Ottimizzazione dei parametri prestazionali del saggio di lunghezza dei telomeri TAGGG

Riepilogo

Qui, descriviamo in dettaglio il protocollo per quantificare la lunghezza dei telomeri utilizzando la rilevazione chemiluminescente non radioattiva, con particolare attenzione all'ottimizzazione di vari parametri prestazionali del kit di analisi della lunghezza dei telomeri TAGGG, come le quantità tampone e le concentrazioni della sonda.

Abstract

I telomeri sono sequenze ripetitive presenti alle estremità cromosomiche; Il loro accorciamento è una caratteristica delle cellule somatiche umane. L'accorciamento si verifica a causa di un problema con la replicazione finale e l'assenza dell'enzima telomerasi, che è responsabile del mantenimento della lunghezza dei telomeri. È interessante notare che i telomeri si accorciano anche in risposta a vari processi fisiologici interni, come lo stress ossidativo e l'infiammazione, che possono essere influenzati a causa di agenti extracellulari come inquinanti, agenti infettivi, nutrienti o radiazioni. Pertanto, la lunghezza dei telomeri funge da eccellente biomarcatore dell'invecchiamento e di vari parametri fisiologici di salute. Il kit di analisi della lunghezza dei telomeri TAGGG viene utilizzato per quantificare le lunghezze medie dei telomeri utilizzando il test TRF (telomere restriction fragment) ed è altamente riproducibile. Tuttavia, è un metodo costoso e, a causa di ciò, non viene utilizzato di routine per grandi numeri di campioni. Qui, descriviamo un protocollo dettagliato per una misurazione ottimizzata ed economica della lunghezza dei telomeri utilizzando Southern blots o analisi TRF e rilevamento basato sulla chemiluminescenza non radioattiva.

Introduzione

I telomeri sono le sequenze ripetitive di DNA presenti alla fine dei cromosomi. Hanno ripetizioni in tandem di TTAGGG e mantengono l'integrità del genoma proteggendo il cromosoma sia dallo sfilacciamento che dal problema della replicazione finale, il che significa che parte della sporgenza 3' non può essere replicata dalla DNA polimerasi ^1,2. I telomeri corti portano ad anomalie cromosomiche nelle cellule, a causa delle quali le cellule vengono arrestate permanentemente in uno stadio chiamato senescenza replicativa³. I telomeri corti causano anche una miriade di altri problemi, come la disfunzione mitocondriale ^4,5 e la disfunzione cellulare.

Le ripetizioni telomeriche del DNA vengono perse man mano che la cellula si divide, con una perdita media da 25 a 200 bp all'anno 6, con conseguente senescenza cellulare dopo un certo numero di divisioni⁶. L'invecchiamento è associato a una maggiore frequenza di comorbidità, che è caratterizzata da un accorciamento della lunghezza dei telomeri⁷. L'analisi dei frammenti di restrizione dei telomeri (TRF), come descritto da Mender, è un metodo molto costoso⁸. Per questo motivo, non viene implementato durante la quantificazione della lunghezza dei telomeri nella maggior parte degli studi.

Attualmente, la maggior parte degli studi epidemiologici impiega misurazioni quantitative basate sulla reazione a catena della polimerasi (qPCR) della lunghezza dei telomeri. Tuttavia, il metodo basato su qPCR è un metodo di misurazione relativo, in quanto misura il rapporto tra telomeri e prodotti di amplificazione genica a copia singola e non la lunghezza assoluta dei telomeri. La misurazione della lunghezza dei telomeri utilizzando il protocollo TRF è il metodo gold standard, in quanto può misurare la distribuzione della lunghezza dei telomeri nel campione e le misurazioni possono essere espresse in valori assoluti in kilobasi (kb). Tuttavia, il suo uso è limitato perché è ingombrante, laborioso e costoso. Qui, presentiamo un protocollo ottimizzato per la misurazione della lunghezza dei telomeri utilizzando TRF basati su chemiluminescenza.

L'analisi TRF comprende sette fasi principali: 1) coltura di cellule per l'estrazione del DNA genomico, 2) estrazione del DNA genomico utilizzando il metodo fenolo:cloroformio:isoamilalcol (P:C:I), 3) digestione di restrizione del DNA genomico, 4) elettroforesi su gel di agarosio, 5) Southern blotting del frammento di DNA della digestione di restrizione, 6) ibridazione e rilevamento tramite Chemiluminescenza - La sonda telomerica immobilizzata viene visualizzata da un substrato chemiluminescente altamente sensibile per la fosfatasi alcalina, il disodio 2-cloro-5-(4-metossispiro[1,2-dioxetano-3,2′-(5-clorotriciclo[3.3.1.13.7]decano])-4-il]-1-fenil fosfato (CDP-Star)-e 7) per ottenere informazioni sulla lunghezza media dei telomeri e sulla gamma da questi strisci telomerici.

