מודל השתלת לב חולדה הטרוטופי בילוד לחקר המעבר מאנדותל למזנכימלי

Summary

עבודה זו מציגה מודל חייתי של פיברוזיס המושרה על ידי מעבר אנדותל למזנכימלי, כפי שניתן לראות במומים לבביים מולדים כגון היצרות קריטית של אבי העורקים או תסמונת לב שמאל היפופלסטית, המאפשרת הערכה היסטולוגית מפורטת של רקמות, זיהוי מסלולי איתות רגולטוריים ובדיקת אפשרויות טיפול.

Abstract

לפיברואלסטוזיס אנדוקרדיאלי (EFE), המוגדר על ידי הצטברות רקמות תת-אנדוקרדיאליות, יש השפעות משמעותיות על התפתחות החדר השמאלי (LV) ומונע מחולים עם היצרות מולדת קריטית של אבי העורקים ותסמונת לב שמאל היפופלסטית (HLHS) תיקון כירורגי אנטומי דו-חדרי מרפא. כריתה כירורגית היא כיום האפשרות הטיפולית היחידה הזמינה, אך EFE חוזר לעתים קרובות, לפעמים עם דפוס גדילה חודר עוד יותר לתוך שריר הלב הסמוך.

כדי להבין טוב יותר את המנגנונים הבסיסיים של EFE ולחקור אסטרטגיות טיפוליות, פותח מודל בעלי חיים המתאים לניסויים פרה-קליניים. המודל החייתי לוקח בחשבון כי EFE היא מחלה של הלב הלא בוגר והיא קשורה להפרעות זרימה, כפי שנתמך על ידי תצפיות קליניות. לפיכך, השתלת לב הטרוטופית של לב תורם חולדה בילוד היא הבסיס למודל זה.

לב חולדה ילוד מושתל בבטנה של חולדה מתבגרת ומחובר לאבי העורקים האינפרא-כלייתי ולווריד הנבוב התחתון של הנמען. בעוד זילוח של העורקים הכליליים משמר את הכדאיות של הלב התורם, קיפאון זרימה בתוך LV גורם לצמיחת EFE בלב מאוד לא בוגר. המנגנון הבסיסי של היווצרות EFE הוא המעבר של תאי אנדותל אנדוקרדיאליים לתאים מזנכימליים (EndMT), שהוא מנגנון מתואר היטב של התפתחות עוברית מוקדמת של המסתמים והספטה, אך גם הגורם המוביל לפיברוזיס באי ספיקת לב. היווצרות EFE ניתן לראות באופן מאקרוסקופי בתוך ימים לאחר ההשתלה. אקוקרדיוגרפיה טרנס-בטנית משמשת לניטור כדאיות השתל, התכווצות ופטנט האנסטומוזות. לאחר המתת חסד, רקמת EFE נקצרת, והיא מראה את אותם מאפיינים היסטופתולוגיים כמו רקמת EFE אנושית מחולי HLHS.

מודל in vivo זה מאפשר ללמוד את מנגנוני התפתחות EFE בלב ולבחון אפשרויות טיפול למניעת היווצרות רקמה פתולוגית זו ומספק הזדמנות לבדיקה כללית יותר של פיברוזיס המושרה על ידי EndMT.

Introduction

פיברואלסטוזיס אנדוקרדיאלי (EFE), המוגדר על ידי הצטברות קולגן וסיבים אלסטיים ברקמה התת-אנדוקרדיאלית, מציג כאנדוקרדיום מעובה פניני או אטום; EFE עובר את רוב הגדילה הפעילה במהלך תקופת העובר והינקות המוקדמת¹. במחקר נתיחה שלאחר המוות, 70% מהמקרים עם תסמונת לב שמאל היפופלסטית (HLHS) היו קשורים לנוכחות של EFE².

