Endotelyal-mezenkimal geçiş çalışması için yenidoğan heterotopik sıçan kalp nakli modeli

Özet

Bu çalışma, kritik aort darlığı veya hipoplastik sol kalp sendromu gibi konjenital kardiyak defektlerde görüldüğü gibi, endotelyal-mezenkimal geçişe bağlı fibrozun bir hayvan modelini sunar, bu da ayrıntılı histolojik doku değerlendirmesine, düzenleyici sinyal yollarının tanımlanmasına ve tedavi seçeneklerinin test edilmesine olanak tanır.

Özet

Subendokardiyal doku birikimi ile tanımlanan endokardiyal fibroelastoz (EFE), sol ventrikül (LV) gelişimi üzerinde önemli etkilere sahiptir ve konjenital kritik aort darlığı ve hipoplastik sol kalp sendromu (HLHS) olan hastaların küratif anatomik biventriküler cerrahi onarımını engeller. Cerrahi rezeksiyon şu anda mevcut tek terapötik seçenektir, ancak EFE sıklıkla tekrarlar, bazen komşu miyokarda daha da infiltratif bir büyüme paterni ile.

EFE'nin altında yatan mekanizmaları daha iyi anlamak ve terapötik stratejileri araştırmak için klinik öncesi testlere uygun bir hayvan modeli geliştirilmiştir. Hayvan modeli, EFE'nin olgunlaşmamış kalbin bir hastalığı olduğunu ve klinik gözlemlerle desteklendiği gibi akış bozuklukları ile ilişkili olduğunu dikkate alır. Bu nedenle, yenidoğan sıçan donör kalplerinin heterotopik kalp nakli bu modelin temelidir.

Bir yenidoğan sıçan kalbi, bir ergen sıçanın karnına nakledilir ve alıcının infrarenal aortuna ve inferior vena kavasına bağlanır. Koroner arterlerin perfüzyonu donör kalbin canlılığını korurken, LV içindeki akış durgunluğu çok olgunlaşmamış kalpte EFE büyümesini indükler. EFE oluşumunun altında yatan mekanizma, endokardiyal endotel hücrelerinin, kapakların ve septanın erken embriyonik gelişiminin iyi tanımlanmış bir mekanizması olan ve aynı zamanda kalp yetmezliğinde fibrozisin önde gelen nedeni olan mezenkimal hücrelere (EndMT) geçişidir. EFE oluşumu transplantasyondan sonraki günler içinde makroskopik olarak gözlenebilir. Transabdominal ekokardiyografi, greft canlılığını, kontraktilitesini ve anastomozların açıklığını izlemek için kullanılır. Ötenaziyi takiben, EFE dokusu alınır ve HLHS hastalarından alınan insan EFE dokusu ile aynı histopatolojik özellikleri gösterir.

Bu in vivo model, kalpte EFE gelişim mekanizmalarının incelenmesine ve bu patolojik doku oluşumunu önlemek için tedavi seçeneklerinin test edilmesine olanak tanır ve EndMT ile indüklenen fibrozisin daha genel bir incelemesi için fırsat sağlar.

Giriş

Subendokardiyal dokuda kollajen ve elastik liflerin birikmesiyle tanımlanan endokardiyal fibroelastoz (EFE), inci veya opak kalınlaşmış bir endokard olarak ortaya çıkar; EFE, fetal dönemde ve erken bebeklik döneminde en aktif büyümeye uğrar¹. Bir otopsi çalışmasında, hipoplastik sol kalp sendromu (HLHS) olan vakaların %70'i EFE² varlığı ile ilişkilendirilmiştir.

