Un modelo de trasplante de corazón de rata heterotópico neonatal para el estudio de la transición endotelial a mesenquimal

Resumen

En este trabajo se presenta un modelo animal de fibrosis inducida por transición endotelial-mesenquimatosa, como se observa en defectos cardíacos congénitos como la estenosis aórtica crítica o el síndrome del corazón izquierdo hipoplásico, que permite la evaluación histológica detallada del tejido, la identificación de vías de señalización reguladoras y la prueba de opciones de tratamiento.

Resumen

La fibroelastosis endocárdica (EFE), definida por la acumulación de tejido subendocárdico, tiene un gran impacto en el desarrollo del ventrículo izquierdo (VI) e impide que los pacientes con estenosis aórtica crítica congénita y síndrome del corazón izquierdo hipoplásico (SHH) realicen una reparación quirúrgica anatómica biventricular curativa. La resección quirúrgica es actualmente la única opción terapéutica disponible, pero la EFE a menudo recurre, a veces con un patrón de crecimiento aún más infiltrativo en el miocardio adyacente.

Para comprender mejor los mecanismos subyacentes de la EFE y explorar estrategias terapéuticas, se desarrolló un modelo animal adecuado para pruebas preclínicas. El modelo animal tiene en cuenta que la EFE es una enfermedad del corazón inmaduro y se asocia con alteraciones del flujo, como lo respaldan las observaciones clínicas. Por lo tanto, el trasplante cardíaco heterotópico de corazones de donantes de ratas neonatas es la base de este modelo.

Se trasplanta un corazón de rata neonatal al abdomen de una rata adolescente y se conecta a la aorta infrarrenal y a la vena cava inferior del receptor. Mientras que la perfusión de las arterias coronarias preserva la viabilidad del corazón del donante, el estancamiento del flujo dentro del VI induce el crecimiento de EFE en el corazón muy inmaduro. El mecanismo subyacente de la formación de EFE es la transición de las células endoteliales endocárdicas a las células mesenquimales (EndMT), que es un mecanismo bien descrito de desarrollo embrionario temprano de las válvulas y los tabiques, pero también la principal causa de fibrosis en la insuficiencia cardíaca. La formación de EFE se puede observar macroscópicamente a los pocos días del trasplante. La ecocardiografía transabdominal se utiliza para monitorizar la viabilidad del injerto, la contractilidad y la permeabilidad de las anastomosis. Después de la eutanasia, se extrae el tejido EFE, que muestra las mismas características histopatológicas que el tejido EFE humano de pacientes con HLHS.

Este modelo in vivo permite estudiar los mecanismos de desarrollo de EFE en el corazón y probar opciones de tratamiento para prevenir esta formación de tejido patológico y brinda la oportunidad de un examen más generalizado de la fibrosis inducida por EndMT.

Introducción

La fibroelastosis endocárdica (EFE), definida por la acumulación de colágeno y fibras elásticas en el tejido subendocárdico, se presenta como un endocardio engrosado nacarado u opaco; La EFE experimenta un crecimiento más activo durante el período fetal y la primera infancia¹. En un estudio de autopsia, el 70% de los casos con síndrome del corazón izquierdo hipoplásico (HLHS) se asociaron con la presencia de EFE².

Las células que expresan marcadores de fibroblastos son la principal población celular en EFE, pero estas células también expresan concomitantemente marcadores endoteliales endocárdicos, lo que es una indicación del origen de estas células EFE. Nuestro grupo estableció previamente que el mecanismo subyacente de la formación de EFE implica un cambio fenotípico de células endoteliales endocárdicas a fibroblastos a través de la transición endotelial-mesenquimal (EndMT)³. La MTenda se puede detectar mediante tinción inmunohistoquímica doble para marcadores endoteliales como el grupo de diferenciación (CD) 31 o los marcadores de endotelio vascular (VE)-cadherina (CD144) y fibroblastos (p. ej., actina del músculo liso alfa, α-AME). Además, también establecimos previamente el papel regulador de la vía TGF-ß en este proceso con la activación de los factores de transcripción SLUG, SNAIL y TWIST³.