תאים המבטאים סמנים לפיברובלסטים הם אוכלוסיית התאים העיקרית ב-EFE, אך תאים אלה מבטאים במקביל גם סמני אנדותל אנדוקרדיאלים, דבר המהווה אינדיקציה למקורם של תאי EFE אלה. הקבוצה שלנו קבעה בעבר כי המנגנון הבסיסי של היווצרות EFE כרוך בשינוי פנוטיפי של תאי אנדותל אנדוקרדיאליים לפיברובלסטים באמצעות מעבר אנדותל למזנכימלי (EndMT)³. ניתן לזהות EndMT באמצעות צביעה כפולה אימונוהיסטוכימית עבור סמני אנדותל כגון אשכול התמיינות (CD) 31 או אנדותל כלי דם (VE)-קדהרין (CD144) וסמנים פיברובלסטים (למשל, אקטין שריר אלפא-חלק, α-SMA). יתר על כן, קבענו בעבר את התפקיד הרגולטורי של מסלול TGF-ß בתהליך זה עם הפעלת גורמי השעתוק SLUG, SNAIL ו- TWIST³.

EndMT הוא תהליך פיזיולוגי המתרחש במהלך התפתחות הלב העוברית ומוביל להיווצרות הספטה והמסתמים מכריות אנדוקרדיאליות⁴, אך הוא גם גורם לפיברוזיס איברים באי ספיקת לב, פיברוזיס בכליות או סרטן וממלא תפקיד מפתח בטרשת עורקים וסקולרית 5,6,7,8. EndMT בפיברוזיס לב מוסדר בעיקר באמצעות מסלול TGF-β, כפי שאנו ואחרים דיווחנו ^3,9. גירויים שונים תוארו כגורמים ל-EndMT: דלקת 10, היפוקסיה 11, שינויים מכניים 12 והפרעות זרימה, כולל שינויים בזרימת הדם התוך-חללית 13, ו-EndMT עשוי להיות גם תוצאה של מחלה גנטית ¹⁴.

מודל בעלי חיים זה פותח באמצעות מרכיבי המפתח של התפתחות EFE לבבית, שהם חוסר בשלות ושינויים של זרימת הדם intracavitary, במיוחד קיפאון זרימה. חוסר הבשלות הושג על ידי שימוש בלבבות חולדות ילודים כתורמים, שכן חולדות יילודים ידועות כלא בשלות מבחינה התפתחותית מיד לאחר הלידה. השתלת לב הטרוטופית הציעה מתן הגבלת זרימה תוך חללית¹⁵.

מנקודת מבט קלינית, מודל בעלי חיים זה מאפשר לחקור טוב יותר את ההשפעה של EndMT על החדר השמאלי הגדל (LV). מגבלת הגדילה המוטלת על לב העובר והיילוד באמצעות היווצרות EFE¹⁶ הנגרמת על ידי EndMT מונעת מחולים עם חסימות בדרכי זרימת החדר השמאלי (LVOTO) כגון היצרות מולדת קריטית של אבי העורקים ותסמונת לב שמאל היפופלסטית (HLHS) מתיקון כירורגי אנטומי אנטומי מרפא¹⁷. מודל בעלי חיים זה מאפשר את חקר המנגנונים התאיים וויסות היווצרות רקמות באמצעות EndMT ומאפשר בדיקה של אפשרויות טיפול תרופתי ^3,18.

אקוקרדיוגרפיה טרנס-בטנית משמשת לניטור כדאיות השתל, התכווצות ופטנט האנסטומוזות. לאחר המתת חסד, היווצרות EFE ניתן לצפות באופן מקרוסקופי בתוך 3 ימים לאחר ההשתלה. רקמת EFE מראה את אותם מאפיינים היסטופתולוגיים כמו רקמת EFE אנושית מחולים עם LVOTO.

לפיכך, מודל בעלי חיים זה, למרות שפותח לשימוש בילדים בספקטרום של HLHS, יכול להיות מיושם בעת חקר מחלות שונות המבוססות על המנגנון המולקולרי של EndMT.

Protocol

כל ההליכים בבעלי חיים נערכו בהתאם למועצה הלאומית למחקר. 2011. מדריך לטיפול ושימוש בחיות מעבדה: מהדורה שמינית. הפרוטוקולים של בעלי החיים נבדקו ואושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים בבית החולים לילדים בבוסטון.