Fibroblastlar için belirteçleri eksprese eden hücreler, EFE'deki ana hücre popülasyonudur, ancak bu hücreler aynı zamanda bu EFE hücrelerinin kökeninin bir göstergesi olan endokardiyal endotelyal belirteçleri de eksprese eder. Grubumuz daha önce EFE oluşumunun altında yatan mekanizmanın, endotelyal-mezenkimal geçiş (EndMT) yoluyla endokardiyal endotel hücrelerinin fibroblastlara fenotipik bir değişimini içerdiğini tespit ^etmiştir3. EndMT, farklılaşma kümesi (CD) 31 veya vasküler endotelyal (VE)-kaderin (CD144) ve fibroblast belirteçleri (örneğin, alfa-düz kas aktini, α-SMA) gibi endotelyal belirteçler için immünohistokimyasal çift boyama kullanılarak tespit edilebilir. Ayrıca, daha önce SLUG, SNAIL ve TWIST³ transkripsiyon faktörlerinin aktivasyonu ile TGF-ß yolunun bu süreçteki düzenleyici rolünü de belirlemiştik.

EndMT, embriyonik kardiyak gelişim sırasında meydana gelen ve endokardiyal yastıklardan^septa ve kapakçıkların oluşumuna yol açan fizyolojik bir süreçtir 4, ancak aynı zamanda kalp yetmezliği, böbrek fibrozu veya kanserde organ fibrozuna neden olur ve vasküler aterosklerozda anahtar rol oynar 5,6,7,8. Kardiyak fibrozda EndMT, biz ve diğerlerinin^bildirdiği gibi, esas olarak TGF-β yolu ile düzenlenir ^3,9. EndMT'yi indüklemek için çeşitli uyaranlar tanımlanmıştır: inflamasyon¹⁰, hipoksi 11, mekanik değişiklikler¹² ve intrakaviter kan akışındaki^{değişiklikler 13} dahil olmak üzere akış bozuklukları ve EndMT ayrıca genetik bir hastalığın¹⁴ sonucu olabilir.

Bu hayvan modeli, olgunlaşmamışlık ve intrakaviter kan akışındaki değişiklikler, özellikle akış durgunluğu olan kardiyak EFE gelişiminin temel bileşenleri kullanılarak geliştirilmiştir. Yenidoğan sıçanlarının doğumdan hemen sonra gelişimsel olarak olgunlaşmamış oldukları bilindiğinden, olgunlaşmamışlık yenidoğan sıçan kalplerinin donör olarak kullanılmasıyla yerine getirildi. Heterotopik kalp nakli, intrakaviter akım kısıtlaması^{sağlanmasını önerdi 15}.

Klinik açıdan bakıldığında, bu hayvan modeli, EndMT'nin büyüyen sol ventrikül (LV) üzerindeki etkisinin daha iyi araştırılmasına olanak tanır. EndMT ile indüklenen EFE oluşumu¹⁶ yoluyla fetal ve neonatal kalbe uygulanan büyüme kısıtlaması, konjenital kritik aort darlığı ve hipoplastik sol kalp sendromu (HLHS) gibi sol ventrikül çıkış yolu tıkanıklıkları (LVOTO) olan hastaların küratif anatomik biventriküler cerrahi onarımdan¹⁷ etkilenmesini engellemektedir. Bu hayvan modeli, EndMT aracılığıyla hücresel mekanizmaların incelenmesini ve doku oluşumunun düzenlenmesini kolaylaştırır ve farmakolojik tedavi seçeneklerinin test edilmesine olanak tanır ^3,18.

Transabdominal ekokardiyografi, greft canlılığını, kontraktilitesini ve anastomozların açıklığını izlemek için kullanılır. Ötenazi sonrası 3 gün içinde makroskopik olarak EFE oluşumu gözlenebilir. EFE dokusu, LVOTO'lu hastalardan alınan insan EFE dokusu ile aynı histopatolojik özellikleri gösterir.

Bu nedenle, bu hayvan modeli, HLHS spektrumunda pediatrik kullanım için geliştirilmiş olsa da, EndMT'nin moleküler mekanizmasına dayalı çeşitli hastalıklar incelenirken uygulanabilir.

Protokol

Tüm hayvan prosedürleri Ulusal Araştırma Konseyi'ne uygun olarak yürütülmüştür. 2011. Laboratuvar Hayvanlarının Bakımı ve Kullanımı Kılavuzu: Sekizinci Baskı. Hayvan protokolleri, Boston Çocuk Hastanesi'ndeki Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi tarafından gözden geçirildi ve onaylandı.

