Un modèle de transplantation cardiaque de rat hétérotopique néonatal pour l’étude de la transition endothéliale à mésenchymateuse

Résumé

Ce travail présente un modèle animal de fibrose induite par la transition endothéliale à mésenchymateuse, tel qu’il est observé dans les malformations cardiaques congénitales telles que la sténose aortique critique ou le syndrome hypoplasique du cœur gauche, ce qui permet une évaluation histologique détaillée des tissus, l’identification des voies de signalisation régulatrices et le test des options de traitement.

Résumé

La fibroélastose endocardique (EFE), définie par l’accumulation de tissu sous-endocardique, a des impacts majeurs sur le développement du ventricule gauche (VG) et empêche les patients atteints de sténose aortique critique congénitale et de syndrome hypoplasique du cœur gauche (HLHS) d’une réparation chirurgicale anatomique biventriculaire curative. La résection chirurgicale est actuellement la seule option thérapeutique disponible, mais l’EFE récidive souvent, parfois avec un schéma de croissance encore plus infiltrant dans le myocarde adjacent.

Afin de mieux comprendre les mécanismes sous-jacents de l’EFE et d’explorer des stratégies thérapeutiques, un modèle animal adapté aux essais précliniques a été développé. Le modèle animal tient compte du fait que l’EFE est une maladie du cœur immature et qu’elle est associée à des troubles de l’écoulement, comme le confirment les observations cliniques. Ainsi, la transplantation cardiaque hétérotopique de cœurs de donneurs de rats nouveau-nés est à la base de ce modèle.

Un cœur de rat nouveau-né est transplanté dans l’abdomen d’un rat adolescent et relié à l’aorte infrarouge et à la veine cave inférieure du receveur. Alors que la perfusion des artères coronaires préserve la viabilité du cœur du donneur, la stagnation du flux dans le VG induit la croissance de l’EFE dans le cœur très immature. Le mécanisme sous-jacent de la formation d’EFE est la transition des cellules endothéliales endocardiques vers les cellules mésenchymateuses (EndMT), qui est un mécanisme bien décrit du développement embryonnaire précoce des valves et des septa, mais aussi la principale cause de fibrose dans l’insuffisance cardiaque. La formation d’EFE peut être observée macroscopiquement dans les jours qui suivent la transplantation. L’échocardiographie transabdominale est utilisée pour surveiller la viabilité du greffon, la contractilité et la perméabilité des anastomoses. Après l’euthanasie, le tissu EFE est prélevé et il présente les mêmes caractéristiques histopathologiques que le tissu EFE humain des patients HLHS.

Ce modèle in vivo permet d’étudier les mécanismes de développement de l’EFE dans le cœur et de tester des options de traitement pour prévenir cette formation de tissu pathologique et offre la possibilité d’un examen plus généralisé de la fibrose induite par EndMT.

Introduction

La fibroélastose endocardique (EFE), définie par l’accumulation de collagène et de fibres élastiques dans le tissu sous-endocardique, se présente sous la forme d’un endocarde épaissi nacré ou opaque ; La croissance de l’EFE est la plus active pendant la période fœtale et la petite enfance¹. Dans une étude d’autopsie, 70 % des cas de syndrome hypoplasique du cœur gauche (HLHS) étaient associés à la présence d’EFE².

Les cellules exprimant des marqueurs pour les fibroblastes constituent la principale population cellulaire de l’EFE, mais ces cellules expriment également de manière concomitante des marqueurs endothéliaux endocardiques, ce qui est une indication de l’origine de ces cellules EFE. Notre groupe a précédemment établi que le mécanisme sous-jacent de la formation d’EFE implique un changement phénotypique des cellules endothéliales endocardiques en fibroblastes par la transition endothéliale-mésenchymateuse (EndMT)³. EndMT peut être détecté à l’aide d’une double coloration immunohistochimique pour les marqueurs endothéliaux tels que le cluster de différenciation (CD) 31 ou l’endothélium vasculaire (VE)-cadhérine (CD144) et les marqueurs fibroblastiques (par exemple, l’actine du muscle lisse alpha, α-SMA). De plus, nous avons également précédemment établi le rôle régulateur de la voie TGF-ß dans ce processus avec l’activation des facteurs de transcription SLUG, SNAIL et TWIST³.