לפני הניתוח, כל כלי הניתוח הם autoclaved קיטור, חיץ Krebs-Henseleit שונה, עם ריכוז סופי של 22 mmol / L KCl, מוכן כמו פתרון cardioplegic (טבלה 1). התמיסה עוברת סינון מעוקר ומאוחסנת בטמפרטורה של 4°C למשך הלילה. מיקרוסקופ כירורגי (12.5x) נדרש להליך השתלת לב חולדה הטרוטופית בילוד.

1. הכנה והרדמה

1. השתמשו בחולדות לואיס זכר/נקבות במשקל של כ-150 גרם (גיל 5-6 שבועות) כמושתלים.
2. בתור התחלה, גלחו בנדיבות את בטנה של החולדה עם סכין גילוח.
3. הכניסו את החולדה לתא איזופלורן, והפעילו את זרימת החמצן ב-2 ליטר/דקה עם 2% איזופלורן עד שבעל החיים מורדם כראוי אך עדיין נושם באופן ספונטני. הזריקו 45 מ"ג/ק"ג קטמין ו-5 מ"ג/ק"ג קסילזין תוך צפקי (IP), כמו גם 300 U/kg הפרין. יש לוודא הרדמה תקינה באמצעות בדיקת צביטת בוהן.
   הערה: עקוב בקפידה אחר הנשימה הספונטנית וקצב הלב באמצעות מישוש החזה כדי להבטיח מצב המודינמי יציב לאורך כל התהליך.
4. עבור אינטובציה, הניחו את החולדה על מדף אלכסוני (איור 1), הדקו את השיניים הקדמיות באמצעות חוט, והניחו את הראש פונה לכיוון המנתח.
5. הניחו את האור בצד החיצוני של הצוואר על אזור מיתרי הקול, תפסו את הלשון בשתי אצבעות ודחפו אותה מעט כלפי מעלה ושמאלה כדי לספק ראייה אופטימלית לאינטובציה. השתמש 18 גרם, 2 בצינורית עבור 100-150 גרם חולדה. אבטח את הצינור intratracheal עם קלטת.
   הערה: לופים כירורגיים עם הגדלה של פי 3.5 מומלצים לאינטובציה.
6. חברו את צינורית האינטובציה למכונת ההנשמה של בעלי החיים הקטנים, והתאימו את ההגדרות בהתאם להוראות היצרן בהתאם לגודל החי.
   הערה: השתמש בהגדרות הבאות עבור חולדה של 150 גרם: מצב עוצמת קול; קצב נשימה, 55/דקה; נפח גאות, 1.3 מ"ל 50% יחס I/E, אך ניתן לכוונן זאת בהתאם לצורך. להבטיח תנועת חזה דו-צדדית תקינה ושווה, ולתת איזופלורן ברציפות ב-0.5%-2% דרך מכונת ההנשמה.
7. הניחו את החולדה על כרית חימום (כדי לשמור על טמפרטורת גוף תקינה) במצב שכיבה כשהזנב פונה לכיוון המנתח. לעקר את הבטן שלוש פעמים עם תמיסת betadine ו 70% אתנול לסירוגין. יש לתת סיכה לעיניים, ולכסות את החולדה עם רפש כירורגי סטרילי, משאיר את הבטן חשופה.