Ameliyattan önce, tüm cerrahi aletler buharla otoklavlanır ve nihai konsantrasyonu 22 mmol / L KCl olan modifiye Krebs-Henseleit tamponu kardiyoplejik bir çözelti olarak hazırlanır (Tablo 1). Çözelti filtre ile sterilize edilir ve gece boyunca 4 °C'de saklanır. Heterotopik neonatal sıçan kalp nakli işlemi için cerrahi mikroskop (12.5x) gereklidir.

1. Hazırlık ve anestezi

1. Alıcı olarak yaklaşık 150 g (5-6 haftalık) ağırlığa sahip erkek / dişi Lewis sıçanlarını kullanın.
2. Başlamak için, farenin karnını bir usturayla cömertçe tıraş edin.
3. Sıçanı bir izofluran odasına yerleştirin ve hayvan uygun şekilde sakinleşene ancak yine de kendiliğinden nefes alana kadar% 2 izofluran ile 2 L / dk'da oksijen akışını açın. İntraperitoneal (IP) 45 mg / kg ketamin ve 5 mg / kg ksilazin ve ayrıca 300 U / kg heparin enjekte edin. Ayak parmağı sıkışma testi ile uygun anesteziyi onaylayın.
   NOT: Tüm süreç boyunca stabil bir hemodinamik durum sağlamak için göğsün palpasyonu yoluyla spontan solunum ve kalp atış hızını dikkatlice izleyin.
4. Entübasyon için, fareyi eğik bir rafa yerleştirin (Şekil 1), ön dişleri bir ip ile sabitleyin ve başı cerraha bakacak şekilde yerleştirin.
5. Entübasyon için en uygun görüşü sağlamak için boynun dışındaki ışığı ses tellerinin bulunduğu bölgeye yerleştirin, dili iki parmağınızla tutun ve hafifçe yukarı ve sola doğru itin. 100-150 g sıçan için 18 G, 2 in kanül kullanın. İntratrakeal tüpü bantla sabitleyin.
   NOT: Entübasyon için 3.5x büyütmeli cerrahi loblar önerilir.
6. Entübasyon kanülünü küçük hayvan ventilatörüne bağlayın ve hayvan boyutuna göre üreticinin talimatlarına göre ayarları yapın.
   NOT: 150 g'lık bir sıçan için aşağıdaki ayarları kullanın: ses modu; solunum hızı, 55 / dak; gelgit hacmi, 1.3 mL %50 I/E oranı, ancak bu gerektiğinde uygun şekilde ayarlanabilir. Uygun bilateral ve eşit göğüs hareketini sağlayın ve ventilatörden sürekli% 0.5 -% 2 oranında izofluran uygulayın.
7. Fareyi, kuyruğu cerraha bakacak şekilde sırtüstü pozisyonda bir ısıtma yastığına (normal vücut ısısını korumak için) yerleştirin. Karnı üç kez betadin çözeltisi ve% 70 etanol ile dönüşümlü olarak sterilize edin. Göz yağını uygulayın ve fareyi steril bir cerrahi örtü ile örtün ve karnı açıkta bırakın.

