내피에서 중간엽으로의 전환 연구를 위한 신생아 이종성 쥐 심장 이식 모델

요약

이 연구는 중증 대동맥 협착증 또는 저형성 좌심 증후군과 같은 선천성 심장 결함에서 볼 수 있는 내피에서 중간엽으로의 전이 유도 섬유증의 동물 모델을 제시하여 상세한 조직학적 조직 평가, 조절 신호 경로 식별 및 치료 옵션 테스트를 가능하게 합니다.

초록

심내막하 조직 축적으로 정의되는 심내막 섬유탄성증(EFE)은 좌심실(LV)의 발달에 큰 영향을 미치며 선천성 중증 대동맥 협착증 및 저형성 좌심 증후군(HLHS) 환자는 근치적 해부학적 양심실 수술 수리를 받지 못합니다. 외과적 절제는 현재 사용 가능한 유일한 치료 옵션이지만 EFE는 종종 재발하며 때로는 인접한 심근에 훨씬 더 침윤적인 성장 패턴이 있습니다.

EFE의 기본 메커니즘을 더 잘 이해하고 치료 전략을 탐색하기 위해 전임상 시험에 적합한 동물 모델이 개발되었습니다. 동물 모델은 EFE가 미성숙한 심장의 질병이며 임상 관찰에 의해 뒷받침되는 흐름 장애와 관련이 있음을 고려합니다. 따라서 신생아 쥐 기증자 심장의 이종 심장 이식이 이 모델의 기초입니다.

신생아 쥐의 심장을 청소년 쥐의 복부에 이식하고 수혜자의 대동맥 및 하대정맥에 연결합니다. 관상 동맥의 관류는 기증자 심장의 생존 능력을 보존하는 반면, LV 내의 흐름 정체는 매우 미성숙한 심장에서 EFE 성장을 유도합니다. EFE 형성의 근본적인 메커니즘은 심내막 내피 세포가 중간엽 세포(EndMT)로 전환되는 것인데, 이는 판막과 격막의 초기 배아 발달에 대한 잘 설명된 메커니즘이지만 심부전에서 섬유증의 주요 원인이기도 합니다. EFE 형성은 이식 후 며칠 이내에 거시적으로 관찰 할 수 있습니다. 경복부 심장 초음파는 이식편 생존력, 수축성 및 문합부의 개통성을 모니터링하는 데 사용됩니다. 안락사 후 EFE 조직을 채취하고 HLHS 환자의 인간 EFE 조직과 동일한 조직 병리학적 특성을 보여줍니다.

이 생체 내 모델을 통해 심장에서 EFE 발달 메커니즘을 연구하고 이러한 병리학적 조직 형성을 방지하기 위한 치료 옵션을 테스트할 수 있으며 EndMT 유도 섬유증에 대한 보다 일반화된 검사의 기회를 제공합니다.

서문

심내막하 조직에 콜라겐과 탄성 섬유가 축적되어 정의되는 심내막 섬유탄성증(EFE)은 진주 또는 불투명한 두꺼운 심내막으로 나타납니다. EFE는 태아와 유아기 초기에 가장 활발한 성장을 겪는다¹. 부검 연구에서 저형성 좌심 증후군(HLHS) 사례의 70%가 EFE²의 존재와 관련이 있었습니다.

섬유아세포에 대한 마커를 발현하는 세포는 EFE의 주요 세포 집단이지만, 이러한 세포는 또한 이러한 EFE 세포의 기원을 나타내는 심내막 내피 마커를 동시에 발현합니다. 우리 그룹은 이전에 EFE 형성의 기본 메커니즘이 내피에서 중간엽으로의 전이(EndMT^)를 통해 심내피 세포에서 섬유아세포로의 표현형 변화를 포함한다는 것을 확인했습니다3. EndMT는 분화 클러스터(CD) 31 또는 혈관 내피(VE)-cadherin(CD144) 및 섬유아세포 마커(예: 알파-평활근 액틴, α-SMA)와 같은 내피 마커에 대한 면역조직화학적 이중 염색을 사용하여 검출할 수 있습니다. 또한, 우리는 이전에 전사 인자 SLUG, SNAIL 및 TWIST³의 활성화와 함께 이 과정에서 TGF-ß 경로의 조절 역할을 확립했습니다.

