新生儿异位大鼠心脏移植模型在内皮间充质转化研究中的应用

摘要

这项工作提出了一种内皮到间充质转化诱导的纤维化的动物模型，如先天性心脏缺陷，如严重主动脉瓣狭窄或左心发育不良综合征，可以进行详细的组织学组织评估、调节信号通路的鉴定和治疗方案的测试。

摘要

心内膜弹性纤维增生症 （EFE） 定义为心内膜下组织积聚，对左心室 （LV） 的发育有重大影响，并排除先天性危重主动脉瓣狭窄和左心发育不良综合征 （HLHS） 患者进行根治性解剖双心室手术修复。手术切除是目前唯一可用的治疗选择，但 EFE 经常复发，有时甚至伴有更浸润的生长模式进入邻近心肌。

为了更好地了解 EFE 的潜在机制并探索治疗策略，开发了一种适合临床前测试的动物模型。动物模型考虑到 EFE 是一种未成熟心脏的疾病，并且与血流障碍有关，这得到了临床观察的支持。因此，新生大鼠供体心脏的异位心脏移植是该模型的基础。

将新生大鼠心脏移植到青春期大鼠的腹部，并与受体的肾下主动脉和下腔静脉相连。虽然冠状动脉的灌注保留了供体心脏的活力，但左心室内的血流停滞会诱导非常不成熟的心脏的 EFE 生长。EFE 形成的潜在机制是心内膜内皮细胞向间充质细胞 （EndMT） 的转变，这是瓣膜和隔膜早期胚胎发育的良好机制，也是心力衰竭纤维化的主要原因。移植后几天内可以宏观观察EFE的形成。经腹超声心动图用于监测移植物的活力、收缩力和吻合口的通畅性。安乐死后，采集 EFE 组织，其组织病理学特征与 HLHS 患者的人类 EFE 组织相同。

这种 体内 模型允许研究心脏中EFE发育的机制，并测试治疗方案以防止这种病理性组织形成，并为EndMT诱导的纤维化提供更普遍的检查机会。

引言

心内膜弹性纤维增生症 （EFE） 定义为心内膜下组织中胶原和弹性纤维的积聚，表现为珍珠状或不透明的心内膜增厚;EFE 在胎儿期和婴儿早期经历最活跃的生长¹.在一项尸检研究中，70% 的左心发育不良综合征 （HLHS） 病例与 EFE² 的存在有关。

表达成纤维细胞标志物的细胞是 EFE 中的主要细胞群，但这些细胞也同时表达心内膜内皮标志物，这是这些 EFE 细胞起源的迹象。我们小组先前确定，EFE 形成的潜在机制涉及心内膜内皮细胞通过内皮间充质转化 （EndMT）³ 向成纤维细胞的表型变化。EndMT 可以使用免疫组化双染色检测内皮标志物，例如分化簇 （CD） 31 或血管内皮 （VE）-钙粘蛋白 （CD144） 和成纤维细胞标志物（例如 α-平滑肌肌动蛋白、α-SMA）。此外，我们之前还通过激活转录因子 SLUG、SNAIL 和 TWIST³ 确定了 TGF-ß 通路在此过程中的调节作用。

EndMT 是胚胎心脏发育过程中发生的生理过程，导致心内膜垫形成隔膜和瓣膜⁴，但它也会导致心力衰竭、肾纤维化或癌症的器官纤维化，并在血管动脉粥样硬化中起关键作用^....

研究方案

所有动物程序均按照国家研究委员会进行。2011. 实验动物护理和使用指南：第八版。动物方案由波士顿儿童医院的机构动物护理和使用委员会审查和批准。

手术前，将所有手术器械进行蒸汽高压灭菌，并制备终浓度为22 mmol/L KCl的改良Krebs-Henseleit缓冲液作为心脏麻痹溶液（表1）。将溶液过滤灭菌并在4°C下储存过夜。异位新生大鼠心脏移植手术需要手术显微镜（12.5x）。

1.准备和麻醉

1. 使用体重约为150g（5-6周龄）的雄性/雌性Lewis大鼠作为受体。
2. 首先，用剃须刀慷慨地剃掉老鼠的腹部。
3. 将大鼠放入异氟烷室中，并用2%异氟烷以2L / min打开氧气流量，直到动物被适当镇静但仍自主呼吸。腹膜内注射 45 mg/kg 氯胺酮和 5 mg/kg 甲苯噻嗪，以及 300 U/kg 肝素。通过脚趾捏试验确认麻醉是否正确。
   注意：通过触诊胸部仔细监测自主呼吸和心率，以确保整个过程中稳定的血流动力学状态。
4. 插管时，将大鼠放在斜架上（图1），用绳子固定门牙，并将头部朝向外科医生。
5. 将颈部外侧的灯放在声带区域，用两根手指抓住舌头，然后轻轻向上和向左推动，为插管提供最佳视野。使用18 G，2....

讨论

这种将新生供体大鼠心脏异位移植到受体腹部的动物模型为通过详细的组织学组织评估、确定调节信号通路和测试治疗方案来研究 EndMT 衍生的纤维化创造了可能性。由于EndMT是心脏纤维化疾病的潜在机制，因此该模型在小儿心脏外科及其他领域具有重要价值。在此模型中，许多因素会对手术结果产生负面影响。因此，正确处理由于供体心脏不成熟而导致的非常脆弱的组织，在麻醉期间正确处理动?.......

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Advanced Ventilator System For Rodents, SAR-1000	CWE, Inc.	12-03100	small animal ventilator
aSMA	Sigma	A2547	Antibody for Immunohistochemistry
Axio observer Z1	Carl Zeiss		inverted microscope
Betadine Solution	Avrio Health L.P.	367618150092
CD31	Invitrogen	MA1-80069	Antibody for Immunohistochemistry
DAPI	Invitrogen	D1306	Antibody for Immunohistochemistry
DemeLON Nylon black 10-0	DemeTECH	NL76100065F0P	10-0 Nylon suture
ETFE IV Catheter, 18G x 2	TERUMO SURFLO	SR-OX1851CA	intubation cannula
Micro Clip 8mm	Roboz Surgical Instrument Co.	RS-6471	microvascular clamps
Nylon black monofilament 11-0	SURGICAL SPECIALTIES CORP	AA0130	11-0 Nylon
O.C.T. Compound	Tissue-Tek	4583	Embedding medium for frozen tissue specimen
p-SMAD2/3	Invitrogen	PA5-110155	Antibody for Immunohistochemistry
Rodent, Tilting WorkStand	Hallowell EMC.	000A3467	oblique shelf for intubation
Silk Sutures, Non-absorbable, 7-0	Braintree Scientific	NC9201231	Silk suture
Slug/Snail	Abcam	ab180714	Antibody for Immunohistochemistry
Undyed Coated Vicryl 5-0 P-3 18"	Ethicon	J493G	5-0 Vicryl
Undyed Coated Vicryl 6-0 P-3 18"	Ethicon	J492G	6-0 Vicryl
VE-Cadherin	Abcam	ab231227	Antibody for Immunohistochemistry
Zeiss OPMI 6-SFR	Zeiss		Surgical microscope
Zen, Blue Edition, 3.6	Zen		inverted microscope software