2. Alıcı sıçanda yenidoğan donör kalbinin cerrahi hazırlığı ve heterotopik transplantasyonu

1. Deri insizyonu için 15 bıçaklı bir neşter kullanarak orta hat laparotomi yapın ve karın ön duvarını açmak için makas kullanın, ardından retroperitoneal abdominal aort ve inferior vena kava'nın (IVC) pamuk uçlu aplikatörlerle künt olarak ortaya çıkarılması.
2. Bağırsakları (inen kolon dahil) harekete geçirin ve sağ üst kadrana doğru yerleştirin. Bağırsakları ılık tuzlu suya batırılmış gazlı bezle örtün. IVC ve abdominal aortun optimum maruziyetini sağlamak için ekartörler kullanın.
3. İnfrarenal IVC ve abdominal aortun bifurkasyona doğru künt diseksiyonunu yapın. Tüm infrarenal dallanan arterleri ve venleri (örn., inferior mezenterik arter ve lenf nodu arterleri) 10-0 naylon sütür ile bağlayın.
   NOT: Bu yan dalların anatomisinde büyük değişkenlik vardır. Başka bir hemodinamik izleme olmadığında aortun nabzını ve kalp atış hızını görsel olarak izleyin. Her 15 dakikada bir ayak parmağı sıkışma testi ile uygun anestezi derinliğini değerlendirin. İzofluran konsantrasyonunu buna göre ayarlayın.
4. Donör kalbi yenidoğan bir sıçandan alındıktan sonra, eksize edilen kalbi steril koşullarda Krebs-Henseleit tamponu içeren bir cerrahi havzada cerrahi alana teslim edin. Donör kalbi aralıklı olarak buz gibi kardiyoplejik solüsyonla sulayın.
   NOT: İkinci bir cerrah mevcut olduğunda, ikinci bir cerrah alıcı hayvanın toplam anestezi süresini ve donör kalbin iskemi süresini azalttığı için kalp aynı anda hazırlanmalıdır. İkinci bir cerrah bulunmadığında, alıcının karnını ılık tuzlu su ile örtün ve hasat prosedürü sırasında hayvanı izleyin.
5. İnfrarenal aort ve IVC'nin distal ve proksimal segmentlerine dört küçük atravmatik vasküler klemp uygulayın. Gerekirse, elverişsiz bir böbrek damarını 7-0 ipek sütür ile geçici olarak kapatın ve işlemden sonra dikişi serbest bırakın. Aortotomiyi kolaylaştırmak için aortun ön duvarına dikey olarak 10-0 naylon sütür yerleştirin. Sütürü hafifçe yukarı çekerek mikromakasla iki küçük yatay kesikle (kama şeklinde) bir aortotomi yapın.
   NOT: Herhangi bir kan pıhtısını gidermek için aort lümeninin heparinize salin ile yıkanması önerilir.
6. Donör kalbini aortun sol tarafına (hayvanın bakış açısından) yerleştirin ve alıcının infrarenal aortunu ve vericinin yükselen aortunu aortotominin saat 12 ve saat 6 pozisyonlarında uçtan uca dikişlerle sabitleyin. Üçüncü ve dördüncü dikişlere saat 3 ve 9 pozisyonlarında devam edin, üçüncü dikişten sonra kalbi nazikçe aortun sağ tarafına çevirin. Her ara boşluğa bir ila iki sütür ekleyerek arteriyel anastomozu tamamlayın.
   NOT: Doku hasarını önlemek için anastomoz oluştururken donörün çıkan aortuna veya alıcının abdominal aortuna forseps ile dokunmaktan kaçınmaya özen gösterilmelidir.
7. Fareyi, başı cerrahın sol eline bakacak şekilde saat yönünün tersine çevirin. IVC'de en iyi görüşü sağlamak için donörün aortunu abdominal aortun sol tarafına taşıyın.
8. Vericinin pulmoner gövdesinin çapına göre yeterli boyut ayarı için ponksiyon için bir 11 bıçak ve mikromakas kullanarak, aort anastomozuna hafif proksimalde IVC üzerinde bir venotomi gerçekleştirin. Yine, intrakaval lümeni heparinize salin ile yıkayın.
9. Alıcının IVC'si ile donörün pulmoner gövdesi arasındaki venöz anastomoz ile başlayın, bu en iyi şekilde saat 12 ve saat 6 konumlarından başlayarak damarın arka duvarına kesintili 11-0 naylon sütürler yerleştirerek elde edilir (IVC ile ilgili) ve ardından ön duvara (saat 6'dan saat 12'ye doğru) sürekli bir 11-0 naylon sütür yerleştirin.
10. Anastomozları emilebilir bir jelatin süngerin küçük şeritleri ile örtün ve distal olarak başlayan mikrovasküler kelepçeleri çıkarın. Optimal hemostaz elde etmek için süngerleri hafifçe sıkıştırmak için pamuklu uçlu bir aplikatör kullanın.
11. Distal mikrovasküler klemplerin serbest bırakılması sırasında greftin koroner damarlarının dolduğunu gözlemleyin ve proksimal klemp serbest bırakıldığında donör kalbin hemen atmaya başladığından emin olun.
    NOT: Greftin canlılığı, yeterli greft fonksiyonunu doğrulamak için modifiye edilmiş bir Stanford skoru^19'a göre intraoperatif olarak 0'dan 4'e kadar puanlanabilir.
12. Arteriyel ve venöz anastomozun bozulmamasına dikkat ederek bağırsakları tekrar karın içine yerleştirin.
13. Postoperatif analjeziyi tespit etmek için hayvan tamamen uyuşturulurken meloksikam (1 mg / kg) ve ethiqa XR (0.65 mg / kg) subkutan olarak uygulayın. Daha sonra karın duvarını sürekli 5-0 emilebilir bir vicryl sütür ile kapatın ve cildi intrakutan olarak 6-0 emilebilir bir vicryl sütür ile kapatın.
    NOT: Yaygın hatalar ve sorun giderme ile ilgili yönergeler Tablo 2'de sunulmuştur.

