Optimierung der Leistungsparameter des TAGGG Telomerlängen-Assays

Zusammenfassung

Hier beschreiben wir detailliert das Protokoll zur Quantifizierung der Telomerlänge mittels nicht-radioaktiver Chemilumineszenzdetektion, wobei der Schwerpunkt auf der Optimierung verschiedener Leistungsparameter des TAGGG-Telomerlängen-Assay-Kits liegt, wie z.B. Puffermengen und Sondenkonzentrationen.

Zusammenfassung

Telomere sind sich wiederholende Sequenzen, die an den Chromosomenenden vorhanden sind. Ihre Verkürzung ist ein charakteristisches Merkmal menschlicher Körperzellen. Die Verkürzung tritt aufgrund eines Problems mit der Endreplikation und des Fehlens des Telomerase-Enzyms auf, das für die Aufrechterhaltung der Telomerlänge verantwortlich ist. Interessanterweise verkürzen sich Telomere auch als Reaktion auf verschiedene interne physiologische Prozesse wie oxidativen Stress und Entzündungen, die durch extrazelluläre Stoffe wie Schadstoffe, Infektionserreger, Nährstoffe oder Strahlung beeinflusst werden können. Somit dient die Telomerlänge als hervorragender Biomarker für das Altern und verschiedene physiologische Gesundheitsparameter. Das TAGGG Telomerlängen-Assay-Kit wird zur Quantifizierung der durchschnittlichen Telomerlängen mit dem Telomerrestriktionsfragment (TRF)-Assay verwendet und ist hochgradig reproduzierbar. Es handelt sich jedoch um eine teure Methode, die daher nicht routinemäßig für große Stichprobenzahlen eingesetzt wird. In dieser Arbeit beschreiben wir ein detailliertes Protokoll für eine optimierte und kostengünstige Messung der Telomerlänge mittels Southern Blots oder TRF-Analyse und nicht-radioaktiver Chemilumineszenz-basierter Detektion.

Einleitung

Telomere sind die sich wiederholenden DNA-Sequenzen, die am Ende der Chromosomen vorhanden sind. Sie haben Tandemwiederholungen von TTAGGG und bewahren die Genomintegrität, indem sie das Chromosom sowohl vor dem Ausfransen als auch vor dem Endreplikationsproblem schützen, was bedeutet, dass ein Teil des 3'-Überhangs nicht von der DNA-Polymerase ^1,2 repliziert werden kann. Kurze Telomere führen zu Chromosomenanomalien in den Zellen, wodurch die Zellen in einem Stadium, das als replikative Seneszenz bezeichnet^wird, dauerhaft blockiert werden 3. Kurze Telomere verursachen auch eine Vielzah....

Protokoll

HINWEIS: In der Materialtabelle finden Sie Details zu allen Reagenzien, die im Protokoll unten verwendet werden. Tabelle 1 enthält im Labor hergestellte Reagenzien zusammen mit optimierten Volumina und Tabelle 2 zeigt die Arbeitskonzentrationen kommerziell erhältlicher Reagenzien.

1. Zellkultur

1. Zellen, deren Telomerlänge gemessen werden soll (hier wurden A2780-Zellen verwendet, bei denen es sich um eine ovarielle Adenokarzinom-Zelllinie handelt), werden in Dulbeccos modifiziertem Eagle-Medium (DMEM) Komplettmedium mit 10 % fötalem Kälberserum (FBS), Streptomycin, ....

Diskussion

Wir beschreiben ein detailliertes Verfahren für eine nicht-radioaktive, Chemilumineszenz-basierte Methode zur Telomerlängenmessung mittels Southern Blotting. Das Protokoll wurde getestet, um die vernünftige Verwendung mehrerer Reagenzien ohne Kompromisse bei der Qualität der Ergebnisse zu ermöglichen. Der Vorhybridisierungs- und Hybridisierungspuffer kann bis zu fünfmal wiederverwendet werden. Die Enzymkonzentration kann zwischen 10 und 20 U pro 1,5 bis 2 μg genomischer DNA variieren, ohne dass die Ergebnisse beei.......

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Cell Line
A2780 (Ovarian adenocarcinoma cell line)	Received as a gift
Equipment
ChemiDoc XRS+ (for imaging and UV cross linking)	Biorad	Universal hood II (721BR14277)
Nanodrop (Epoch 2)	Biotek	EPOCH2
Software
TeloTool	Version 1.3
Materials
Acetic Acid	Molychem	64-19-7
Agarose	MP	180720
Amphotericin B	Gibco, ThermoFisher Scientific, USA	15240062
DMEM	HyClone, Cytiva, USA	SH30243.01
Ethylenediamine tetraacetic acid	Molychem	6381-92-6
HI FBS	Gibco, ThermoFisher Scientific, USA	10270106
HCl	Molychem	76-47-01-0
NaCl	Molychem	7647-14-5
NaOH	Molychem	1310-73-2
Nylon membrane	Sigma	11209299001
Penicillin	Gibco, ThermoFisher Scientific, USA	15240062
Sodium dodecyl sulfate	Affymetrix	151-21-3
Streptomycin	Gibco, ThermoFisher Scientific, USA	15240062
Tris	BIORAD	77-86-1
Tris HCl	Sigma Aldrich	1185-53-1
Whatman paper	GE healthcare lifesciences	1001-917
Reagents
1 kb ladder	NEB	N3232S
20x SSC	Invitrogen	15557-036
Anti DIG AP	Telo TAGGG Telomere Length Assay kit	12209136001
Blocking solution 10x	Telo TAGGG Telomere Length Assay kit	12209136001
Cutsmart Buffer	NEB	B6004
Detection buffer 10x	Telo TAGGG Telomere Length Assay kit	12209136001
Dig easy hyb	Telo TAGGG Telomere Length Assay kit	12209136001
Digestion Buffer	Telo TAGGG Telomere Length Assay kit	12209136001
Hinf 1	Telo TAGGG Telomere Length Assay kit	12209136001
Hinf 1 (alternative to kit)	NEB	R0155T
Loading Dye	BIOLABS	N3231S
Maleic acid buffer 10x	Telo TAGGG Telomere Length Assay kit	12209136001
Molecular marker	Telo TAGGG Telomere Length Assay kit	12209136001
Probe	Telo TAGGG Telomere Length Assay kit	12209136001
Rsa 1	Telo TAGGG Telomere Length Assay kit	12209136001
Rsa 1 (alternative to kit)	NEB	R0167L
Substrate	Telo TAGGG Telomere Length Assay kit	12209136001
Wash buffer	Telo TAGGG Telomere Length Assay kit	12209136001