2. הכנה כירורגית והשתלה הטרוטופית של לב תורם היילוד בחולדה הנתרמת

1. בצע לפרוטומיה בקו האמצע באמצעות אזמל 15 להבים לחתך העור, והשתמש במספריים כדי לפתוח את דופן הבטן הקדמית, ולאחר מכן חשיפה קהה של אבי העורקים הבטני retroperitoneal ו vena cava נחות (IVC) עם אפליקטורים קצה כותנה.
2. גייסו את המעיים (כולל המעי הגס היורד), והניחו אותם לכיוון הרביע העליון הימני. מכסים את המעיים בגזה חמה ספוגה במי מלח. השתמש retractors כדי להבטיח חשיפה אופטימלית של IVC ואבי העורקים הבטן.
3. בצע דיסקציה קהה של IVC אינפרא כלייתי ואבי העורקים הבטני כלפי מעלה לכיוון הביפורקציה. קשרו את כל העורקים והוורידים המסתעפים האינפרא-כליתיים (למשל, עורק מזנטרי תחתון ועורקי בלוטות הלימפה) בתפר ניילון 10-0.
   הערה: קיימת שונות רבה באנטומיה של ענפים צדדיים אלה. נטר את הדופק והדופק של אבי העורקים באופן חזותי כאשר אין ניטור המודינמי אחר זמין. להעריך את עומק ההרדמה הנכון כל 15 דקות באמצעות בדיקת צביטת בוהן. התאימו את ריכוז האיזופלורן בהתאם.
4. לאחר שהלב התורם נקצר מחולדה ילודית, העבירו את הלב הנכרת בתנאים סטריליים באגן כירורגי המכיל חיץ קרבס-הנסלייט לשדה הניתוח. השקו את לב התורם לסירוגין בתמיסה קרדיופלגית קרה כקרח.
   הערה: כאשר מנתח שני זמין, הלב צריך להיות מוכן באותו זמן, כמו מנתח שני מקטין את זמן ההרדמה הכולל של החיה המקבל ואת זמן איסכמיה של הלב התורם. כאשר מנתח שני אינו זמין, כסו את בטנו של המושתל במי מלח חמים, והשגיחו על בעל החיים במהלך הליך הקציר.
5. החל ארבעה מלחציים קטנים כלי דם א-טראומטיים על המקטעים הדיסטליים והפרוקסימליים של אבי העורקים האינפרא-כלייתי וה- IVC. במידת הצורך, יש לחסום באופן זמני כלי דם שלילי עם תפר משי 7-0, ולשחרר את התפר לאחר ההליך. מניחים תפר ניילון 10-0 אנכית על הקיר הקדמי של אבי העורקים כדי להקל על אבי העורקים. בצע אבי עורקים עם שני חתכים אופקיים קטנים (בצורת טריז) עם מספריים על ידי משיכה קלה למעלה את התפר.
   הערה: כדי להסיר קרישי דם, מומלץ לשטוף את לומן אבי העורקים עם מי מלח heparinized.
6. הניחו את לב התורם בצד שמאל (מנקודת מבטו של בעל החיים) של אבי העורקים והדקו את אבי העורקים האינפרא-כלייתי של המקבל ואת אבי העורקים העולה של התורם מקצה לצד בעמדות 12 ו-6 של אבי העורקים עם תפרים. ממשיכים עם התפרים השלישי והרביעי בעמדות 3 ו-9, הופכים בעדינות את הלב לצד ימין של אבי העורקים לאחר התפר השלישי. השלם את האנסטומוזה העורקית על ידי הוספת תפר אחד או שניים לכל אינטרספייס.
   הערה: יש להקפיד להימנע מלגעת באבי העורקים העולה של התורם או באבי העורקים הבטני של המקבל עם מלקחיים בעת יצירת האנסטומוזה כדי למנוע נזק לרקמות.
7. סובבו את החולדה נגד כיוון השעון, כשהראש פונה לכיוון ידו השמאלית של המנתח. העבר את אבי העורקים של התורם לצד שמאל של אבי העורקים הבטני כדי לאפשר ראייה אופטימלית על IVC.
8. בצע venotomy על IVC, מעט פרוקסימלי אנסטומוזה אבי העורקים, באמצעות להב 11 לנקב ו microscissors להתאמת גודל הולם על פי קוטר של תא המטען הראתי של התורם. שוב, לשטוף את לומן intracaval עם מלוחים heparinized.
9. התחל באנסטומוזה הוורידית בין ה- IVC של המקבל לבין גזע הריאה של התורם, אשר מושגת בצורה הטובה ביותר על ידי הנחת תפרי ניילון קטועים 11-0 על הקיר האחורי של כלי השיט, החל מעמדות השעה 12 ו- 6 (הקשורות ל- IVC), ולאחר מכן הנח תפר ניילון רציף 11-0 על הקיר הקדמי (משעה 6 לכיוון השעה 12).
10. מכסים את האנסטומוזות ברצועות קטנות של ספוג ג'לטין נספג, ומסירים את מהדקי כלי הדם המתחילים בצורה דיסטלית. השתמשו באפליקטור קצה כותנה כדי לדחוס קלות את הספוגים לקבלת המוסטאזיס אופטימלי.
11. שימו לב למילוי כלי הדם הכליליים של השתל בזמן שחרור המלחציים המיקרו-וסקולריים הדיסטליים, וודאו שהלב התורם מתחיל לפעום מיד עם שחרור המהדק הפרוקסימלי.
    הערה: ניתן לדרג את כדאיות השתל מ-0 עד 4 תוך ניתוחית על פי ציון סטנפורד שונה¹⁹ כדי לאשר תפקוד השתל הולם.
12. החזירו את המעיים לבטן על ידי הקפדה שלא לעוות את האנסטומוזה העורקית והוורידית.
13. יש לתת מלוקסיקאם (1 מ"ג/ק"ג) ואתיקה XR (0.65 מ"ג/ק"ג) באופן תת-עורי בזמן שהחיה מורדמת במלואה כדי לברר שיכוך כאבים לאחר הניתוח. לאחר מכן, סגור את דופן הבטן עם תפר ויקריל רציף נספג 5-0 לפני סגירת העור עם תפר ויקריל נספג 6-0 תוך עורית.
    הערה: הנחיות לגבי כשלים נפוצים ופתרון בעיות מוצגות בטבלה 2.