3. Yenidoğan donör kalbinin toplanması

1. Yenidoğan donör sıçanını sedasyon için izofluran (% 2) ile şişirilmiş bir odaya yerleştirin. İntraperitoneal olarak ketamin (75 mg / kg) ve ksilazin (5 mg / kg) ve heparin (300 U / kg) uygulayın.
2. Anestezi derinliğini ayak parmağınızı sıkıştırarak onaylayın ve fareyi kuyruğu size bakacak şekilde sırtüstü pozisyona getirin. Tüm göğüs ve karın duvarını alternatif olarak üç kez betadin ve% 70 etanol ile sterilize edin. Fareyi steril bir cerrahi örtü ile örtün.
3. 12.5x cerrahi mikroskop kullanarak, ksifoidde 15 bıçaklı bir neşter kullanarak yatay bir kesi ile başlayarak tüm ön torasik duvarı çıkarın, ardından makasla her iki taraftaki koltuk altına kadar yanal olarak dikey kesiler yapın. Ön göğüs duvarı daha sonra boynun hemen altında başka bir yatay kesi ile devam edilerek çıkarılabilir.
4. IVC, sağ ve sol superior vena kava ve pulmoner damarları makasla inceleyin ve ardından tüm damarları 7-0 ipek sütür ile çevreleyin ve bağlayın. IVC'yi 30 G'lik bir iğne ile delerek ve diyaframı forseps ile hafifçe aşağı iterek sağ atriyuma 3 mL buz gibi, yüksek potasyumlu modifiye Krebs-Henseleit solüsyonu uygulayın.
5. IVC'yi, SVC'leri, pulmoner damarları ve aortu makasla kesin. 11 bıçaklı bir neşter kullanarak uygun uzunluğu sağlamak için pulmoner arterleri mümkün olduğunca ve aortu brakiyosefalik gövdenin distalini kesin.
6. Pulmoner gövdeyi ve çıkan aortu mikromakasla ayırın ve 3 mL'lik bir şırınga kullanarak kalbi buz gibi soğuk kardiyoplejik solüsyonla yıkayın.