La MTenda es un proceso fisiológico que ocurre durante el desarrollo cardíaco embrionario y conduce a la formación de los tabiques y las válvulas a partir de las almohadillas endocárdicas⁴, pero también causa fibrosis orgánica en la insuficiencia cardíaca, la fibrosis renal o el cáncer y desempeña un papel clave en la aterosclerosis vascular 5,6,7,8. La EndMT en la fibrosis cardíaca se regula principalmente a través de la vía TGF-β, como hemos reportado nosotros y otros ^3,9. Se han descrito diversos estímulos para inducir la MTenda: inflamación 10, hipoxia¹¹, alteraciones mecánicas 12 y alteraciones del flujo, incluyendo alteraciones del flujo sanguíneo intracavitario 13, y la MTenda también puede ser consecuencia de una enfermedad genética ¹⁴.

Este modelo animal se desarrolló utilizando los componentes clave del desarrollo de EFE cardíaca, que son la inmadurez y las alteraciones del flujo sanguíneo intracavitario, específicamente el estancamiento del flujo. La inmadurez se cumplió utilizando corazones de ratas neonatos como donantes, ya que se sabe que las ratas neonatas son inmaduras en su desarrollo inmediatamente después del nacimiento. El trasplante cardíaco heterotópico ofrecía la provisión de restricción del flujo intracavitario¹⁵.

Desde un punto de vista clínico, este modelo animal permite investigar mejor el impacto de la MTenM en el ventrículo izquierdo (VI) en crecimiento. La restricción del crecimiento impuesta al corazón fetal y neonatal a través de la formación de EFE inducida por EndMT¹⁶ impide que los pacientes con obstrucciones del tracto de salida del ventrículo izquierdo (VOVE), como la estenosis aórtica crítica congénita y el síndrome del corazón izquierdo hipoplásico (HLHS), puedan realizar una reparación quirúrgica biventricular anatómica curativa¹⁷. Este modelo animal facilita el estudio de los mecanismos celulares y la regulación de la formación de tejidos a través de la EndMT y permite probar opciones de tratamiento farmacológico ^3,18.

La ecocardiografía transabdominal se utiliza para monitorizar la viabilidad del injerto, la contractilidad y la permeabilidad de las anastomosis. Después de la eutanasia, la formación de EFE se puede observar macroscópicamente dentro de los 3 días posteriores al trasplante. El tejido EFE presenta las mismas características histopatológicas que el tejido EFE humano de pacientes con OVCE.

Por lo tanto, este modelo animal, aunque desarrollado para uso pediátrico en el espectro de HLHS, se puede aplicar en el estudio de diversas enfermedades basadas en el mecanismo molecular de EndMT.

Protocolo

Todos los procedimientos con animales se llevaron a cabo de acuerdo con el Consejo Nacional de Investigación. 2011. Guía para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio: Octava Edición. Los protocolos con animales fueron revisados y aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales del Boston Children's Hospital.

Antes de la cirugía, todos los instrumentos quirúrgicos se esterilizan en autoclave con vapor y se prepara como solución cardiopléjica el tampón Krebs-Henseleit modificado, con una concentración final de 22 mmol/L KCl (Tabla 1). La solución se esteriliza con filtro y se almacena a 4 °C durante la noche. Se requiere un microscopio quirúrgico (12,5x) para el procedimiento de trasplante de corazón de rata neonatal heterotópico.