EndMT est un processus physiologique qui se produit au cours du développement cardiaque embryonnaire et conduit à la formation des septa et des valves à partir des coussinets endocardiques⁴, mais il provoque également une fibrose d’organe dans l’insuffisance cardiaque, la fibrose rénale ou le cancer et joue un rôle clé dans l’athérosclérose vasculaire 5,6,7,8. EndMT dans la fibrose cardiaque est principalement régulée par la voie TGF-β, comme nous l’avons rapporté^avec d’autres ^3,9. Divers stimuli ont été décrits pour induire EndMT : inflammation 10, hypoxie 11, altérations mécaniques 12 et troubles de l’écoulement, y compris des altérations du flux sanguin intracavitaire 13, et EndMT peut également être une conséquence d’une maladie génétique ¹⁴.

Ce modèle animal a été développé en utilisant les composants clés du développement de l’EFE cardiaque, qui sont l’immaturité et les altérations du flux sanguin intracavitaire, en particulier la stagnation du flux. L’immaturité a été comblée par l’utilisation de cœurs de rats nouveau-nés comme donneurs, car les rats nouveau-nés sont connus pour être immatures sur le plan du développement immédiatement après la naissance. La transplantation cardiaque hétérotopique offrait la possibilité de restreindre le débit intracavitaire¹⁵.

D’un point de vue clinique, ce modèle animal permet de mieux étudier l’impact d’EndMT sur le ventricule gauche (VG) en croissance. La restriction de croissance imposée au cœur fœtal et néonatal par la formation d’EFE induite par EndMT¹⁶ empêche les patients présentant des obstructions des voies d’écoulement ventriculaire gauche (LVOTO) telles que la sténose aortique critique congénitale et le syndrome hypoplasique du cœur gauche (HLHS) de la réparation chirurgicale biventriculaire anatomique curative¹⁷. Ce modèle animal facilite l’étude des mécanismes cellulaires et de la régulation de la formation tissulaire grâce à EndMT et permet de tester des options de traitement pharmacologique ^3,18.

L’échocardiographie transabdominale est utilisée pour surveiller la viabilité du greffon, la contractilité et la perméabilité des anastomoses. Après l’euthanasie, la formation d’EFE peut être observée macroscopiquement dans les 3 jours suivant la transplantation. Le tissu EFE présente les mêmes caractéristiques histopathologiques que le tissu EFE humain de patients atteints de LVOTO.

Par conséquent, ce modèle animal, bien que développé pour une utilisation pédiatrique dans le spectre de HLHS, peut être appliqué lors de l’étude de diverses maladies basées sur le mécanisme moléculaire d’EndMT.

Protocole

Toutes les procédures sur les animaux ont été effectuées conformément au Conseil national de recherches du Canada. 2011. Guide sur le soin et l’utilisation des animaux de laboratoire : huitième édition. Les protocoles relatifs aux animaux ont été examinés et approuvés par le comité institutionnel de soins et d’utilisation des animaux de l’hôpital pour enfants de Boston.

Avant l’intervention chirurgicale, tous les instruments chirurgicaux sont autoclavés à la vapeur et un tampon de Krebs-Henseleit modifié, avec une concentration finale de 22 mmol/L de KCl, est préparé sous forme de solution cardioplégique (tableau 1). La solution est stérilisée par filtre et stockée à 4 °C pendant la nuit. Un microscope chirurgical (12,5x) est nécessaire pour la procédure de transplantation cardiaque néonatale hétérotopique chez le rat.

1. Préparation et anesthésie

1. Utilisez des rats Lewis mâles/femelles d’un poids d’environ 150 g (5-6 semaines) comme receveurs.
2. Pour commencer, rasez généreusement l’abdomen du rat avec un rasoir.
3. Placez le rat dans une chambre d’isoflurane et allumez le débit d’oxygène à 2 L/min avec 2 % d’isoflurane jusqu’à ce que l’animal soit correctement sédaté mais qu’il respire encore spontanément. Injecter 45 mg/kg de kétamine et 5 mg/kg de xylazine par voie intrapéritonéale (IP), ainsi que 300 U/kg d’héparine. Confirmez l’anesthésie appropriée avec un test de pincement des orteils.
   REMARQUE : Surveillez attentivement la respiration spontanée et la fréquence cardiaque par palpation de la poitrine pour assurer un état hémodynamique stable tout au long du processus.
4. Pour l’intubation, placez le rat sur une étagère oblique (Figure 1), fixez les dents de devant avec une ficelle et placez la tête face au chirurgien.
5. Placez la lumière à l’extérieur du cou sur la zone des cordes vocales, saisissez la langue avec deux doigts et poussez-la légèrement vers le haut et vers la gauche pour offrir une vision optimale pour l’intubation. Utilisez une canule de 18 g et 2 pouces pour un rat de 100 à 150 g. Fixez la sonde intratrachéale avec du ruban adhésif.
   REMARQUE : Les loupes chirurgicales avec un grossissement de 3,5x sont recommandées pour l’intubation.
6. Connectez la canule d’intubation au ventilateur pour petits animaux et ajustez les paramètres selon les instructions du fabricant en fonction de la taille de l’animal.
   REMARQUE : Utilisez les paramètres suivants pour un rat de 150 g : mode volume ; fréquence respiratoire, 55/min ; volume courant, 1,3 mL 50 % I/E, mais cela peut être ajusté de manière appropriée au besoin. Assurez-vous d’un mouvement thoracique bilatéral et égal et administrez l’isoflurane en continu à raison de 0,5 % à 2 % à l’aide du ventilateur.
7. Placez le rat sur un coussin chauffant (pour maintenir une température corporelle normale) en décubitus dorsal, la queue tournée vers le chirurgien. Stérilisez l’abdomen trois fois avec une solution de bétadine et 70% d’éthanol en alternance. Administrez un lubrifiant oculaire et couvrez le rat d’un champ chirurgical stérile, en laissant l’abdomen découvert.