EndMT는 심장 배아 발달 과정에서 발생하는 생리적 과정으로 심내막 쿠션(endocardial cushion)에서 중격(septa)과 판막(^valve)의 형성을 유도하지만4, 심부전, 신장 섬유증 또는 암에서 장기 섬유화를 일으키기도 하며 혈관 죽상동맥경화증(vascular atherosclerosis)에서 중요한 역할을 한다 5,6,7,8. 심장 섬유증의 EndMT는 주로 TGF-β 경로를 통해 조절되며, 이는 당사와 다른 사람들이 ^3,9를 보고한 바와 같습니다. EndMT를 유도하기 위해 염증10, 저산소증¹¹, 기계적 변화¹², 강내 혈류의 변화¹³를 포함한 유동 장애 등 다양한 자극이 기술되어 있으며, EndMT는 유전 질환¹⁴의 결과일 수도 있다.

이 동물 모델은 심장 EFE 발달의 핵심 구성 요소를 사용하여 개발되었으며, 이는 미성숙과 강내 혈류의 변화, 특히 흐름 정체입니다. 신생아 쥐는 출생 직후 발달적으로 미성숙한 것으로 알려져 있기 때문에 신생아 쥐의 심장을 기증자로 사용함으로써 미성숙이 충족되었습니다. 이종성 심장 이식은 강내 혈류 제한을 제공했다¹⁵.

임상적 관점에서 이 동물 모델을 사용하면 성장하는 좌심실(LV)에 대한 EndMT의 영향을 더 잘 조사할 수 있습니다. EndMT 유도 EFE 형성¹⁶을 통해 태아 및 신생아 심장에 부과된 성장 제한은 선천성 중증 대동맥 협착증 및 저형성 좌심 증후군(HLHS)과 같은 좌심실 유출로 폐쇄(LVOTO) 환자를 근치적 해부학적 양심실 수술 수리에서 배제한다¹⁷. 이 동물 모델은 EndMT를 통해 세포 메커니즘 및 조직 형성 조절에 대한 연구를 용이하게 하고 약리학적 치료 옵션을 테스트할 수 있습니다 ^3,18.

경복부 심장 초음파는 이식편 생존력, 수축성 및 문합부의 개통성을 모니터링하는 데 사용됩니다. 안락사 후 EFE 형성은 이식 후 3 일 이내에 거시적으로 관찰 할 수 있습니다. EFE 조직은 LVOTO 환자의 인간 EFE 조직과 동일한 조직 병리학적 특성을 보여줍니다.

따라서 이 동물 모델은 HLHS 스펙트럼에서 소아용으로 개발되었지만 EndMT의 분자 메커니즘을 기반으로 다양한 질병을 연구할 때 적용할 수 있습니다.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

프로토콜

모든 동물 실험은 국가연구위원회의 규정에 따라 진행되었습니다. 2011. 실험실 동물의 관리 및 사용 가이드: 8판. 동물 프로토콜은 Boston Children's Hospital의 Institutional Animal Care and Use Committee에서 검토 및 승인되었습니다.

수술 전에 모든 수술 기구를 증기 고압멸균하고 최종 농도가 22mmol/L KCl인 변형된 Krebs-Henseleit 완충액을 심마비 용액으로 준비합니다(표 1). 용액은 필터 멸균 처리되어 4°C에서 하룻밤 동안 보관됩니다. 이종 신생아 쥐 심장 이식 절차에는 수술용 현미경(12.5x)이 필요합니다.