Protocollo

NOTA: Vedere la tabella dei materiali per i dettagli su tutti i reagenti utilizzati nel protocollo riportato di seguito. La Tabella 1 elenca i reagenti prodotti in laboratorio insieme ai volumi ottimizzati e la Tabella 2 mostra le concentrazioni operative dei reagenti disponibili in commercio.

1. Coltura cellulare

1. Mantenere le cellule la cui lunghezza dei telomeri deve essere misurata (qui erano le cellule A2780, che è una linea cellulare di adenocarcinoma ovarico) nel mezzo completo di Dulbecco con il mezzo di aquila modificato (DMEM) integrato con siero bovino fetale al 10% (FBS), streptomicina, penicillina e amfotericina B in una capsula di Petri di 6 cm. Incubare a 37 °C in un ambiente umidificato e controllato contenente il 5% di anidride carbonica fino a quando le cellule sono confluenti all'80% -100%.
2. Rimuovere il fluido e lavare con 5 ml di soluzione salina tamponata fosfato (PBS) 1x.
3. Trattare le cellule con 1 mL di acido tripsina-etilendiamminotetraacetico (EDTA) per staccare le cellule incubando a 37 °C per 3-5 minuti.
4. Aggiungere 2 mL di DMEM completo per inattivare la tripsina e raccogliere le cellule in una provetta di centrifugazione.
5. Pellettare le cellule a 2.348 × g per 5 minuti.
6. Lavare il pellet con 1x PBS e centrifugare a 2.348 × g per 5 minuti.
7. Conservare il pellet a -80 °C fino a ulteriore utilizzo.
   NOTA: il conteggio delle celle può variare a seconda della linea cellulare. Abbiamo ottenuto circa 2,5 × 10⁶ celle nel caso della linea cellulare A2780, che viene utilizzata in fasi successive.

2. Isolamento del DNA genomico

1. Aggiungere 500 μL di tampone di lisi (10 mM tris-Cl, pH 8,0; 25 mM EDTA, pH 8,0; 100 mM NaCl; 0,5% p/v di sodio dodecilsolfato di sodio) al pellet cellulare e mescolare delicatamente utilizzando una punta tagliata (con un diametro di apertura di almeno 2 mm). Aggiungere 20 μg/mL di RNasi A appena preparata e mescolare delicatamente per inversione.
2. Incubare a 37 °C per 30 minuti e capovolgere occasionalmente il tubo durante l'incubazione.
3. Aggiungere la proteinasi K ad una concentrazione finale di 100 μg/mL e mescolare delicatamente per inversione 10 volte. Incubare a 55 °C per 2 ore. Capovolgere il tubo a intervalli regolari (ogni 10 minuti) durante l'incubazione.
4. Aggiungere 500 μL di reagente fenolo:cloroformio:alcool isoamilico (25:24:1) e mescolare delicatamente per inversione 20 volte. Centrifugare a 9.391 × g per 15 minuti a temperatura ambiente (circa 25 °C).
   NOTA: La figura 1A mostra i tre strati ottenuti dopo centrifugazione.
5. Rimuovere lo strato acquoso superiore viscoso dai tre strati visibili, metterlo in un tubo fresco usando una punta tagliata e aggiungere una quantità uguale di cloroformio. Mescolare per inversione delicata 20 volte.
6. Centrifugare i tubi a 9.391 × g per 15 minuti a temperatura ambiente.
7. Raccogliere lo strato acquoso e aggiungere una quantità appropriata di 5 M NaCl in modo che la concentrazione finale di NaCl sia 0,2 M.
8. Aggiungere due volumi di etanolo al 100%. Mescolare per inversione delicata 20-25 volte. Centrifugare a 15.871 × g per 5 minuti a temperatura ambiente.
9. Rimuovere il surnatante e aggiungere 500 μL di etanolo al 70% per lavare il pellet. Centrifugare a 15.871 × g per 5 minuti a temperatura ambiente.
10. Rimuovere il surnatante, asciugare all'aria il pellet per alcuni minuti e aggiungere 50 μL di acqua sterile priva di nucleasi. Lasciare reidratare il DNA per 1-2 giorni a temperatura ambiente. Mescolare mediante pipettaggio, utilizzando la punta tagliata.
11. Misurare la concentrazione di DNA utilizzando la spettrofotometria ultravioletta (UV). Ridiluire i campioni, se necessario, utilizzando acqua sterile priva di nucleasi per ottenere una concentrazione minima di 300-500 ng/μL.
12. Verificare l'integrità del DNA eseguendolo su un gel di agarosio all'1% (Figura 1B).
13. Conservare il DNA diluito a -20 °C fino a un ulteriore utilizzo.