1. Preparación y anestesia

1. Utilice ratas Lewis macho/hembra con un peso de alrededor de 150 g (5-6 semanas de edad) como recipientes.
2. Para empezar, afeita generosamente el abdomen de la rata con una navaja.
3. Coloque a la rata en una cámara de isoflurano y abra el flujo de oxígeno a 2 L/min con isoflurano al 2% hasta que el animal esté debidamente sedado pero aún respire espontáneamente. Inyectar 45 mg/kg de ketamina y 5 mg/kg de xilacina por vía intraperitoneal (IP), así como 300 U/kg de heparina. Confirme la anestesia adecuada con una prueba de pellizco en el dedo del pie.
   NOTA: Monitorizar cuidadosamente la respiración espontánea y la frecuencia cardíaca a través de la palpación del tórax para asegurar un estado hemodinámico estable durante todo el proceso.
4. Para la intubación, coloque la rata en un estante oblicuo (Figura 1), asegure los dientes frontales con una cuerda y coloque la cabeza mirando hacia el cirujano.
5. Coloque la luz en la parte exterior del cuello en el área de las cuerdas vocales, agarre la lengua con dos dedos y empújela ligeramente hacia arriba y hacia la izquierda para proporcionar una visión óptima para la intubación. Use una cánula de 18 g y 2 pulgadas para una rata de 100-150 g. Asegure el tubo intratraqueal con cinta adhesiva.
   NOTA: Se recomiendan lupas quirúrgicas con un aumento de 3,5x para la intubación.
6. Conecte la cánula de intubación al ventilador para animales pequeños y ajuste la configuración de acuerdo con las instrucciones del fabricante según el tamaño del animal.
   NOTA: Utilice los siguientes ajustes para una rata de 150 g: modo de volumen; frecuencia respiratoria, 55/min; volumen corriente, 1,3 mL 50 % I/E, pero esto se puede ajustar adecuadamente según sea necesario. Asegure un movimiento torácico bilateral e igualitario adecuado, y administre isoflurano continuamente al 0,5 % al 2 % a través del ventilador.
7. Coloque a la rata sobre una almohadilla térmica (para mantener la temperatura corporal normal) en posición supina con la cola mirando hacia el cirujano. Esterilizar el abdomen tres veces con solución de betadine y etanol al 70% alternativamente. Administre lubricante para los ojos y cubra a la rata con un paño quirúrgico estéril, dejando el abdomen descubierto.

2. Preparación quirúrgica y trasplante heterotópico del corazón del donante neonatal en la rata receptora

1. Realice una laparotomía de la línea media con un bisturí de 15 hojas para la incisión en la piel y use tijeras para abrir la pared abdominal anterior, seguida de una exposición roma de la aorta abdominal retroperitoneal y la vena cava inferior (VCI) con aplicadores de punta de algodón.
2. Moviliza los intestinos (incluido el colon descendente) y colócalos hacia el cuadrante superior derecho. Cubra los intestinos con una gasa tibia empapada en solución salina. Utilice retractores para asegurar una exposición óptima de la VCI y la aorta abdominal.
3. Realizar disección roma de la VCI infrarrenal y de la aorta abdominal hacia la bifurcación. Ligar todas las arterias y venas que se ramifican infrarrenales (p. ej., arteria mesentérica inferior y arterias de ganglios linfáticos) con una sutura de nailon 10-0.
   NOTA: Existe una gran variabilidad en la anatomía de estas ramas laterales. Controlar visualmente el pulso y la frecuencia cardíaca de la aorta cuando no se dispone de otro control hemodinámico. Evalúe la profundidad adecuada de la anestesia cada 15 minutos a través de una prueba de pellizco en los dedos de los pies. Ajuste la concentración de isoflurano en consecuencia.
4. Después de que se haya extraído el corazón del donante de una rata neonata, se entregará el corazón extirpado en condiciones estériles en un recipiente quirúrgico que contenga tampón Krebs-Henseleit al campo quirúrgico. Irrigar el corazón del donante de forma intermitente con una solución cardiopléjica helada.
   NOTA: Cuando se dispone de un segundo cirujano, el corazón debe prepararse al mismo tiempo, ya que un segundo cirujano reduce el tiempo total de anestesia del animal receptor y el tiempo de isquemia del corazón donante. Cuando no haya un segundo cirujano disponible, cubra el abdomen del receptor con solución salina tibia y controle al animal durante el procedimiento de recolección.
5. Aplique cuatro pinzas vasculares atraumáticas pequeñas en los segmentos distal y proximal de la aorta infrarrenal y la VCI. Si es necesario, ocluya temporalmente un vaso renal desfavorable con una sutura de seda 7-0 y suelte la sutura después del procedimiento. Colocar una sutura de nylon 10-0 verticalmente en la pared anterior de la aorta para facilitar la aortotomía. Realizar una aortotomía con dos pequeños cortes horizontales (en forma de cuña) con unas microtijeras tirando ligeramente hacia arriba de la sutura.
   NOTA: Para eliminar cualquier coágulo de sangre, se recomienda enjuagar la luz aórtica con solución salina heparinizada.
6. Coloque el corazón del donante en el lado izquierdo (desde la perspectiva del animal) de la aorta y asegure la aorta infrarrenal del receptor y la aorta ascendente del donante de extremo a lado en las posiciones de las 12 en punto y las 6 en punto de la aortotomía con suturas. Continúe con la tercera y cuarta sutura en las posiciones de las 3 en punto y las 9 en punto, volteando suavemente el corazón hacia el lado derecho de la aorta después de la tercera sutura. Completar la anastomosis arterial añadiendo una o dos suturas a cada espacio intersectorial.
   NOTA: Se debe tener cuidado de evitar tocar la aorta ascendente del donante o la aorta abdominal del receptor con fórceps al crear la anastomosis para evitar daños tisulares.
7. Gire la rata en sentido contrario a las agujas del reloj, con la cabeza mirando hacia la mano izquierda del cirujano. Mueva la aorta del donante hacia el lado izquierdo de la aorta abdominal para permitir una visión óptima de la VCI.
8. Realizar una venotomía en la VCI, ligeramente proximal a la anastomosis aórtica, utilizando una cuchilla de 11 para la punción y microtijeras para un adecuado ajuste del tamaño según el diámetro del tronco pulmonar del donante. Nuevamente, enjuague la luz intracava con solución salina heparinizada.
9. Comience con la anastomosis venosa entre la VCI del receptor y el tronco pulmonar del donante, que se logra mejor colocando suturas de nailon 11-0 interrumpidas en la pared posterior del vaso, comenzando en las posiciones de las 12 en punto y las 6 en punto (relacionadas con la VCI), y luego coloque una sutura continua de nailon 11-0 en la pared frontal (desde las 6 en punto hacia la posición de las 12 en punto).
10. Cubra las anastomosis con pequeñas tiras de una esponja de gelatina absorbible y retire las pinzas microvasculares comenzando distalmente. Utilice un aplicador de punta de algodón para comprimir ligeramente las esponjas para obtener una hemostasia óptima.
11. Observe el llenado de los vasos coronarios del injerto en el momento de la liberación de las pinzas microvasculares distales y asegúrese de que el corazón del donante comience a latir inmediatamente cuando se suelta la pinza proximal.
    NOTA: La viabilidad del injerto se puede calificar de 0 a 4 intraoperatoriamente de acuerdo con una puntuación de Stanford modificada¹⁹ para confirmar la función adecuada del injerto.
12. Vuelva a colocar los intestinos en el abdomen asegurándose de no distorsionar la anastomosis arterial y venosa.
13. Administrar meloxicam (1 mg/kg) y ethiqa XR (0,65 mg/kg) por vía subcutánea mientras el animal está completamente anestesiado para determinar la analgesia postoperatoria. A continuación, cierre la pared abdominal con una sutura continua de vicryl absorbible 5-0 antes de cerrar la piel con una sutura de vicryl absorbible 6-0 por vía intracutánea.
    NOTA: En la Tabla 2 se presentan instrucciones sobre fallas comunes y solución de problemas.