1. 준비 및 마취

1. 체중이 약 150g(생후 5-6주령)인 수컷/암컷 루이스 쥐를 수혜자로 사용합니다.
2. 시작하려면 면도기로 쥐의 복부를 넉넉하게 면도하십시오.
3. 쥐를 이소플루란 챔버에 넣고 동물이 적절하게 진정되지만 여전히 자발적으로 숨을 쉴 때까지 2% 이소플루란으로 2L/분의 산소 흐름을 켭니다. 45mg/kg 케타민과 5mg/kg 자일라진을 복강내(IP)로 주사하고 300U/kg 헤파린을 주사합니다. 발가락 꼬집 테스트로 적절한 마취를 확인합니다.
   알림: 흉부 촉진을 통해 자발적 호흡과 심박수를 주의 깊게 모니터링하여 전체 과정에서 안정적인 혈류역학적 상태를 보장합니다.
4. 삽관을 위해 쥐를 비스듬한 선반에 놓고 (그림 1) 끈으로 앞니를 고정하고 머리가 외과 의사를 향하도록 놓습니다.
5. 목 바깥쪽의 빛을 성대 부위에 대고 두 손가락으로 혀를 잡고 위쪽과 왼쪽으로 약간 밀어 삽관을 위한 최적의 시야를 제공합니다. 18-2g의 쥐에 100G, 150인치 캐뉼라를 사용하십시오. 테이프로 기관 내 튜브를 고정합니다.
   참고: 삽관에는 3.5배 배율의 수술용 루프가 권장됩니다.
6. 삽관 캐뉼라를 작은 동물 인공호흡기에 연결하고 동물 크기에 따라 제조업체의 지침에 따라 설정을 조정합니다.
   알림: 150g 쥐에 대해 다음 설정을 사용하십시오. 볼륨 모드; 호흡수, 55/분; 일회 호흡량, 1.3mL 50% I/E 비율이지만 필요에 따라 적절하게 조정할 수 있습니다. 적절한 양측 및 균등한 흉부 움직임을 보장하고 인공호흡기를 통해 0.5%–2%로 이소플루란을 지속적으로 투여합니다.
7. 꼬리가 외과 의사를 향하도록 앙와위 자세로 가열 패드(정상 체온을 유지하기 위해)에 쥐를 놓습니다. 베타딘 용액과 에탄올 70%를 번갈아 가며 복부를 3회 살균합니다. 눈 윤활제를 바르고 멸균 수술용 드레이프로 쥐를 덮고 복부는 덮지 않은 상태로 둡니다.

2. 수혜자 쥐에서 신생아 기증자 심장의 수술 준비 및 이종 이식

1. 피부 절개를 위해 15날 메스를 사용하여 정중선 개복술을 시행하고 가위를 사용하여 전방 복벽을 연 다음 면 팁 어플리케이터로 후복막 복부 대동맥과 하대정맥(IVC)을 둔하게 노출합니다.
2. 창자(하행 결장 포함)를 동원하고 오른쪽 상부 사분면을 향해 놓습니다. 따뜻한 식염수를 적신 거즈로 장을 덮으십시오. IVC와 복부 대동맥의 최적 노출을 보장하기 위해 견인기를 사용하십시오.
3. 분기점을 향해 infarenal IVC와 복부 대동맥을 둔하게 절제합니다. 모든 내장동맥과 정맥(예: 하장간막 동맥 및 림프절 동맥)을 10-0 나일론 봉합사로 결찰합니다.
   참고: 이러한 곁가지의 해부학적 구조에는 큰 차이가 있습니다. 다른 혈류역학적 모니터링을 사용할 수 없는 경우 대동맥의 맥박과 심박수를 시각적으로 모니터링합니다. 발가락 꼬집 테스트를 통해 15분마다 적절한 마취 깊이를 평가합니다. 그에 따라 이소플루란 농도를 조정하십시오.
4. 신생아 쥐에서 기증자의 심장을 채취한 후, 절제된 심장을 무균 상태로 크렙스-헨셀레이트 완충액이 들어 있는 수술용 대야에 넣어 수술 현장으로 전달합니다. 얼음처럼 차가운 심정지 용액으로 기증자의 심장을 간헐적으로 세척합니다.
   참고: 두 번째 외과의가 있는 경우 두 번째 외과의가 수혜 동물의 총 마취 시간과 기증자 심장의 허혈 시간을 줄이기 때문에 심장을 동시에 준비해야 합니다. 두 번째 외과 의사가 없는 경우, 따뜻한 식염수로 수혜자의 복부를 덮고 채취 과정에서 동물을 관찰합니다.
5. 4개의 작은 비외상성 혈관 클램프를 극간 대동맥 및 IVC의 원위 및 근위 분절에 적용합니다. 필요한 경우 7-0 실크 봉합사로 불리한 신장을 일시적으로 막고 시술 후 봉합사를 해제합니다. 10-0 나일론 봉합사를 대동맥 전벽에 수직으로 놓아 대동맥 절개술을 용이하게 합니다. 봉합사를 약간 위로 당겨 미세 가위로 두 개의 작은 수평 절단(쐐기 모양)으로 대동맥 절개술을 수행합니다.
   알림: 혈전을 제거하려면 헤파린화 식염수로 대동맥 내강을 씻어내는 것이 좋습니다.
6. 기증자의 심장을 대동맥의 왼쪽(동물의 관점에서)에 놓고 수혜자의 대동맥과 기증자의 상행 대동맥을 대동맥 절개술의 12시 및 6시 방향에 봉합사로 고정합니다. 3시와 9시 방향에서 세 번째와 네 번째 봉합을 계속하고, 세 번째 봉합 후 심장을 대동맥 오른쪽으로 부드럽게 뒤집습니다. 모든 틈새에 1-2개의 봉합사를 추가하여 동맥 문합을 완료합니다.
   알림: 조직 손상을 방지하기 위해 문합을 할 때 기증자의 상행 대동맥 또는 수혜자의 복부 대동맥을 겸자로 만지지 않도록 주의해야 합니다.
7. 머리가 외과의의 왼손을 향하도록 쥐를 시계 반대 방향으로 돌립니다. 기증자의 대동맥을 복부 대동맥의 왼쪽으로 이동하여 IVC를 최적으로 볼 수 있도록 합니다.
8. 대동맥 문합에 약간 근접한 IVC에서 정맥 절제술을 수행하며, 천자용 11개의 날과 기증자의 폐 몸통의 직경에 따라 적절한 크기 조정을 위한 미세 가위를 사용합니다. 다시 말하지만, 헤파린화 식염수로 intracaval 루멘을 씻어냅니다.
9. 수혜자의 IVC와 기증자의 폐 몸통 사이의 정맥 문합으로 시작하여 12시 방향과 6시 방향(IVC 관련)에서 시작하여 혈관 뒤쪽 벽에 중단된 11-0 나일론 봉합사를 배치하는 것이 가장 좋습니다.
10. 흡수성 젤라틴 스폰지의 작은 스트립으로 문합부를 덮고 미세혈관 cl을 제거합니다.amp말단에서 시작합니다. 면 팁 어플리케이터를 사용하여 스폰지를 가볍게 압축하여 최적의 지혈을 얻습니다.
11. 원위 미세혈관 클램프가 해제될 때 이식편의 관상동맥 혈관이 채워지는 것을 관찰하고 근위 클램프가 해제될 때 기증자의 심장이 즉시 뛰기 시작하는지 확인합니다.
    참고: 이식편의 생존력은 적절한 이식편 기능을 확인하기 위해 수정된 Stanford 점수¹⁹ 에 따라 수술 중 0에서 4까지 점수를 매길 수 있습니다.
12. 동맥 및 정맥 문합이 왜곡되지 않도록 하여 장을 복부에 다시 놓습니다.
13. 수술 후 진통을 확인하기 위해 동물을 완전히 마취한 상태에서 meloxicam(1mg/kg)과 ethiqa XR(0.65mg/kg)을 피하로 투여합니다. 그런 다음 연속 5-0 흡수성 vicryl 봉합사로 복벽을 닫은 후 6-0 흡수성 vicryl 봉합사로 피부를 피내 봉합합니다.
    참고: 일반적인 오류 및 문제 해결에 대한 지침은 표 2에 나와 있습니다.

