Неонатальная гетеротопическая модель трансплантации сердца крысы для изучения эндотелиально-мезенхимального перехода

Резюме

В этой работе представлена животная модель фиброза, индуцированного эндотелиально-мезенхимальным переходом, наблюдаемого при врожденных пороках сердца, таких как критический аортальный стеноз или синдром гипоплазии левых отделов сердца, что позволяет провести детальную гистологическую оценку тканей, идентифицировать регуляторные сигнальные пути и протестировать варианты лечения.

Аннотация

Эндокардиальный фиброэластоз (ЭФЭ), определяемый накоплением субэндокардиальной ткани, оказывает значительное влияние на развитие левого желудочка (ЛЖ) и не позволяет пациентам с врожденным критическим аортальным стенозом и синдромом гипоплазии левых отделов сердца (СГЛОС) проводить анатомическую бивентрикулярную хирургическую операцию. Хирургическая резекция в настоящее время является единственным доступным терапевтическим вариантом, но ЭФЭ часто рецидивирует, иногда с еще более инфильтративным характером роста в соседний миокард.

Для лучшего понимания механизмов, лежащих в основе ЭФЭ, и изучения терапевтических стратегий, была разработана модель на животных, пригодная для доклинических испытаний. Животная модель учитывает, что ЭФЭ является заболеванием незрелого сердца и связано с нарушениями кровотока, что подтверждается клиническими наблюдениями. Таким образом, гетеротопическая трансплантация сердца неонатальных донорских сердец крыс является основой для данной модели.

Неонатальное сердце крысы трансплантируется в брюшную полость крысы-подростка и соединяется с инфраренальной аортой реципиента и нижней полой веной. В то время как перфузия коронарных артерий сохраняет жизнеспособность донорского сердца, застой потока в ЛЖ индуцирует рост EFE в очень незрелом сердце. Основным механизмом образования ЭФЭ является переход эндотелиальных клеток эндокарда в мезенхимальные клетки (EndMT), что является хорошо описанным механизмом раннего эмбрионального развития клапанов и перегородок, а также ведущей причиной фиброза при сердечной недостаточности. Образование ЭФЭ можно макроскопически наблюдать в течение нескольких дней после трансплантации. Трансабдоминальная эхокардиография используется для контроля жизнеспособности, сократительной способности и проходимости анастомозов трансплантата. После эвтаназии забор ткани EFE, которая демонстрирует те же гистопатологические характеристики, что и ткань EFE человека у пациентов с HLHS.

Эта модель in vivo позволяет изучать механизмы развития ЭФЭ в сердце и тестировать варианты лечения для предотвращения этого патологического тканевого образования, а также дает возможность для более обобщенного исследования фиброза, индуцированного EndMT.

Введение

Эндокардиальный фиброэластоз (ЭФЭ), определяемый накоплением коллагеновых и эластических волокон в субэндокардиальной ткани, проявляется в виде перламутрового или непрозрачного утолщенного эндокарда; ЭФЭ наиболее активно развивается во внутриутробном периоде и в раннем младенчестве¹. В аутопсийном исследовании 70% случаев с синдромом гипоплазии левых отделов сердца (СГЛОС) были связаны с наличием EFE².

Клетки, экспрессирующие маркеры фибробластов, являются основной клеточной популяцией в EFE, но эти клетки также одновременно экспрессируют эндотелиальные маркеры эндокарда, что является признаком происхождения этих EFE-клеток. Наша группа ранее установила, что основной механизм образования EFE включает фенотипическое изменение эндотелиальных клеток эндокарда в фибробласты через эндотелиально-мезенхимальный переход (EndMT)³. EndMT может быть обнаружен с помощью иммуногистохимического двойного окрашивания для эндотелиальных маркеров, таких как кластер дифференцировки (CD) 31 или эндотелиальный (VE)-кадгерин (CD144) и маркеры фибробластов (например, альфа-гладкомышечный актин, α-SMA). Кроме того, ранее мы также установили регуляторную роль пути TGF-ß в этом процессе с активацией транскрипционных факторов SLUG, SNAIL и TWIST³.