3. Extracción del corazón del donante neonatal

1. Colocar a la rata donante neonata en una cámara insuflada con isoflurano (2%) para su sedación. Administrar ketamina (75 mg/kg) y xilacina (5 mg/kg), así como heparina (300 U/kg) por vía intraperitoneal.
2. Confirme la profundidad de la anestesia pellizcando los dedos de los pies y coloque a la rata en posición supina con la cola hacia usted. Esterilizar todo el tórax y la pared abdominal con betadine y etanol al 70% tres veces alternativamente. Cubre a la rata con un paño quirúrgico estéril.
3. Con un microscopio quirúrgico de 12,5x, extirpe toda la pared torácica anterior comenzando con una incisión horizontal con un bisturí de 15 hojas en la xifoides, seguida de incisiones verticales lateralmente hasta las axilas en ambos lados con tijeras. La pared torácica anterior se puede extirpar continuando con otra incisión horizontal justo debajo del cuello.
4. Diseccionar la vena cava superior, la vena cava superior derecha e izquierda y los vasos pulmonares con unas tijeras, y luego rodear y ligar todos los vasos con una sutura de seda 7-0. Administre 3 ml de solución Krebs-Henseleit helada y modificada con alto contenido de potasio en la aurícula derecha perforando la VCI con una aguja de 30 G y empujando ligeramente el diafragma hacia abajo con fórceps.
5. Cortar la vena ventricular, las venas venculosas venosas, los vasos pulmonares y la aorta con unas tijeras. Transecte las arterias pulmonares lo más lejos posible y la aorta distal al tronco braquiocefálico para asegurar la longitud adecuada utilizando un bisturí de 11 hojas.
6. Separe el tronco pulmonar y la aorta ascendente con unas tijeras, y enjuague el corazón con una solución cardiopléjica helada con una jeringa de 3 ml.