3. Digestione del DNA genomico

1. Preparare una miscela enzimatica di Rsa1 (20 U) e Hinf1 (20 U) e aggiungere 2 μL di tampone di digestione di restrizione per reazione.
2. Prendi un volume appropriato di DNA genomico in modo tale che la quantità totale di DNA sia di 1,5 μg. Preparare il volume con acqua sterile priva di nucleasi, in modo che il volume totale dopo l'aggiunta dell'enzima sia di 20 μL.
3. Mescolare bene toccando, seguito da un giro di impulsi.
4. Incubare la miscela a 37 °C per 2 ore.

4. Elettroforesi su gel di agarosio

1. Preparare un gel di agarosio da 10 cm × 15 cm allo 0,8% in 1x tampone tris acetato EDTA (TAE) utilizzando agarosio di alta qualità.
2. Aggiungere 5 μL di colorante di carico a ciascun campione di DNA genomico digerito, ottenendo così il volume finale di 25 μL, e caricare i campioni sul gel.
3. Preparare una miscela di marcatori molecolari utilizzando 1 μL di marcatore molecolare (scala), 3 μL di acqua sterile priva di nucleasi e 1 μL di colorante caricante 5x.
4. Caricare 5 μL di miscela di marcatori molecolari su entrambi i lati dei campioni digeriti dal DNA genomico se c'è un numero maggiore di campioni (~ 10), o solo su un lato se ci sono meno o uguali a cinque campioni.
5. Eseguire il gel a 5 V/cm per 6 ore. Una volta completata la corsa, fare una tacca su un angolo del gel per contrassegnare l'ordine di caricamento.
6. Immergere il gel in 0,25 M HCl per 10 minuti a temperatura ambiente con delicata agitazione.
7. Risciacquare il gel due volte con acqua distillata.
8. Denaturare il DNA immergendo il gel in una soluzione di 0,5 M NaOH e 1,5 M NaCl due volte per 15 minuti ciascuno a temperatura ambiente con delicata agitazione.
9. Risciacquare il gel due volte con acqua distillata.
10. Neutralizzare il DNA immergendo il gel in una soluzione di 0,5 M tris-HCl e 3 M NaCl (pH 7,5) due volte per 15 minuti a temperatura ambiente con delicata agitazione.

5. Southern blotting

1. Tagliare una membrana di nylon di 10 cm × 12 cm e fare una tacca nella stessa posizione del gel.
2. Attivare la membrana immergendo in acqua distillata seguita da 20 volte tampone citrato salino di sodio (SSC) (vedere Tabella 1).
3. Impostare il trasferimento.
   1. Prendi un vassoio di vetro pulito e posiziona un altro vassoio in posizione invertita. Creare uno stoppino usando carta da filtro normale in modo che le estremità tocchino la base del vassoio esterno.
   2. Posizionare il gel sopra la carta da filtro. Posizionare delicatamente la membrana di nylon attivata sopra il gel, con le tacche sovrapposte, e rimuovere eventuali bolle d'aria arrotolando su un'asta di vetro.
   3. Posizionare un mucchio di 2 cm di carta da filtro di 9,5 cm × 11,5 cm di cellulosa, seguito da un mucchio di 6 cm di carta da filtro normale delle stesse dimensioni. Posiziona un peso sopra questa configurazione in modo che ci sia una distribuzione del peso uguale sotto. Riempire il vassoio esterno con un buffer SSC 20x (vedere la Figura 2).
   4. Lasciare la configurazione per il trasferimento notturno.
4. Dopo il trasferimento verso sud, fissare il DNA trasferito sulla membrana mediante reticolazione UV su un transilluminatore UV o reticolante UV. Utilizzare una lampada da 302 nm da 8 W per 5 minuti o una lampada da 8 W da 254 nm per 2 minuti, che corrisponde a circa 120 mJ. Assicurarsi che il lato della membrana su cui viene trasferito il DNA sia rivolto verso la lampada.
5. Lavare la membrana due volte con 25 ml di tampone SSC 2x.
6. Mettere in pausa il protocollo, se necessario, asciugando completamente la macchietta e conservandola a 2-8 °C dopo averla avvolta liberamente in un foglio, fino a ulteriore lavorazione.