EndMT — это физиологический процесс, который происходит во время эмбрионального развития сердца и приводит к образованию перегородок и клапанов из эндокардиальных подушек⁴, но он также вызывает фиброз органов при сердечной недостаточности, фиброзе почек или раке и играет ключевую роль в атеросклерозе сосудов 5,6,7,8. EndMT при фиброзе сердца в основном регулируется через TGF-β путь, о чем мы и другие сообщали ^3,9. Были описаны различные стимулы, индуцирующие EndMT: воспаление 10, гипоксия 11, механические изменения 12 и нарушения кровотока, включая изменения внутриполостного кровотока 13, и EndMT также может быть следствием генетического заболевания ¹⁴.

Эта животная модель была разработана с использованием ключевых компонентов развития сердечного ЭФЭ, которыми являются незрелость и изменения внутриполостного кровотока, в частности, застой кровотока. Незрелость была восполнена за счет использования сердец новорожденных крыс в качестве доноров, поскольку известно, что неонатальные крысы являются незрелыми в развитии сразу после рождения. Гетеротопическая трансплантация сердца обеспечивала ограничение внутриполостного кровотока¹⁵.

С клинической точки зрения эта животная модель позволяет лучше изучить влияние ЭндМТ на растущий левый желудочек (ЛЖ). Задержка роста, налагаемая на сердце плода и новорожденного путем индуцированного EndMT формирования EFE¹⁶, не позволяет пациентам с обструкцией выводящих путей левого желудочка (LVOTO), такими как врожденный критический аортальный стеноз и синдром гипоплазии левых отделов сердца (СГЛО), лечить анатомическую бивентрикулярную хирургическую операцию¹⁷. Эта животная модель облегчает изучение клеточных механизмов и регуляции формирования тканей с помощью EndMT и позволяет тестировать варианты фармакологического лечения ^3,18.

Трансабдоминальная эхокардиография используется для контроля жизнеспособности, сократительной способности и проходимости анастомозов трансплантата. После эвтаназии образование ЭФЭ можно макроскопически наблюдать в течение 3 дней после трансплантации. Ткань EFE демонстрирует те же гистопатологические характеристики, что и ткань EFE человека у пациентов с LVOTO.

Таким образом, эта животная модель, хотя и разработанная для педиатрического использования в спектре HLHS, может быть применена при изучении различных заболеваний на основе молекулярного механизма EndMT.

протокол

Все процедуры на животных проводились в соответствии с Национальным исследовательским советом. 2011. Руководство по уходу и использованию лабораторных животных: восьмое издание. Протоколы содержания животных были рассмотрены и одобрены Комитетом по уходу за животными и их использованию в Бостонской детской больнице.

Перед операцией все хирургические инструменты проходят автоклавирование паром, а модифицированный буфер Кребса-Хенселейта с конечной концентрацией 22 ммоль/л KCl готовят в виде кардиоплегического раствора (табл. 1). Раствор стерилизуют фильтром и хранят при температуре 4 °С в течение ночи. Хирургический микроскоп (12,5x) необходим для процедуры гетеротопической трансплантации сердца новорожденной крысы.