4. Recuperación del receptor y seguimiento del injerto

1. Después de la cirugía, dale a la rata tiempo suficiente para que se despierte, lo que generalmente ocurre en una ventana de tiempo de 15 minutos, y deja que se recupere en una almohadilla térmica.
   NOTA: No se necesitan antibióticos debido al muy bajo riesgo de infección y para no comprometer el modelo experimental, y no se aplica ninguna restricción a la comida o al agua.
2. Después del trasplante, controle la función del injerto mediante la palpación del corazón trasplantado diariamente, pero tenga en cuenta que esto a veces puede ser difícil de evaluar debido a la superposición intestinal.
   NOTA: La ecocardiografía abdominal puede medir con mayor precisión la viabilidad del injerto. Para la ecocardiografía, seda ligeramente a la rata con isoflurano (1-2%) inhalado a través de un cono nasal y colóquela sobre una almohadilla térmica. La ecocardiografía generalmente se realiza en el día postoperatorio (POD) 1, POD 7 y POD 14. Para permitir la evaluación de la frecuencia cardíaca y la contractilidad, se pueden obtener fácilmente vistas de eje largo y eje corto (Figura 2A, B). Para evaluar las anastomosis, se utilizó la ecocardiografía Doppler (Figura 3A) y se confirmó la formación de tejido EFE como una capa endocárdica ecobrillante dentro de la cavidad ventricular izquierda (Figura 3B, C).

Resultados

Viabilidad y batido del injerto
En este trabajo, se evaluó visualmente la viabilidad del injerto después de que se retiraron todas las pinzas, y se permitió un tiempo aproximado de reperfusión de 10-15 min con el abdomen abierto para la observación del injerto. El mismo sistema de puntuación para verificar objetivamente la viabilidad del injerto se utilizó para la evaluación visual al final de la cirugía y para la ecocardiografía en el POD 1, POD 7 y POD 14.

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Discusión

Este modelo animal de trasplante heterotópico de corazón de rata donante neonatal en el abdomen del receptor crea la posibilidad de estudiar la fibrosis derivada de EndMT a través de una evaluación histológica detallada del tejido, identificar vías de señalización reguladoras y probar opciones de tratamiento. Dado que EndMT es el mecanismo subyacente para las enfermedades fibróticas del corazón, este modelo tiene un gran valor en el campo de la cirugía cardíaca pediátrica y más allá. En este modelo, muchos...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Advanced Ventilator System For Rodents, SAR-1000	CWE, Inc.	12-03100	small animal ventilator
aSMA	Sigma	A2547	Antibody for Immunohistochemistry
Axio observer Z1	Carl Zeiss		inverted microscope
Betadine Solution	Avrio Health L.P.	367618150092
CD31	Invitrogen	MA1-80069	Antibody for Immunohistochemistry
DAPI	Invitrogen	D1306	Antibody for Immunohistochemistry
DemeLON Nylon black 10-0	DemeTECH	NL76100065F0P	10-0 Nylon suture
ETFE IV Catheter, 18G x 2	TERUMO SURFLO	SR-OX1851CA	intubation cannula
Micro Clip 8mm	Roboz Surgical Instrument Co.	RS-6471	microvascular clamps
Nylon black monofilament 11-0	SURGICAL SPECIALTIES CORP	AA0130	11-0 Nylon
O.C.T. Compound	Tissue-Tek	4583	Embedding medium for frozen tissue specimen
p-SMAD2/3	Invitrogen	PA5-110155	Antibody for Immunohistochemistry
Rodent, Tilting WorkStand	Hallowell EMC.	000A3467	oblique shelf for intubation
Silk Sutures, Non-absorbable, 7-0	Braintree Scientific	NC9201231	Silk suture
Slug/Snail	Abcam	ab180714	Antibody for Immunohistochemistry
Undyed Coated Vicryl 5-0 P-3 18"	Ethicon	J493G	5-0 Vicryl
Undyed Coated Vicryl 6-0 P-3 18"	Ethicon	J492G	6-0 Vicryl
VE-Cadherin	Abcam	ab231227	Antibody for Immunohistochemistry
Zeiss OPMI 6-SFR	Zeiss		Surgical microscope
Zen, Blue Edition, 3.6	Zen		inverted microscope software