Ottimizzazione dei parametri prestazionali del saggio di lunghezza dei telomeri TAGGG

Riepilogo

Qui, descriviamo in dettaglio il protocollo per quantificare la lunghezza dei telomeri utilizzando la rilevazione chemiluminescente non radioattiva, con particolare attenzione all'ottimizzazione di vari parametri prestazionali del kit di analisi della lunghezza dei telomeri TAGGG, come le quantità tampone e le concentrazioni della sonda.

Abstract

I telomeri sono sequenze ripetitive presenti alle estremità cromosomiche; Il loro accorciamento è una caratteristica delle cellule somatiche umane. L'accorciamento si verifica a causa di un problema con la replicazione finale e l'assenza dell'enzima telomerasi, che è responsabile del mantenimento della lunghezza dei telomeri. È interessante notare che i telomeri si accorciano anche in risposta a vari processi fisiologici interni, come lo stress ossidativo e l'infiammazione, che possono essere influenzati a causa di agenti extracellulari come inquinanti, agenti infettivi, nutrienti o radiazioni. Pertanto, la lunghezza dei telomeri funge da eccellente biomarcatore dell'invecchiamento e di vari parametri fisiologici di salute. Il kit di analisi della lunghezza dei telomeri TAGGG viene utilizzato per quantificare le lunghezze medie dei telomeri utilizzando il test TRF (telomere restriction fragment) ed è altamente riproducibile. Tuttavia, è un metodo costoso e, a causa di ciò, non viene utilizzato di routine per grandi numeri di campioni. Qui, descriviamo un protocollo dettagliato per una misurazione ottimizzata ed economica della lunghezza dei telomeri utilizzando Southern blots o analisi TRF e rilevamento basato sulla chemiluminescenza non radioattiva.

Introduzione

I telomeri sono le sequenze ripetitive di DNA presenti alla fine dei cromosomi. Hanno ripetizioni in tandem di TTAGGG e mantengono l'integrità del genoma proteggendo il cromosoma sia dallo sfilacciamento che dal problema della replicazione finale, il che significa che parte della sporgenza 3' non può essere replicata dalla DNA polimerasi ^1,2. I telomeri corti portano ad anomalie cromosomiche nelle cellule, a causa delle quali le cellule vengono arrestate permanentemente in uno stadio chiamato senescenza replicativa³. I telomeri corti causano anche una miriade di altri problemi, come la ....

Protocollo

NOTA: Vedere la tabella dei materiali per i dettagli su tutti i reagenti utilizzati nel protocollo riportato di seguito. La Tabella 1 elenca i reagenti prodotti in laboratorio insieme ai volumi ottimizzati e la Tabella 2 mostra le concentrazioni operative dei reagenti disponibili in commercio.

1. Coltura cellulare

1. Mantenere le cellule la cui lunghezza dei telomeri deve essere misurata (qui erano le cellule A2780, che è una linea cellulare di adenocarcinoma ovarico) nel mezzo completo di Dulbecco con il mezzo di aquila modificato (DMEM) integrato con siero bovino f....

Discussione

Descriviamo una procedura dettagliata per un metodo non radioattivo, basato sulla chemiluminescenza per la misurazione della lunghezza dei telomeri utilizzando Southern blotting. Il protocollo è stato testato per consentire l'uso giudizioso di diversi reagenti senza compromettere la qualità dei risultati. Il buffer di preibridazione e ibridazione può essere riutilizzato fino a cinque volte. La concentrazione enzimatica può variare tra 10-20 U per 1,5-2 μg di DNA genomico senza influenzare i risultati. Diversi altri .......

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Cell Line
A2780 (Ovarian adenocarcinoma cell line)	Received as a gift
Equipment
ChemiDoc XRS+ (for imaging and UV cross linking)	Biorad	Universal hood II (721BR14277)
Nanodrop (Epoch 2)	Biotek	EPOCH2
Software
TeloTool	Version 1.3
Materials
Acetic Acid	Molychem	64-19-7
Agarose	MP	180720
Amphotericin B	Gibco, ThermoFisher Scientific, USA	15240062
DMEM	HyClone, Cytiva, USA	SH30243.01
Ethylenediamine tetraacetic acid	Molychem	6381-92-6
HI FBS	Gibco, ThermoFisher Scientific, USA	10270106
HCl	Molychem	76-47-01-0
NaCl	Molychem	7647-14-5
NaOH	Molychem	1310-73-2
Nylon membrane	Sigma	11209299001
Penicillin	Gibco, ThermoFisher Scientific, USA	15240062
Sodium dodecyl sulfate	Affymetrix	151-21-3
Streptomycin	Gibco, ThermoFisher Scientific, USA	15240062
Tris	BIORAD	77-86-1
Tris HCl	Sigma Aldrich	1185-53-1
Whatman paper	GE healthcare lifesciences	1001-917
Reagents
1 kb ladder	NEB	N3232S
20x SSC	Invitrogen	15557-036
Anti DIG AP	Telo TAGGG Telomere Length Assay kit	12209136001
Blocking solution 10x	Telo TAGGG Telomere Length Assay kit	12209136001
Cutsmart Buffer	NEB	B6004
Detection buffer 10x	Telo TAGGG Telomere Length Assay kit	12209136001
Dig easy hyb	Telo TAGGG Telomere Length Assay kit	12209136001
Digestion Buffer	Telo TAGGG Telomere Length Assay kit	12209136001
Hinf 1	Telo TAGGG Telomere Length Assay kit	12209136001
Hinf 1 (alternative to kit)	NEB	R0155T
Loading Dye	BIOLABS	N3231S
Maleic acid buffer 10x	Telo TAGGG Telomere Length Assay kit	12209136001
Molecular marker	Telo TAGGG Telomere Length Assay kit	12209136001
Probe	Telo TAGGG Telomere Length Assay kit	12209136001
Rsa 1	Telo TAGGG Telomere Length Assay kit	12209136001
Rsa 1 (alternative to kit)	NEB	R0167L
Substrate	Telo TAGGG Telomere Length Assay kit	12209136001
Wash buffer	Telo TAGGG Telomere Length Assay kit	12209136001