1. Подготовка и анестезия

1. Используйте самцов/самок крыс Льюиса весом около 150 г (в возрасте 5-6 недель) в качестве реципиентов.
2. Для начала щедро побрейте живот крысы бритвой.
3. Поместите крысу в изофлурановую камеру и включите поток кислорода со скоростью 2 л/мин с 2% изофлураном до тех пор, пока животное не получит надлежащие седативные препараты, но все еще будет самопроизвольно дышать. Вводят 45 мг/кг кетамина и 5 мг/кг ксилазина внутрибрюшинно (ВП), а также 300 ЕД/кг гепарина. Подтвердите надлежащую анестезию с помощью теста на защемление пальца ноги.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Тщательно контролируйте спонтанное дыхание и частоту сердечных сокращений путем пальпации грудной клетки, чтобы обеспечить стабильный гемодинамический статус на протяжении всего процесса.
4. Для интубации поместите крысу на наклонную полку (рис. 1), зафиксируйте передние зубы веревкой и положите голову лицом к хирургу.
5. Поместите свет с внешней стороны шеи на область голосовых связок, захватите язык двумя пальцами и слегка надавите на него вверх и влево, чтобы обеспечить оптимальный обзор для интубации. Используйте канюлю 18 г, 2 г для крысы весом 100-150 г. Закрепите внутритрахеальную трубку скотчем.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Для интубации рекомендуются хирургические лупы с 3,5-кратным увеличением.
6. Подключите интубационную канюлю к аппарату искусственной вентиляции легких для мелких животных и отрегулируйте настройки в соответствии с инструкциями производителя в зависимости от размера животного.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте следующие настройки для крысы весом 150 г: режим громкости; частота дыхания, 55/мин; дыхательный объем, 1,3 мл 50 % соотношение I/E, но при необходимости его можно соответствующим образом отрегулировать. Обеспечьте правильное двустороннее и равномерное движение грудной клетки и непрерывно вводите изофлуран в дозе 0,5–2% через аппарат искусственной вентиляции легких.
7. Положите крысу на грелку (для поддержания нормальной температуры тела) в лежачем положении хвостом к хирургу. Трижды простерилизуйте брюшную полость раствором бетадина и 70% этиловым спиртом попеременно. Введите глазную смазку и накройте крысу стерильной хирургической простыней, оставив брюшную полость открытой.

2. Хирургическая подготовка и гетеротопическая трансплантация неонатального донорского сердца крысе-реципиенту

