내피에서 중간엽으로의 전환 연구를 위한 신생아 이종성 쥐 심장 이식 모델

요약

이 연구는 중증 대동맥 협착증 또는 저형성 좌심 증후군과 같은 선천성 심장 결함에서 볼 수 있는 내피에서 중간엽으로의 전이 유도 섬유증의 동물 모델을 제시하여 상세한 조직학적 조직 평가, 조절 신호 경로 식별 및 치료 옵션 테스트를 가능하게 합니다.

초록

심내막하 조직 축적으로 정의되는 심내막 섬유탄성증(EFE)은 좌심실(LV)의 발달에 큰 영향을 미치며 선천성 중증 대동맥 협착증 및 저형성 좌심 증후군(HLHS) 환자는 근치적 해부학적 양심실 수술 수리를 받지 못합니다. 외과적 절제는 현재 사용 가능한 유일한 치료 옵션이지만 EFE는 종종 재발하며 때로는 인접한 심근에 훨씬 더 침윤적인 성장 패턴이 있습니다.

EFE의 기본 메커니즘을 더 잘 이해하고 치료 전략을 탐색하기 위해 전임상 시험에 적합한 동물 모델이 개발되었습니다. 동물 모델은 EFE가 미성숙한 심장의 질병이며 임상 관찰에 의해 뒷받침되는 흐름 장애와 관련이 있음을 고려합니다. 따라서 신생아 쥐 기증자 심장의 이종 심장 이식이 이 모델의 기초입니다.

신생아 쥐의 심장을 청소년 쥐의 복부에 이식하고 수혜자의 대동맥 및 하대정맥에 연결합니다. 관상 동맥의 관류는 기증자 심장의 생존 능력을 보존하는 반면, LV 내의 흐름 정체는 매우 미성숙한 심장에서 EFE 성장을 유도합니다. EFE 형성의 근본적인 메커니즘은 심내막 내피 세포가 중간엽 세포(EndMT)로 전환되는 것인데, 이는 판막과 격막의 초기 배아 발달에 대한 잘 설명된 메커니즘이지만 심부전에서 섬유증의 주요 원인이기도 합니다. EFE 형성은 이식 후 며칠 이내에 거시적으로 관찰 할 수 있습니다. 경복부 심장 초음파는 이식편 생존력, 수축성 및 문합부의 개통성을 모니터링하는 데 사용됩니다. 안락사 후 EFE 조직을 채취하고 HLHS 환자의 인간 EFE 조직과 동일한 조직 병리학적 특성을 보여줍니다.

이 생체 내 모델을 통해 심장에서 EFE 발달 메커니즘을 연구하고 이러한 병리학적 조직 형성을 방지하기 위한 치료 옵션을 테스트할 수 있으며 EndMT 유도 섬유증에 대한 보다 일반화된 검사의 기회를 제공합니다.

서문

심내막하 조직에 콜라겐과 탄성 섬유가 축적되어 정의되는 심내막 섬유탄성증(EFE)은 진주 또는 불투명한 두꺼운 심내막으로 나타납니다. EFE는 태아와 유아기 초기에 가장 활발한 성장을 겪는다¹. 부검 연구에서 저형성 좌심 증후군(HLHS) 사례의 70%가 EFE²의 존재와 관련이 있었습니다.

섬유아세포에 대한 마커를 발현하는 세포는 EFE의 주요 세포 집단이지만, 이러한 세포는 또한 이러한 EFE 세포의 기원을 나타내는 심내막 내피 마커를 동시에 발현합니다. 우리 그룹은 이전에 EFE 형성의 기본 메커니즘이 내피에서 중간엽으로의 전이(EndMT^)를 통해 심내피 세포에서 섬유아세포로의 표현형 변화를 포함한다는 것을 확인했습니다3. EndMT는 분화 클러스터(CD) 31 또는 혈관 내피(VE)-cadherin(CD144) 및 섬유아세포 마커(예: 알파-평활근 액틴, α-SMA)와 같은 내피 마커에 대한 면역조직화학적 이중 염색을 사용하여 검출할 수 있습니다. 또한, 우리는 이전에 전사 인자 SLUG, SNAIL 및 TWIST³의 활성화와 함께 이 과정에서 TGF-ß 경로의 조절....