3. קצירת לב תורם היילוד

1. הניחו את החולדה התורמת היילודית בתא עם איזופלורן (2%) לצורך הרגעה. מתן קטמין (75 מ"ג/ק"ג) וקסילזין (5 מ"ג/ק"ג), כמו גם הפרין (300 U/kg) תוך צפק.
2. אשרו את עומק ההרדמה על ידי צביטת אצבע, והניחו את החולדה במצב שכיבה כשהזנב פונה אליכם. לעקר את כל בית החזה ואת דופן הבטן עם בטאדין ואתנול 70% שלוש פעמים לחילופין. כסו את החולדה בשפשוף כירורגי סטרילי.
3. באמצעות מיקרוסקופ כירורגי 12.5x, הסר את כל דופן בית החזה הקדמי על ידי התחלה עם חתך אופקי באמצעות אזמל 15 להבים ב xyphoid ואחריו חתכים אנכיים לרוחב עד בית השחי משני הצדדים עם מספריים. לאחר מכן ניתן להסיר את דופן בית החזה הקדמי על ידי המשך חתך אופקי נוסף ממש מתחת לצוואר.
4. לנתח את IVC, ימין ושמאל vena cavae, וכלי ריאה עם מספריים, ולאחר מכן להקיף ולקשור את כל כלי הדם עם תפר משי 7-0. יש לתת 3 מ"ל של תמיסת קרבס-הנסלייט קרה כקרח, עתירת אשלגן לאטריום הימני על ידי ניקוב IVC עם מחט 30 גרם ודחיפה קלה של הסרעפת כלפי מטה עם מלקחיים.
5. חותכים את IVC, SVCs, כלי ריאה, אבי העורקים עם מספריים. העבר את עורקי הריאה רחוק ככל האפשר ואת אבי העורקים הדיסטלי לגזע הברכיוצפלי כדי להבטיח אורך תקין באמצעות אזמל 11 להבים.
6. להפריד את תא המטען הריאתי ואת אבי העורקים עולה עם microscissors, ולשטוף את הלב עם פתרון cardioplegic קר כקרח באמצעות מזרק 3 מ"ל.