1. Выполните срединную лапаротомию с использованием скальпеля с 15 лезвиями для разреза кожи и используйте ножницы, чтобы вскрыть переднюю брюшную стенку, с последующим тупым обнажением забрюшинной брюшной аорты и нижней полой вены (IVC) с помощью аппликаторов с ватным наконечником.
2. Мобилизуйте кишечник (включая нисходящую ободочную кишку) и поместите его в правый верхний квадрант. Накройте кишечник теплой марлей, пропитанной физиологическим раствором. Используйте ретракторы, чтобы обеспечить оптимальную экспозицию НПВ и брюшной аорты.
3. Выполняют тупое рассечение инфраренальной НПВ и брюшной аорты вверх по направлению к бифуркации. Перевязать все инфраренальные ветвящиеся артерии и вены (например, нижнюю брыжеечную артерию и артерии лимфатических узлов) нейлоновым швом 10-0.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Существует большая вариативность анатомии этих боковых ветвей. Визуально контролируйте пульс и частоту сердечных сокращений аорты, когда другие методы гемодинамического мониторинга недоступны. Каждые 15 минут оценивайте надлежащую глубину анестезии с помощью теста на защемление пальца ноги. Отрегулируйте концентрацию изофлурана соответствующим образом.
4. После того, как донорское сердце будет извлечено у неонатальной крысы, доставьте вырезанное сердце в стерильных условиях в хирургический бассейн, содержащий буфер Кребса-Хенселейта, в операционное поле. Периодически орошать донорское сердце ледяным кардиоплегическим раствором.
   ПРИМЕЧАНИЕ: При наличии второго хирурга сердце должно быть подготовлено одновременно, так как второй хирург сокращает общее время анестезии животного-реципиента и время ишемии донорского сердца. Если второй хирург недоступен, покройте живот реципиента теплым физиологическим раствором и наблюдайте за животным во время процедуры забора.
5. Наложите четыре небольших атравматических сосудистых зажима на дистальный и проксимальный сегменты инфраренальной аорты и НПВК. При необходимости временно окклюзировать неблагоприятный почечный сосуд шелковым швом 7-0 и снять шов после процедуры. Наложите нейлоновый шов 10-0 вертикально на переднюю стенку аорты, чтобы облегчить аортотомию. Выполняют микроножницами аортотомию с двумя небольшими горизонтальными разрезами (клиновидными), слегка подтягивая шов.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Для удаления тромбов рекомендуется промывание просвета аорты гепаринизированным физиологическим раствором.
6. Поместите донорское сердце на левую (с точки зрения животного) сторону аорты и закрепите инфраренальную аорту реципиента и восходящую аорту донора встык в положениях «12 часов» и «6 часов» аортотомии с помощью швов. Продолжайте накладывать третий и четвертый швы в положениях «3 часа» и «9 часов», осторожно переворачивая сердце на правую сторону аорты после наложения третьего шва. Завершите артериальный анастомоз, наложив один-два шва на каждое промежутк.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Следует соблюдать осторожность, чтобы избежать прикосновения щипцами к восходящей аорте донора или брюшной аорте реципиента при создании анастомоза, чтобы избежать повреждения тканей.
7. Поверните крысу против часовой стрелки так, чтобы голова была обращена к левой руке хирурга. Переместите донорскую аорту в левую сторону брюшной аорты, чтобы обеспечить оптимальный обзор НПВК.
8. Выполните венотомию на НПВ, немного проксимальнее аортального анастомоза, используя лезвие 11 для прокола и микроножницы для адекватной регулировки размера в соответствии с диаметром легочного ствола донора. Снова промойте внутрикавальный просвет гепаринизированным физиологическим раствором.
9. Начните с венозного анастомоза между НПВ реципиента и легочным стволом донора, что лучше всего достигается путем наложения прерывистых нейлоновых швов 11-0 на заднюю стенку сосуда, начиная с положений «12 часов» и «6 часов» (связанных с НПВ), а затем наложите непрерывный нейлоновый шов 11-0 на переднюю стенку (от положения «6 часов» к положению «12 часов»).
10. Накройте анастомозы небольшими полосками рассасывающейся желатиновой губки и снимите микрососудистые зажимы, начиная дистально. Используйте аппликатор с ватным наконечником, чтобы слегка сжать губки для достижения оптимального гемостаза.
11. Понаблюдайте за наполнением коронарных сосудов трансплантата в момент освобождения дистальных микрососудистых зажимов, и убедитесь, что донорское сердце начинает биться сразу после освобождения проксимального зажима.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Жизнеспособность трансплантата может быть оценена от 0 до 4 во время операции в соответствии с модифицированным Стэнфордским баллом¹⁹ для подтверждения адекватной функции трансплантата.
12. Поместите кишечник обратно в брюшную полость, следя за тем, чтобы не деформировать артериальный и венозный анастомоз.
13. Мелоксикам (1 мг/кг) и этика XR (0,65 мг/кг) вводят подкожно, пока животное находится под полным наркозом, чтобы убедиться в послеоперационной анальгезии. Затем закройте брюшную стенку непрерывным рассасывающимся швом 5-0, а затем закройте кожу рассасывающимся швом с викрилом 6-0 внутрикожно.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Рекомендации по распространенным неисправностям и устранению неполадок представлены в таблице 2.

3. Забор сердца неонатального донора

1. Поместите крысу-донора новорожденного в камеру, инсуффляцию изофлураном (2%) для седации. Вводят кетамин (75 мг/кг) и ксилазин (5 мг/кг), а также гепарин (300 ЕД/кг) внутрибрюшинно.
2. Подтвердите глубину анестезии, ущипнув пальцы ног, и уложите крысу в положение лежа на спине хвостом к себе. Стерилизовать всю грудную клетку и брюшную стенку бетадином и 70% этанолом поочередно три раза. Накройте крысу стерильной хирургической простыней.
3. Используя 12,5-кратный хирургический микроскоп, удалите всю переднюю грудную стенку, начав с горизонтального разреза скальпелем с 15 лезвиями в ксифозе с последующими вертикальными разрезами ножницами латерально до подмышечных впадин с обеих сторон. Затем переднюю грудную стенку можно удалить, сделав еще один горизонтальный разрез прямо под шеей.
4. Рассекают ножницами НПВК, правую и левую верхнюю полую вену и легочные сосуды, а затем окружают и перевязывают все сосуды шелковым швом 7-0. Введите 3 мл ледяного модифицированного раствора Кребса-Хенселейта с высоким содержанием калия в правое предсердие, проколов НПВ иглой 30 G и слегка надавливая щипцами на диафрагму.
5. Разрежьте ножницами IVC, SVC, легочные сосуды и аорту. Пересеките легочные артерии как можно дальше и аорту дистальнее брахиоцефального ствола, чтобы обеспечить правильную длину, используя скальпель с 11 лезвиями.
6. Отделить легочный ствол и восходящую аорту микроножницами и промыть сердце ледяным кардиоплегическим раствором с помощью шприца объемом 3 мл.

