TAGGGテロメア長アッセイの性能パラメータの最適化

要約

ここでは、非放射性化学発光検出を用いてテロメア長を定量するためのプロトコルについて、TAGGGテロメア長アッセイキットの様々な性能パラメータ(緩衝液量やプローブ濃度など)の最適化を中心に詳細に説明する。

要約

テロメアは染色体末端に存在する反復配列です。それらの短縮はヒト体細胞の特徴です。短縮は、末端複製の問題およびテロメア長の維持に関与するテロメラーゼ酵素の欠如のために起こる。興味深いことに、テロメアは、汚染物質、感染性病原体、栄養素、放射線などの細胞外因子によって影響を受ける可能性のある酸化ストレスや炎症などのさまざまな内部生理学的プロセスに応答して短くなります。したがって、テロメア長は、老化および様々な生理学的健康パラメータの優れたバイオマーカーとして役立つ。TAGGGテロメア長アッセイキットは、テロメア制限フラグメント(TRF)アッセイを使用して平均テロメア長を定量するために使用され、再現性が高いです。ただし、これは高価な方法であり、このため、サンプル数が多い場合は日常的に採用されていません。ここでは、サザンブロットまたはTRF分析と非放射性化学発光ベースの検出を使用して、テロメア長を最適化して費用対効果の高い測定を行うための詳細なプロトコルについて説明します。

概要

テロメアは、染色体の末端に存在する反復DNA配列です。それらはTTAGGGのタンデムリピートを持ち、染色体をほつれと末端複製の問題の両方から保護することによってゲノムの完全性を維持します、それは3'オーバーハングの一部がDNAポリメラーゼ^1,2によって複製できないことを意味します。短いテロメアは細胞の染色体異常を引き起こし、そのため細胞は複製老化³と呼ばれる段階で永久に停止します。短いテロメアは、ミトコンドリア機能障害^4,5や細胞機能障害など、他の多くの問題も引き起こします。

DNAテロメアの繰り返しは、細胞が分裂すると失われ、年間平均25〜200 bpの損失6、一定数の分裂後に細胞老化が生じます⁶。老化は併存疾患の頻度が高くなり、テロメアの長さ^が短くなるのが特徴です7。Menderによって記述されているように、テロメア制限フラグメント(TRF)分析は非常に高価な方法です⁸。このため、ほとんどの研究ではテロメ....

プロトコル

注:以下のプロトコルで使用されるすべての試薬の詳細については、 材料の表 を参照してください。表 1 はラボ製の試薬と最適化された容量を記載し、 表2 は市販の試薬の使用濃度を示しています。

1. 細胞培養

1. テロメア長を測定する細胞(ここでは卵巣腺癌細胞株であるA2780細胞を使用)を、10%ウシ胎児血清(FBS)、ストレプトマイシン、ペニシリン、およびアムホテリシンBを添加したダルベッコ改変イーグル培地(DMEM)完全培地で6cmのペトリ皿に維持します。細胞が80%〜100%コンフルエントになるまで、5%の二酸化炭素を含む加湿および制御された環境で37°Cでインキュベートします。
2. 培地を取り出し、5 mLの1xリン酸緩衝生理食塩水(PBS)で洗浄します。
3. 細胞を1 mLのトリプシン-エチレンジアミン四酢酸(EDTA)で処理し、37°Cで3〜5分間インキュベートして細胞を剥離します。
4. 2 mLのDMEM完全培地を加えてトリプシンを不活性化し、遠心分離チューブに細胞を回収します。
5. 細胞を2,348 × g で5分間ペレット化します。
6. ペレットを1x PBSで洗浄し、2,348 × g で5分....

ディスカッション

サザンブロッティングを用いたテロメア長測定のための非放射性化学発光ベースの方法の詳細な手順について説明します。このプロトコルは、結果の品質を損なうことなく、いくつかの試薬を賢明に使用できるようにテストされています。プレハイブリダイゼーションおよびハイブリダイゼーションバッファーは、最大5回まで再利用することができる。酵素濃度は、結果に影響を与えること.......

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Cell Line
A2780 (Ovarian adenocarcinoma cell line)	Received as a gift
Equipment
ChemiDoc XRS+ (for imaging and UV cross linking)	Biorad	Universal hood II (721BR14277)
Nanodrop (Epoch 2)	Biotek	EPOCH2
Software
TeloTool	Version 1.3
Materials
Acetic Acid	Molychem	64-19-7
Agarose	MP	180720
Amphotericin B	Gibco, ThermoFisher Scientific, USA	15240062
DMEM	HyClone, Cytiva, USA	SH30243.01
Ethylenediamine tetraacetic acid	Molychem	6381-92-6
HI FBS	Gibco, ThermoFisher Scientific, USA	10270106
HCl	Molychem	76-47-01-0
NaCl	Molychem	7647-14-5
NaOH	Molychem	1310-73-2
Nylon membrane	Sigma	11209299001
Penicillin	Gibco, ThermoFisher Scientific, USA	15240062
Sodium dodecyl sulfate	Affymetrix	151-21-3
Streptomycin	Gibco, ThermoFisher Scientific, USA	15240062
Tris	BIORAD	77-86-1
Tris HCl	Sigma Aldrich	1185-53-1
Whatman paper	GE healthcare lifesciences	1001-917
Reagents
1 kb ladder	NEB	N3232S
20x SSC	Invitrogen	15557-036
Anti DIG AP	Telo TAGGG Telomere Length Assay kit	12209136001
Blocking solution 10x	Telo TAGGG Telomere Length Assay kit	12209136001
Cutsmart Buffer	NEB	B6004
Detection buffer 10x	Telo TAGGG Telomere Length Assay kit	12209136001
Dig easy hyb	Telo TAGGG Telomere Length Assay kit	12209136001
Digestion Buffer	Telo TAGGG Telomere Length Assay kit	12209136001
Hinf 1	Telo TAGGG Telomere Length Assay kit	12209136001
Hinf 1 (alternative to kit)	NEB	R0155T
Loading Dye	BIOLABS	N3231S
Maleic acid buffer 10x	Telo TAGGG Telomere Length Assay kit	12209136001
Molecular marker	Telo TAGGG Telomere Length Assay kit	12209136001
Probe	Telo TAGGG Telomere Length Assay kit	12209136001
Rsa 1	Telo TAGGG Telomere Length Assay kit	12209136001
Rsa 1 (alternative to kit)	NEB	R0167L
Substrate	Telo TAGGG Telomere Length Assay kit	12209136001
Wash buffer	Telo TAGGG Telomere Length Assay kit	12209136001