2. Préparation chirurgicale et transplantation hétérotopique du cœur néonatal du donneur chez le rat receveur

1. Effectuez une laparotomie médiane à l’aide d’un scalpel à 15 lames pour l’incision cutanée et utilisez des ciseaux pour ouvrir la paroi abdominale antérieure, suivie d’une exposition contondante de l’aorte abdominale rétropéritonéale et de la veine cave inférieure (IVC) avec des applicateurs à embout de coton.
2. Mobilisez les intestins (y compris le côlon descendant) et placez-les vers le quadrant supérieur droit. Couvrez les intestins avec de la gaze chaude imbibée de sérum physiologique. Utiliser des écarteurs pour assurer une exposition optimale de la CIV et de l’aorte abdominale.
3. Effectuer une dissection contondante de la IVC infrarouge et de l’aorte abdominale vers la bifurcation. Licenciez toutes les artères et veines ramifiées infrarouges (par exemple, l’artère mésentérique inférieure et les artères ganglionnaires) avec une suture en nylon 10-0.
   REMARQUE : Il existe une grande variabilité dans l’anatomie de ces branches latérales. Surveillez visuellement le pouls et la fréquence cardiaque de l’aorte lorsqu’aucune autre surveillance hémodynamique n’est disponible. Évaluez la profondeur appropriée de l’anesthésie toutes les 15 minutes à l’aide d’un test de pincement des orteils. Ajustez la concentration d’isoflurane en conséquence.
4. Une fois que le cœur du donneur a été prélevé sur un rat nouveau-né, délivrer le cœur excisé dans des conditions stériles dans un bassin chirurgical contenant un tampon de Krebs-Henseleit au champ opératoire. Irriguer le cœur du donneur par intermittence avec une solution cardioplégique glacée.
   REMARQUE : Lorsqu’un deuxième chirurgien est disponible, le cœur doit être préparé en même temps, car un deuxième chirurgien réduit le temps total d’anesthésie de l’animal receveur et le temps d’ischémie du cœur du donneur. Lorsqu’un deuxième chirurgien n’est pas disponible, couvrez l’abdomen du receveur avec du sérum physiologique chaud et surveillez l’animal pendant la procédure de prélèvement.
5. Appliquer quatre petites pinces vasculaires atraumatiques sur les segments distaux et proximaux de l’aorte infrarouge et de la CIV. Si nécessaire, occlure temporairement un vaisseau rénal défavorable avec une suture en soie 7-0 et relâchez la suture après l’intervention. Placez une suture en nylon 10-0 verticalement sur la paroi antérieure de l’aorte pour faciliter l’aortomie. Effectuez une aortotomie avec deux petites incisions horizontales (en forme de coin) avec des microciseaux en tirant légèrement sur la suture.
   REMARQUE : Pour éliminer les caillots sanguins, il est recommandé de rincer la lumière aortique avec une solution saline héparinisée.
6. Placez le cœur du donneur sur le côté gauche (du point de vue de l’animal) de l’aorte et fixez l’aorte infrarouge du receveur et l’aorte ascendante du donneur côte à côte aux positions 12 heures et 6 heures de l’aortotomie avec des sutures. Continuez avec les troisième et quatrième sutures aux positions 3 heures et 9 heures, en retournant doucement le cœur sur le côté droit de l’aorte après la troisième suture. Complétez l’anastomose artérielle en ajoutant une ou deux sutures à chaque espace intercalaire.
   REMARQUE : Il faut prendre soin d’éviter de toucher l’aorte ascendante du donneur ou l’aorte abdominale du receveur avec des forceps lors de la création de l’anastomose afin d’éviter d’endommager les tissus.
7. Faites pivoter le rat dans le sens inverse des aiguilles d’une montre, la tête tournée vers la main gauche du chirurgien. Déplacez l’aorte du donneur vers le côté gauche de l’aorte abdominale pour permettre une vision optimale sur la CIV.
8. Réaliser une veinotomie sur la CIV, légèrement proximale de l’anastomose aortique, à l’aide d’une lame 11 pour ponction et de microciseaux pour un ajustement adéquat de la taille en fonction du diamètre du tronc pulmonaire du donneur. Encore une fois, rincez la lumière intracave avec une solution saline héparinisée.
9. Commencez par l’anastomose veineuse entre la CIV du receveur et le tronc pulmonaire du donneur, ce qui est mieux réalisé en plaçant des sutures en nylon 11-0 interrompues sur la paroi arrière du vaisseau, en commençant par les positions 12 heures et 6 heures (liées à la IVC), puis placez une suture continue en nylon 11-0 sur la paroi avant (de 6 heures à 12 heures).
10. Recouvrez les anastomoses avec de petites bandes d’éponge de gélatine résorbable et retirez les pinces microvasculaires en commençant distalement. À l’aide d’un applicateur coton-tige, comprimer légèrement les éponges afin d’obtenir une hémostase optimale.
11. Observez le remplissage des vaisseaux coronaires du greffon au moment de la libération des pinces microvasculaires distales et assurez-vous que le cœur du donneur commence à battre immédiatement lorsque la pince proximale est relâchée.
    REMARQUE : La viabilité du greffon peut être notée de 0 à 4 en peropératoire selon un score de Stanford modifié^{de 19} pour confirmer une fonction adéquate du greffon.
12. Replacez les intestins dans l’abdomen en veillant à ne pas déformer l’anastomose artérielle et veineuse.
13. Administrer du méloxicam (1 mg/kg) et de l’ethiqa XR (0,65 mg/kg) par voie sous-cutanée pendant que l’animal est complètement anesthésié pour vérifier l’analgésie postopératoire. Ensuite, fermez la paroi abdominale avec une suture vicryl résorbable 5-0 continue avant de fermer la peau avec une suture vicryl résorbable 6-0 par voie intracutanée.
    REMARQUE : Des conseils concernant les défaillances courantes et le dépannage sont présentés dans le Tableau 2.