6. Ibridazione e rilevamento di chemiluminescenza

1. Preriscaldare il tampone di preibridazione a 42 °C.
   NOTA: i seguenti passaggi includono volumi di soluzioni/tamponi da utilizzare per 100 cm² di macchia.
2. Incubare la membrana in 10 mL di tampone di preibridazione per 1 ora a 42 °C agitando delicatamente per la preibridazione.
3. Aggiungere 0,5 μL di sonda telomerica per 5 ml di tampone di preibridazione preriscaldato per ottenere la soluzione di ibridazione.
4. Incubare il blot in 10 mL di soluzione di ibridazione a 42 °C per 3 ore agitando delicatamente.
5. Lavare l'asciugamano con tampone rigoroso 1 (Tabella 1) due volte per 10 minuti (25 ml ciascuno) a temperatura ambiente con delicata agitazione.
6. Preriscaldare tampone rigoroso 2 (Tabella 1) per 30 minuti a 50 °C.
7. Lavare l'asciugamano con tampone rigoroso 2 due volte per 15 minuti (25 ml ciascuno) a 50 °C agitando delicatamente.
8. Risciacquare con 15 ml di tampone di lavaggio per 5 minuti agitando delicatamente a RT.
9. Incubare la membrana in 10 ml di soluzione bloccante 1x appena preparata per 30 minuti a temperatura ambiente con delicata agitazione.
10. Incubare la membrana in 10 mL di anti-digioxigenina coniugata con una soluzione di lavoro di fosfatasi alcalina (vedere Tabella 2) per 30 minuti a RT con delicata agitazione.
11. Lavare l'asciugatura due volte con tampone di lavaggio a temperatura ambiente per 15 minuti con delicata agitazione.
12. Incubare in 10 mL di tampone di rilevamento per 5 minuti a RT agitando delicatamente.
13. Rimuovere il tampone di rilevamento in eccesso e mantenere la membrana con il DNA rivolto verso l'alto su una sacca di ibridazione o un foglio di acetato. Aggiungere ~ 1-1,5 ml di soluzione di substrato a goccia sulla membrana, posizionare immediatamente un altro foglio su di esso e incubare per 5 minuti a RT.
14. Spremere la soluzione di substrato in eccesso per l'imaging.
15. Immagina la macchia per circa 20 minuti in un sistema di imaging della documentazione in gel, raccogliendo più immagini in diversi punti temporali. Selezionare le immagini insature per ulteriori analisi.
    NOTA: Nel caso in cui il segnale sia debole, l'imaging può essere eseguito per un periodo di tempo più lungo.

7. Analisi

1. Dopo aver ottenuto i file immagine, esportarli per la pubblicazione in .tif formato alla massima risoluzione possibile (600 dpi in questo caso).
2. Installare il software Telotool . Ciò richiede una versione specifica (R2012a) di MATLAB (disponibile gratuitamente) per funzionare.
3. Apri il software e fai clic sul pulsante Carica file immagine in alto a destra.
4. Dopo aver caricato l'immagine, fare clic su Inverti immagine, in modo che lo sfondo dell'immagine sia nero e le sbavature/bande siano bianche.
5. Ritaglia l'immagine con gli angoli superiori partendo dai pozzi. Dopo aver effettuato la selezione del ritaglio, fare clic con il pulsante destro del mouse al suo interno e selezionare Ritaglia immagine.
6. Dopo che l'immagine è stata ritagliata, fai clic su Calcola corsie e consenti che il rilevamento della corsia avvenga automaticamente.
7. Se le corsie non sono state rilevate correttamente, ad esempio se alcune corsie non sono state rilevate affatto o se sono state rilevate corsie aggiuntive o parziali, eseguire la regolazione della corsia come descritto di seguito.
   1. Fare clic su Regola corsie e nella finestra pop-up che si apre, aggiungere e / o regolare le corsie in base alle esigenze, quindi fare clic su Applica e chiudi.
8. Dopo aver regolato le corsie, assicurati che sia visibile un punto rosso su ciascuna delle corsie e regola le scale utilizzando il pulsante Ladder Fit , assicurandoti che il numero di picchi in entrambe le corsie della scala sia nella stessa posizione. Rimuovere eventuali picchi estranei utilizzando il pulsante Elimina estremo .
9. Dopo aver regolato le scale, selezionare Profili corsia, fare clic su Adattamento scala (Ladder Fit), quindi selezionare Adattamento polinomiale.
10. Fare clic su Trendline, come consigliato dal software, quindi selezionare Corretto nell'opzione successiva.
11. Fare clic su Ottieni risultati per visualizzare i risultati come tabella, in cui la riga TRF media è la misura della lunghezza dei telomeri dei rispettivi campioni di corsia.
12. Fare clic su Salva tutto per memorizzare i risultati sotto forma di foglio di calcolo.