프로토콜

모든 동물 실험은 국가연구위원회의 규정에 따라 진행되었습니다. 2011. 실험실 동물의 관리 및 사용 가이드: 8판. 동물 프로토콜은 Boston Children's Hospital의 Institutional Animal Care and Use Committee에서 검토 및 승인되었습니다.

수술 전에 모든 수술 기구를 증기 고압멸균하고 최종 농도가 22mmol/L KCl인 변형된 Krebs-Henseleit 완충액을 심마비 용액으로 준비합니다(표 1). 용액은 필터 멸균 처리되어 4°C에서 하룻밤 동안 보관됩니다. 이종 신생아 쥐 심장 이식 절차에는 수술용 현미경(12.5x)이 필요합니다.

1. 준비 및 마취

1. 체중이 약 150g(생후 5-6주령)인 수컷/암컷 루이스 쥐를 수혜자로 사용합니다.
2. 시작하려면 면도기로 쥐의 복부를 넉넉하게 면도하십시오.
3. 쥐를 이소플루란 챔버에 넣고 동물이 적절하게 진정되지만 여전히 자발적으로 숨을 쉴 때까지 2% 이소플루란으로 2L/분의 산소 흐름을 켭니다. 45mg/kg 케타민과 5mg/kg 자일라진을 복강내(IP)로 주사하고 300U/kg 헤파린을 주....

토론

신생아 기증자 쥐의 심장을 수혜자의 복부에 이소성 이식하는 이 동물 모델은 상세한 조직학적 조직 평가를 통해 EndMT 유래 섬유증을 연구하고, 조절 신호 경로를 식별하고, 치료 옵션을 테스트할 수 있는 가능성을 제공합니다. EndMT는 심장 섬유화 질환의 기본 기전이기 때문에 이 모델은 소아 심장 수술 분야와 그 이상의 분야에서 큰 가치를 지닙니다. 이 모형에서는 많은 요인이 절차의 결과에 부.......

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Advanced Ventilator System For Rodents, SAR-1000	CWE, Inc.	12-03100	small animal ventilator
aSMA	Sigma	A2547	Antibody for Immunohistochemistry
Axio observer Z1	Carl Zeiss		inverted microscope
Betadine Solution	Avrio Health L.P.	367618150092
CD31	Invitrogen	MA1-80069	Antibody for Immunohistochemistry
DAPI	Invitrogen	D1306	Antibody for Immunohistochemistry
DemeLON Nylon black 10-0	DemeTECH	NL76100065F0P	10-0 Nylon suture
ETFE IV Catheter, 18G x 2	TERUMO SURFLO	SR-OX1851CA	intubation cannula
Micro Clip 8mm	Roboz Surgical Instrument Co.	RS-6471	microvascular clamps
Nylon black monofilament 11-0	SURGICAL SPECIALTIES CORP	AA0130	11-0 Nylon
O.C.T. Compound	Tissue-Tek	4583	Embedding medium for frozen tissue specimen
p-SMAD2/3	Invitrogen	PA5-110155	Antibody for Immunohistochemistry
Rodent, Tilting WorkStand	Hallowell EMC.	000A3467	oblique shelf for intubation
Silk Sutures, Non-absorbable, 7-0	Braintree Scientific	NC9201231	Silk suture
Slug/Snail	Abcam	ab180714	Antibody for Immunohistochemistry
Undyed Coated Vicryl 5-0 P-3 18"	Ethicon	J493G	5-0 Vicryl
Undyed Coated Vicryl 6-0 P-3 18"	Ethicon	J492G	6-0 Vicryl
VE-Cadherin	Abcam	ab231227	Antibody for Immunohistochemistry
Zeiss OPMI 6-SFR	Zeiss		Surgical microscope
Zen, Blue Edition, 3.6	Zen		inverted microscope software