3. 신생아 기증자 심장 적출

1. 진정을 위해 신생아 기증자 쥐를 이소플루란(2%)이 주입된 챔버에 넣습니다. 케타민(75mg/kg)과 자일라진(5mg/kg), 헤파린(300U/kg)을 복강내로 투여합니다.
2. 발가락 꼬집음으로 마취 깊이를 확인하고 꼬리가 당신을 향하도록 쥐를 앙와위 자세로 놓습니다. 흉곽과 복벽 전체를 베타딘과 70% 에탄올로 번갈아 세 번 소독합니다. 멸균 수술용 드레이프로 쥐를 덮습니다.
3. 12.5x 수술용 현미경을 사용하여 15날 메스를 사용하여 xyphoid를 수평으로 절개한 후 가위로 양쪽 겨드랑이까지 수직으로 절개하여 전방 흉벽 전체를 제거합니다. 그런 다음 목 바로 아래에 또 다른 수평 절개를 계속하여 전방 흉벽을 제거할 수 있습니다.
4. IVC, 좌우 상대정맥, 폐혈관을 가위로 절개한 후 7-0 실크 봉합사로 모든 혈관을 둘러싸고 결찰합니다. 30G 바늘로 IVC를 뚫고 집게로 다이어프램을 약간 눌러 얼음처럼 차가운 고칼륨 변성 Krebs-Henseleit 용액 3mL를 오른쪽 심방에 투여합니다.
5. IVC, SVC, 폐혈관 및 대동맥을 가위로 자릅니다. 11날 메스를 사용하여 적절한 길이를 보장하기 위해 가능한 한 폐동맥을 가로지르고 상완두부 몸통 원위부에 대동맥을 횡단합니다.
6. 마이크로가위로 폐동맥과 상행 대동맥을 분리하고 3mL 주사기를 사용하여 얼음처럼 차가운 심정지 용액으로 심장을 씻어냅니다.