Risultati

Il DNA genomico estratto (gDNA), che è stato eseguito su un gel di agarosio all'1%, ha mostrato una buona integrità, come mostrato nella Figura 1B, indicando che il campione potrebbe essere utilizzato per un'ulteriore elaborazione a valle dei FRF. Il saggio TRF è stato quindi effettuato modificando i volumi di soluzioni richieste in ogni fase (vedi Tabella 1 e Tabella 2). Il segnale TRF era chiaramente visibile (Figura 3). Pe...

Discussione

Descriviamo una procedura dettagliata per un metodo non radioattivo, basato sulla chemiluminescenza per la misurazione della lunghezza dei telomeri utilizzando Southern blotting. Il protocollo è stato testato per consentire l'uso giudizioso di diversi reagenti senza compromettere la qualità dei risultati. Il buffer di preibridazione e ibridazione può essere riutilizzato fino a cinque volte. La concentrazione enzimatica può variare tra 10-20 U per 1,5-2 μg di DNA genomico senza influenzare i risultati. Diversi altri ...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Cell Line
A2780 (Ovarian adenocarcinoma cell line)	Received as a gift
Equipment
ChemiDoc XRS+ (for imaging and UV cross linking)	Biorad	Universal hood II (721BR14277)
Nanodrop (Epoch 2)	Biotek	EPOCH2
Software
TeloTool	Version 1.3
Materials
Acetic Acid	Molychem	64-19-7
Agarose	MP	180720
Amphotericin B	Gibco, ThermoFisher Scientific, USA	15240062
DMEM	HyClone, Cytiva, USA	SH30243.01
Ethylenediamine tetraacetic acid	Molychem	6381-92-6
HI FBS	Gibco, ThermoFisher Scientific, USA	10270106
HCl	Molychem	76-47-01-0
NaCl	Molychem	7647-14-5
NaOH	Molychem	1310-73-2
Nylon membrane	Sigma	11209299001
Penicillin	Gibco, ThermoFisher Scientific, USA	15240062
Sodium dodecyl sulfate	Affymetrix	151-21-3
Streptomycin	Gibco, ThermoFisher Scientific, USA	15240062
Tris	BIORAD	77-86-1
Tris HCl	Sigma Aldrich	1185-53-1
Whatman paper	GE healthcare lifesciences	1001-917
Reagents
1 kb ladder	NEB	N3232S
20x SSC	Invitrogen	15557-036
Anti DIG AP	Telo TAGGG Telomere Length Assay kit	12209136001
Blocking solution 10x	Telo TAGGG Telomere Length Assay kit	12209136001
Cutsmart Buffer	NEB	B6004
Detection buffer 10x	Telo TAGGG Telomere Length Assay kit	12209136001
Dig easy hyb	Telo TAGGG Telomere Length Assay kit	12209136001
Digestion Buffer	Telo TAGGG Telomere Length Assay kit	12209136001
Hinf 1	Telo TAGGG Telomere Length Assay kit	12209136001
Hinf 1 (alternative to kit)	NEB	R0155T
Loading Dye	BIOLABS	N3231S
Maleic acid buffer 10x	Telo TAGGG Telomere Length Assay kit	12209136001
Molecular marker	Telo TAGGG Telomere Length Assay kit	12209136001
Probe	Telo TAGGG Telomere Length Assay kit	12209136001
Rsa 1	Telo TAGGG Telomere Length Assay kit	12209136001
Rsa 1 (alternative to kit)	NEB	R0167L
Substrate	Telo TAGGG Telomere Length Assay kit	12209136001
Wash buffer	Telo TAGGG Telomere Length Assay kit	12209136001