3. Prélèvement du cœur du donneur néonatal

1. Placez le rat donneur nouveau-né dans une chambre insufflée avec de l’isoflurane (2%) pour la sédation. Administrer de la kétamine (75 mg/kg) et de la xylazine (5 mg/kg), ainsi que de l’héparine (300 U/kg) par voie intrapéritonéale.
2. Confirmez la profondeur de l’anesthésie en pinçant les orteils et placez le rat en décubitus dorsal avec la queue tournée vers vous. Stérilisez l’ensemble du thorax et de la paroi abdominale avec de la bétadine et de l’éthanol à 70 % trois fois en alternance. Recouvrez le rat d’un champ chirurgical stérile.
3. À l’aide d’un microscope chirurgical 12,5x, retirez toute la paroi thoracique antérieure en commençant par une incision horizontale à l’aide d’un scalpel à 15 lames au niveau du xyphoïde, suivie d’incisions verticales latéralement jusqu’aux aisselles des deux côtés avec des ciseaux. La paroi thoracique antérieure peut ensuite être enlevée en continuant avec une autre incision horizontale juste sous le cou.
4. Disséquez l’IVC, les veines caves supérieures droite et gauche et les vaisseaux pulmonaires avec des ciseaux, puis encerclez et ligaturez tous les vaisseaux avec une suture en soie 7-0. Administrer 3 mL de solution de Krebs-Henseleit modifiée glacée et riche en potassium dans l’oreillette droite en ponctionnant la CIV avec une aiguille de 30 G et en poussant légèrement le diaphragme vers le bas avec une pince.
5. Coupez le CIV, les CVS, les vaisseaux pulmonaires et l’aorte avec des ciseaux. Transectez les artères pulmonaires aussi loin que possible et l’aorte distale au tronc brachiocéphale pour assurer la bonne longueur à l’aide d’un scalpel à 11 lames.
6. Séparez le tronc pulmonaire et l’aorte ascendante à l’aide de microciseaux et rincez le cœur avec une solution cardioplégique glacée à l’aide d’une seringue de 3 ml.

