) (ראה טבלה 1).
3. הגדר את ההעברה.
   1. קחו מגש זכוכית נקי והניחו בו מגש נוסף במצב הפוך. צור פתיל באמצעות נייר סינון רגיל כך שהקצוות ייגעו בבסיס המגש החיצוני.
   2. מניחים את הג'ל על גבי נייר הפילטר. מניחים בעדינות את קרום הניילון הפעיל מעל הג'ל, כשהחריצים חופפים, ומסירים בועות אוויר על ידי גלגול מוט זכוכית.
   3. הניחו ערימה של 2 ס"מ של נייר סינון תאית בקוטר 9.5 ס"מ × בקוטר 11.5 ס"מ, ולאחר מכן ערימה של נייר סינון רגיל בקוטר 6 ס"מ באותם ממדים. מקם משקל על גבי מערך זה כך שתהיה חלוקת משקל שווה מתחת. מלא את המגש החיצוני במאגר SSC של 20x (ראה איור 2).
   4. השאר את ההתקנה להעברה למשך הלילה.
4. לאחר ההעברה הדרומית, קבע את ה- DNA המועבר על הממברנה על ידי קישור UV על טרנסילמייטור UV או קרוסלינקר UV. השתמש במנורת 302 ננומטר 8 ואט למשך 5 דקות, או במנורת 254 ננומטר 8 ואט למשך 2 דקות, המתאימה לכ- 120 mJ. ודא שצד הממברנה שעליו מועבר הדנ"א פונה אל המנורה.
5. שטפו את הממברנה פעמיים עם 25 מ"ל של 2x SSC buffer.
6. השהה את הפרוטוקול, במידת הצורך, על ידי ייבוש מלא של הכתם ואחסונו, בטמפרטורה של 2-8 מעלות צלזיוס לאחר עטיפה רופפת בנייר כסף, עד לעיבוד נוסף.

6. הכלאה וזיהוי כימילומינסנציה

1. מחממים מראש את מאגר טרום הכלאה ל 42 מעלות צלזיוס.
   הערה: השלבים הבאים כוללים נפחים של תמיסות/מאגרים לשימוש לכל 100 ס"מ² של כתם.
2. לדגור את הממברנה ב 10 מ"ל של חיץ prehybridization במשך 1 שעה ב 42 ° C עם תסיסה עדינה עבור prehybridization.
3. הוסף 0.5 μL של בדיקת טלומרים לכל 5 מ"ל של חיץ טרום הכלאה שחומם מראש כדי ליצור את פתרון ההכלאה.
4. לדגור את הכתם ב 10 מ"ל של פתרון הכלאה ב 42 ° C במשך 3 שעות עם תסיסה עדינה.
5. שטפו את הכתם עם חיץ 1 מחמיר (טבלה 1) פעמיים במשך 10 דקות (25 מ"ל כל אחת) בטמפרטורת החדר עם תסיסה עדינה.
6. חממו מראש חיץ מחמיר 2 (טבלה 1) למשך 30 דקות ב-50°C.
7. יש לשטוף את הכתם עם חיץ מחמיר 2 פעמיים למשך 15 דקות (25 מ"ל כל אחת) ב-50°C עם תסיסה עדינה.
8. יש לשטוף עם 15 מ"ל של חיץ כביסה במשך 5 דקות עם תסיסה עדינה ב-RT.
9. דגרו על הממברנה ב-10 מ"ל של תמיסת חסימה 1x טרייה שהוכנה למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר עם תסיסה עדינה.
10. לדגור על הממברנה ב 10 מ"ל של אנטי digioxigenin מצומד עם תמיסת עבודה phosphatase אלקליין (ראה טבלה 2) במשך 30 דקות ב RT עם תסיסה עדינה.
11. יש לשטוף את הכתם פעמיים עם חיץ כביסה בטמפרטורת החדר למשך 15 דקות בתסיסה עדינה.
12. יש לדגור ב-10 מ"ל של חיץ זיהוי למשך 5 דקות ב-RT עם תסיסה עדינה.
13. הסר את מאגר הגילוי העודף ושמור את הממברנה כשהדנ"א פונה כלפי מעלה על שקית הכלאה או יריעת אצטט. הוסף ~ 1-1.5 מ"ל של תמיסת מצע טיפה על הממברנה, מיד להניח יריעה נוספת על זה, לדגור במשך 5 דקות ב RT.
14. סחטו את תמיסת המצע העודפת להדמיה.
15. צלם את הכתם במשך כ -20 דקות במערכת הדמיה תיעוד ג'ל, איסוף תמונות מרובות בנקודות זמן שונות. בחרו תמונות בלתי רוויות לניתוח נוסף.
    הערה: במקרה שהאות חלש, ניתן לבצע הדמיה לפרק זמן ארוך יותר.