4. שחזור הנמען וניטור השתל

1. לאחר הניתוח, תנו לחולדה מספיק זמן להתעורר, מה שקורה בדרך כלל בחלון זמן של 15 דקות, ותנו לה להתאושש על כרית חימום.
   הערה: אין צורך באנטיביוטיקה בשל הסיכון הנמוך מאוד לזיהום וכדי לא לפגוע במודל הניסוי, ולא חלה הגבלה על מזון או מים.
2. לאחר ההשתלה, עקוב אחר תפקוד השתל על ידי מישוש הלב המושתל מדי יום, אך קח בחשבון שלפעמים זה יכול להיות קשה להערכה בגלל כיסוי המעי.
   הערה: אקוקרדיוגרפיה בטנית יכולה למדוד בצורה מדויקת יותר את כדאיות השתל. עבור אקוקרדיוגרפיה, להרדים מעט את החולדה עם איזופלורן (1-2%) בשאיפה דרך חרוט האף, ולמקם אותו על כרית חימום. אקוקרדיוגרפיה מבוצעת בדרך כלל ביום שלאחר הניתוח (POD) 1, POD 7 ו- POD 14. כדי לאפשר הערכה של הדופק וההתכווצות, אפשר לקבל בקלות תצוגות של ציר ארוך וציר קצר (איור 2A, B). כדי להעריך את האנסטומוזות, השתמשו באקוקרדיוגרפיה של דופלר (איור 3A), ואשרו את היווצרות רקמת EFE כפי שהיא נראית כשכבה אנדוקרדיאלית בהירה בתוך חלל החדר השמאלי (איור 3B, C).

תוצאות

כדאיות השתל והכאה
בעבודה זו, כדאיות השתל הוערכה חזותית לאחר שכל המהדקים הוסרו, והותר זמן זילוח משוער של 10-15 דקות עם בטן פתוחה לתצפית על השתל. אותה מערכת ניקוד לאימות אובייקטיבי של כדאיות השתל שימשה להערכה חזותית בסוף הניתוח ולאקוקרדיוגרפיה ב- POD 1, POD 7 ו- POD 14.

0 = אין ת...

Discussion

מודל חייתי זה של השתלה הטרוטופית של לב חולדה תורם יילוד לתוך בטנו של המקבל יוצר את האפשרות לחקור פיברוזיס שמקורו ב- EndMT באמצעות הערכה היסטולוגית מפורטת של רקמות, לזהות מסלולי איתות רגולטוריים ולבחון אפשרויות טיפול. מכיוון ש- EndMT הוא המנגנון הבסיסי למחלות פיברוטיות של הלב, למודל זה יש ערך רב ...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Advanced Ventilator System For Rodents, SAR-1000	CWE, Inc.	12-03100	small animal ventilator
aSMA	Sigma	A2547	Antibody for Immunohistochemistry
Axio observer Z1	Carl Zeiss		inverted microscope
Betadine Solution	Avrio Health L.P.	367618150092
CD31	Invitrogen	MA1-80069	Antibody for Immunohistochemistry
DAPI	Invitrogen	D1306	Antibody for Immunohistochemistry
DemeLON Nylon black 10-0	DemeTECH	NL76100065F0P	10-0 Nylon suture
ETFE IV Catheter, 18G x 2	TERUMO SURFLO	SR-OX1851CA	intubation cannula
Micro Clip 8mm	Roboz Surgical Instrument Co.	RS-6471	microvascular clamps
Nylon black monofilament 11-0	SURGICAL SPECIALTIES CORP	AA0130	11-0 Nylon
O.C.T. Compound	Tissue-Tek	4583	Embedding medium for frozen tissue specimen
p-SMAD2/3	Invitrogen	PA5-110155	Antibody for Immunohistochemistry
Rodent, Tilting WorkStand	Hallowell EMC.	000A3467	oblique shelf for intubation
Silk Sutures, Non-absorbable, 7-0	Braintree Scientific	NC9201231	Silk suture
Slug/Snail	Abcam	ab180714	Antibody for Immunohistochemistry
Undyed Coated Vicryl 5-0 P-3 18"	Ethicon	J493G	5-0 Vicryl
Undyed Coated Vicryl 6-0 P-3 18"	Ethicon	J492G	6-0 Vicryl
VE-Cadherin	Abcam	ab231227	Antibody for Immunohistochemistry
Zeiss OPMI 6-SFR	Zeiss		Surgical microscope
Zen, Blue Edition, 3.6	Zen		inverted microscope software