4. 수혜자 회복 및 이식편 모니터링

1. 수술 후 쥐가 깨어날 수 있는 충분한 시간(보통 15분 간격)을 주고 온열 패드에서 회복되도록 합니다.
   참고: 감염 위험이 매우 낮고 실험 모델을 손상시키지 않기 위해 항생제가 필요하지 않으며 음식이나 물에 대한 제한이 적용되지 않습니다.
2. 이식 후 매일 이식된 심장을 촉진하여 이식 기능을 모니터링하되, 장 중첩으로 인해 평가하기 어려울 수 있음을 고려하십시오.
   참고: 복부 심장 초음파는 이식편 생존율을 보다 정확하게 측정할 수 있습니다. 심장 초음파 검사의 경우 콧방울을 통해 흡입한 이소플루란(1-2%)으로 쥐를 약간 진정시키고 가열 패드에 놓습니다. 심장 초음파는 일반적으로 수술 후 (POD) 1, POD 7 및 POD 14에 수행됩니다. 심박수와 수축도를 평가하기 위해 장축 및 단축 보기를 쉽게 얻을 수 있습니다(그림 2A, B). 문합을 평가하려면 도플러 심초음파(그림 3A)를 사용하고 좌심실강 내에서 에코-브라이트 심내막층으로 보이는 EFE 조직의 형성을 확인합니다(그림 3B, C).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

결과

접목 생존력과 박동
이 작업에서는 모든 클램프를 제거한 후 이식편 생존력을 육안으로 평가하고 이식편을 관찰하기 위해 복부를 개방한 상태에서 대략 10-15분의 재관류 시간을 허용했습니다. 이식편 생존력을 객관적으로 검증하기 위한 동일한 채점 시스템이 수술 종료 시 육안 평가와 POD 1, POD 7 및 POD 14의 심장 초음파에 사용되었습니다.

0 = 장기 기능 없음; 1 =...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

토론

신생아 기증자 쥐의 심장을 수혜자의 복부에 이소성 이식하는 이 동물 모델은 상세한 조직학적 조직 평가를 통해 EndMT 유래 섬유증을 연구하고, 조절 신호 경로를 식별하고, 치료 옵션을 테스트할 수 있는 가능성을 제공합니다. EndMT는 심장 섬유화 질환의 기본 기전이기 때문에 이 모델은 소아 심장 수술 분야와 그 이상의 분야에서 큰 가치를 지닙니다. 이 모형에서는 많은 요인이 절차의 결과에 부...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Advanced Ventilator System For Rodents, SAR-1000	CWE, Inc.	12-03100	small animal ventilator
aSMA	Sigma	A2547	Antibody for Immunohistochemistry
Axio observer Z1	Carl Zeiss		inverted microscope
Betadine Solution	Avrio Health L.P.	367618150092
CD31	Invitrogen	MA1-80069	Antibody for Immunohistochemistry
DAPI	Invitrogen	D1306	Antibody for Immunohistochemistry
DemeLON Nylon black 10-0	DemeTECH	NL76100065F0P	10-0 Nylon suture
ETFE IV Catheter, 18G x 2	TERUMO SURFLO	SR-OX1851CA	intubation cannula
Micro Clip 8mm	Roboz Surgical Instrument Co.	RS-6471	microvascular clamps
Nylon black monofilament 11-0	SURGICAL SPECIALTIES CORP	AA0130	11-0 Nylon
O.C.T. Compound	Tissue-Tek	4583	Embedding medium for frozen tissue specimen
p-SMAD2/3	Invitrogen	PA5-110155	Antibody for Immunohistochemistry
Rodent, Tilting WorkStand	Hallowell EMC.	000A3467	oblique shelf for intubation
Silk Sutures, Non-absorbable, 7-0	Braintree Scientific	NC9201231	Silk suture
Slug/Snail	Abcam	ab180714	Antibody for Immunohistochemistry
Undyed Coated Vicryl 5-0 P-3 18"	Ethicon	J493G	5-0 Vicryl
Undyed Coated Vicryl 6-0 P-3 18"	Ethicon	J492G	6-0 Vicryl
VE-Cadherin	Abcam	ab231227	Antibody for Immunohistochemistry
Zeiss OPMI 6-SFR	Zeiss		Surgical microscope
Zen, Blue Edition, 3.6	Zen		inverted microscope software