4. Восстановление реципиента и мониторинг трансплантата

1. После операции дайте крысе достаточно времени, чтобы проснуться, что обычно происходит в течение 15 минут, и дайте ей восстановиться на грелке.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Антибиотики не требуются из-за очень низкого риска инфекции и для того, чтобы не скомпрометировать экспериментальную модель, и не применяются ограничения в пище или воде.
2. После трансплантации ежедневно контролируйте функцию трансплантата, пальпируя пересаженное сердце, но учтите, что иногда это может быть трудно оценить из-за наложения кишечника.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Эхокардиография брюшной полости позволяет более точно измерить жизнеспособность трансплантата. Для проведения эхокардиографии слегка успокойте крысу изофлураном (1-2%), вдыхаемым через носовой конус, и положите ее на грелку. Эхокардиография обычно проводится на 1-й, 7-й и 14-й сутки послеоперационного периода. Для оценки частоты сердечных сокращений и сократительной способности можно легко получить изображения по длинной и короткой осям (рис. 2A, B). Для оценки анастомозов используют допплеровскую эхокардиографию (рис. 3А) и подтверждают образование ткани ЭФЭ в виде эхо-яркого эндокардиального слоя в полости левого желудочка (рис. 3Б, В).

Результаты

Жизнеспособность привоя и биение
В данной работе проводилась визуальная оценка жизнеспособности трансплантата после снятия всех зажимов, а при открытой брюшной полости для наблюдения за трансплантатом допускалось приблизительное время реперфузии 10-15 мин. Та же система оц?...

Обсуждение

Эта животная модель гетеротопической трансплантации сердца новорожденного донора крысы в брюшную полость реципиента создает возможность изучать фиброз, полученный из EndMT, путем детальной гистологической оценки тканей, определения регуляторных сигнальных путей и тестирования вариа?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Advanced Ventilator System For Rodents, SAR-1000	CWE, Inc.	12-03100	small animal ventilator
aSMA	Sigma	A2547	Antibody for Immunohistochemistry
Axio observer Z1	Carl Zeiss		inverted microscope
Betadine Solution	Avrio Health L.P.	367618150092
CD31	Invitrogen	MA1-80069	Antibody for Immunohistochemistry
DAPI	Invitrogen	D1306	Antibody for Immunohistochemistry
DemeLON Nylon black 10-0	DemeTECH	NL76100065F0P	10-0 Nylon suture
ETFE IV Catheter, 18G x 2	TERUMO SURFLO	SR-OX1851CA	intubation cannula
Micro Clip 8mm	Roboz Surgical Instrument Co.	RS-6471	microvascular clamps
Nylon black monofilament 11-0	SURGICAL SPECIALTIES CORP	AA0130	11-0 Nylon
O.C.T. Compound	Tissue-Tek	4583	Embedding medium for frozen tissue specimen
p-SMAD2/3	Invitrogen	PA5-110155	Antibody for Immunohistochemistry
Rodent, Tilting WorkStand	Hallowell EMC.	000A3467	oblique shelf for intubation
Silk Sutures, Non-absorbable, 7-0	Braintree Scientific	NC9201231	Silk suture
Slug/Snail	Abcam	ab180714	Antibody for Immunohistochemistry
Undyed Coated Vicryl 5-0 P-3 18"	Ethicon	J493G	5-0 Vicryl
Undyed Coated Vicryl 6-0 P-3 18"	Ethicon	J492G	6-0 Vicryl
VE-Cadherin	Abcam	ab231227	Antibody for Immunohistochemistry
Zeiss OPMI 6-SFR	Zeiss		Surgical microscope
Zen, Blue Edition, 3.6	Zen		inverted microscope software