7. ניתוח

1. לאחר קבלת קבצי התמונה, ייצא אותם לפרסום בפורמט .tif ברזולוציה הגבוהה ביותר האפשרית (600 dpi במקרה זה).
2. התקן את תוכנת Telotool . לשם כך נדרשת גרסה ספציפית (R2012a) של MATLAB (זמינה באופן חופשי) כדי לפעול.
3. פתח את התוכנה ולחץ על טען קובץ תמונה כפתור בפינה השמאלית העליונה.
4. לאחר טעינת התמונה, לחץ על הפוך תמונה, כך שרקע התמונה יהיה שחור והמריחות/הפסים יהיו לבנים.
5. חתוך את התמונה עם הפינות העליונות החל מהבארות. לאחר ביצוע בחירת החיתוך, לחץ לחיצה ימנית בתוכה ובחר חתוך תמונה.
6. לאחר חיתוך התמונה, לחץ על חשב נתיבים ואפשר לזיהוי נתיב להתרחש באופן אוטומטי.
7. אם הנתיבים לא זוהו כראוי, לדוגמה, אם נתיבים מסוימים לא זוהו כלל, או אם זוהו נתיבים נוספים או חלקיים, בצע התאמת נתיב כמתואר להלן.
   1. לחץ על התאמת נתיבים ובחלון הקופץ שנפתח, הוסף ו/או כוונן נתיבים לפי הצורך, ולחץ על החל וסגור.
8. לאחר התאמת הנתיבים, יש לוודא כי בכל אחד מהנתיבים נראית נקודה אדומה ולהתאים את הסולמות באמצעות כפתור התאמת סולם , תוך הקפדה על כך שמספר הפסגות בשני נתיבי הסולם נמצא באותו מיקום. הסר פסגות חיצוניות באמצעות הלחצן Delete Extremum .
9. לאחר התאמת הסולות, בחר פרופילי נתיב, לחץ על התאמת סולם ובחר התאמה פולינומית.
10. לחץ על קו מגמה, בהתאם להמלצת התוכנה ולאחר מכן בחר תוקן באפשרות הבאה.
11. לחץ על קבל תוצאות כדי להציג את התוצאות כטבלה, שבה שורת TRF ממוצעת היא מדידת אורך הטלומרים של דגימות הנתיבים בהתאמה.
12. לחץ על שמור הכל כדי לאחסן את התוצאות בצורה של גיליון אלקטרוני.

תוצאות

הדנ"א הגנומי שחולץ (gDNA), שהופעל על ג'ל אגרוז 1%, הראה שלמות טובה, כפי שמוצג באיור 1B, מה שמצביע על כך שהדגימה יכולה לשמש לעיבוד נוסף במורד הזרם של TRFs. לאחר מכן בוצעה בדיקת TRF על ידי שינוי נפחי הפתרונות הנדרשים בכל שלב (ראה טבלה 1 וטבלה 2). אות TRF נראה בבירור (

Discussion

אנו מתארים הליך מפורט לשיטה לא רדיואקטיבית, מבוססת כימילומינסנציה למדידת אורך הטלומרים באמצעות כתם דרומי. הפרוטוקול נבדק כדי לאפשר שימוש מושכל במספר ריאגנטים ללא פשרות על איכות התוצאות. ניתן לעשות שימוש חוזר במאגר הפרה-הכלאה וההכלאה עד חמש פעמים. ריכוז האנזימים יכול לנוע בין 10-20 U לכל 1.5-2 ?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Cell Line
A2780 (Ovarian adenocarcinoma cell line)	Received as a gift
Equipment
ChemiDoc XRS+ (for imaging and UV cross linking)	Biorad	Universal hood II (721BR14277)
Nanodrop (Epoch 2)	Biotek	EPOCH2
Software
TeloTool	Version 1.3
Materials
Acetic Acid	Molychem	64-19-7
Agarose	MP	180720
Amphotericin B	Gibco, ThermoFisher Scientific, USA	15240062
DMEM	HyClone, Cytiva, USA	SH30243.01
Ethylenediamine tetraacetic acid	Molychem	6381-92-6
HI FBS	Gibco, ThermoFisher Scientific, USA	10270106
HCl	Molychem	76-47-01-0
NaCl	Molychem	7647-14-5
NaOH	Molychem	1310-73-2
Nylon membrane	Sigma	11209299001
Penicillin	Gibco, ThermoFisher Scientific, USA	15240062
Sodium dodecyl sulfate	Affymetrix	151-21-3
Streptomycin	Gibco, ThermoFisher Scientific, USA	15240062
Tris	BIORAD	77-86-1
Tris HCl	Sigma Aldrich	1185-53-1
Whatman paper	GE healthcare lifesciences	1001-917
Reagents
1 kb ladder	NEB	N3232S
20x SSC	Invitrogen	15557-036
Anti DIG AP	Telo TAGGG Telomere Length Assay kit	12209136001
Blocking solution 10x	Telo TAGGG Telomere Length Assay kit	12209136001
Cutsmart Buffer	NEB	B6004
Detection buffer 10x	Telo TAGGG Telomere Length Assay kit	12209136001
Dig easy hyb	Telo TAGGG Telomere Length Assay kit	12209136001
Digestion Buffer	Telo TAGGG Telomere Length Assay kit	12209136001
Hinf 1	Telo TAGGG Telomere Length Assay kit	12209136001
Hinf 1 (alternative to kit)	NEB	R0155T
Loading Dye	BIOLABS	N3231S
Maleic acid buffer 10x	Telo TAGGG Telomere Length Assay kit	12209136001
Molecular marker	Telo TAGGG Telomere Length Assay kit	12209136001
Probe	Telo TAGGG Telomere Length Assay kit	12209136001
Rsa 1	Telo TAGGG Telomere Length Assay kit	12209136001
Rsa 1 (alternative to kit)	NEB	R0167L
Substrate	Telo TAGGG Telomere Length Assay kit	12209136001
Wash buffer	Telo TAGGG Telomere Length Assay kit	12209136001