4. Récupération du receveur et suivi du greffon

1. Après la chirurgie, donnez au rat suffisamment de temps pour se réveiller, ce qui se produit généralement dans une fenêtre de temps de 15 minutes, et laissez-le récupérer sur un coussin chauffant.
   REMARQUE : Aucun antibiotique n’est nécessaire en raison du très faible risque d’infection et afin de ne pas compromettre le modèle expérimental, et aucune restriction à la nourriture ou à l’eau n’est appliquée.
2. Après la transplantation, surveillez quotidiennement la fonction du greffon par palpation du cœur transplanté, mais considérez que cela peut parfois être difficile à évaluer en raison de la superposition intestinale.
   REMARQUE : L’échocardiographie abdominale permet de mesurer plus précisément la viabilité du greffon. Pour l’échocardiographie, sédatif légèrement le rat avec de l’isoflurane (1 à 2 %) inhalé par un cône nasal et placez-le sur un coussin chauffant. L’échocardiographie est généralement réalisée le jour postopératoire (POD) 1, POD 7 et POD 14. Pour permettre l’évaluation de la fréquence cardiaque et de la contractilité, on peut facilement obtenir des vues sur les grands axes et les petits axes (Figure 2A, B). Pour évaluer les anastomoses, utiliser l’échocardiographie Doppler (Figure 3A) et confirmer la formation de tissu EFE sous la forme d’une couche endocardique écho-brillante dans la cavité ventriculaire gauche (Figure 3B, C).

Résultats

Viabilité et battement des greffons
Dans ce travail, la viabilité du greffon a été évaluée visuellement après que toutes les pinces aient été retirées, et un temps de reperfusion approximatif de 10 à 15 minutes a été autorisé avec un abdomen ouvert pour l’observation du greffon. Le même système de notation pour vérifier objectivement la viabilité du greffon a été utilisé pour l’évaluation visuelle à la fin de la chirurgie et pour l’échocardiographie sur les POD 1, POD 7 e...

Discussion

Ce modèle animal de transplantation hétérotopique d’un cœur de rat donneur néonatal dans l’abdomen du receveur permet d’étudier la fibrose dérivée d’EndMT grâce à une évaluation histologique détaillée des tissus, d’identifier les voies de signalisation régulatrices et de tester les options de traitement. Étant donné que EndMT est le mécanisme sous-jacent des maladies fibrotiques du cœur, ce modèle a une grande valeur dans le domaine de la chirurgie cardiaque pédiatrique et au-delà. Dans ce ...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Advanced Ventilator System For Rodents, SAR-1000	CWE, Inc.	12-03100	small animal ventilator
aSMA	Sigma	A2547	Antibody for Immunohistochemistry
Axio observer Z1	Carl Zeiss		inverted microscope
Betadine Solution	Avrio Health L.P.	367618150092
CD31	Invitrogen	MA1-80069	Antibody for Immunohistochemistry
DAPI	Invitrogen	D1306	Antibody for Immunohistochemistry
DemeLON Nylon black 10-0	DemeTECH	NL76100065F0P	10-0 Nylon suture
ETFE IV Catheter, 18G x 2	TERUMO SURFLO	SR-OX1851CA	intubation cannula
Micro Clip 8mm	Roboz Surgical Instrument Co.	RS-6471	microvascular clamps
Nylon black monofilament 11-0	SURGICAL SPECIALTIES CORP	AA0130	11-0 Nylon
O.C.T. Compound	Tissue-Tek	4583	Embedding medium for frozen tissue specimen
p-SMAD2/3	Invitrogen	PA5-110155	Antibody for Immunohistochemistry
Rodent, Tilting WorkStand	Hallowell EMC.	000A3467	oblique shelf for intubation
Silk Sutures, Non-absorbable, 7-0	Braintree Scientific	NC9201231	Silk suture
Slug/Snail	Abcam	ab180714	Antibody for Immunohistochemistry
Undyed Coated Vicryl 5-0 P-3 18"	Ethicon	J493G	5-0 Vicryl
Undyed Coated Vicryl 6-0 P-3 18"	Ethicon	J492G	6-0 Vicryl
VE-Cadherin	Abcam	ab231227	Antibody for Immunohistochemistry
Zeiss OPMI 6-SFR	Zeiss		Surgical microscope
Zen, Blue Edition, 3.6	Zen		inverted microscope software