4. Alıcının iyileşmesi ve greft izleme

1. Ameliyattan sonra, fareye uyanması için yeterli zaman verin, bu genellikle 15 dakikalık bir zaman aralığında gerçekleşir ve bir ısıtma yastığı üzerinde iyileşmesine izin verin.
   NOT: Enfeksiyon riskinin çok düşük olması ve deney modelinden ödün vermemesi için antibiyotiğe gerek yoktur ve yiyecek veya su kısıtlaması uygulanmaz.
2. Transplantasyondan sonra, nakledilen kalbin günlük palpasyonuyla greft fonksiyonunu izleyin, ancak bağırsak kaplaması nedeniyle bunun bazen değerlendirilmesinin zor olabileceğini göz önünde bulundurun.
   NOT: Abdominal ekokardiyografi greft canlılığını daha doğru bir şekilde ölçebilir. Ekokardiyografi için, sıçanı bir burun konisinden solunan izofluran (% 1-2) ile hafifçe sakinleştirin ve bir ısıtma yastığı üzerine yerleştirin. Ekokardiyografi genellikle postoperatif gün (POD) 1, POD 7 ve POD 14'te yapılır. Kalp atış hızı ve kasılmanın değerlendirilmesine izin vermek için, uzun eksen ve kısa eksen görünümleri kolayca elde edilebilir (Şekil 2A, B). Anastomozları değerlendirmek için Doppler ekokardiyografi (Şekil 3A) kullanın ve sol ventrikül boşluğu içinde eko-parlak endokardiyal tabaka olarak görülen EFE dokusunun oluşumunu doğrulayın (Şekil 3B, C).

Sonuçlar

Greft canlılığı ve dayak
Bu çalışmada, tüm klempler çıkarıldıktan sonra greft canlılığı görsel olarak değerlendirildi ve greftin gözlemlenmesi için açık bir karın ile yaklaşık 10-15 dakikalık bir reperfüzyon süresine izin verildi. Greft canlılığını objektif olarak doğrulamak için aynı skorlama sistemi ameliyat sonunda görsel değerlendirme ve POD 1, POD 7 ve POD 14'te ekokardiyografi için kullanıldı.

0 = organ fonksiyonu yok; 1 = (din...

Tartışmalar

Yenidoğan donör sıçan kalbinin alıcının karnına heterotopik transplantasyonuna ilişkin bu hayvan modeli, ayrıntılı histolojik doku değerlendirmesi yoluyla EndMT kaynaklı fibrozu inceleme, düzenleyici sinyal yollarını belirleme ve tedavi seçeneklerini test etme imkanı yaratır. EndMT, kalbin fibrotik hastalıklarının altında yatan mekanizma olduğundan, bu model pediatrik kalp cerrahisi alanında ve ötesinde büyük değere sahiptir. Bu modelde, birçok faktör prosedürün sonucunu olumsuz yönde e...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Advanced Ventilator System For Rodents, SAR-1000	CWE, Inc.	12-03100	small animal ventilator
aSMA	Sigma	A2547	Antibody for Immunohistochemistry
Axio observer Z1	Carl Zeiss		inverted microscope
Betadine Solution	Avrio Health L.P.	367618150092
CD31	Invitrogen	MA1-80069	Antibody for Immunohistochemistry
DAPI	Invitrogen	D1306	Antibody for Immunohistochemistry
DemeLON Nylon black 10-0	DemeTECH	NL76100065F0P	10-0 Nylon suture
ETFE IV Catheter, 18G x 2	TERUMO SURFLO	SR-OX1851CA	intubation cannula
Micro Clip 8mm	Roboz Surgical Instrument Co.	RS-6471	microvascular clamps
Nylon black monofilament 11-0	SURGICAL SPECIALTIES CORP	AA0130	11-0 Nylon
O.C.T. Compound	Tissue-Tek	4583	Embedding medium for frozen tissue specimen
p-SMAD2/3	Invitrogen	PA5-110155	Antibody for Immunohistochemistry
Rodent, Tilting WorkStand	Hallowell EMC.	000A3467	oblique shelf for intubation
Silk Sutures, Non-absorbable, 7-0	Braintree Scientific	NC9201231	Silk suture
Slug/Snail	Abcam	ab180714	Antibody for Immunohistochemistry
Undyed Coated Vicryl 5-0 P-3 18"	Ethicon	J493G	5-0 Vicryl
Undyed Coated Vicryl 6-0 P-3 18"	Ethicon	J492G	6-0 Vicryl
VE-Cadherin	Abcam	ab231227	Antibody for Immunohistochemistry
Zeiss OPMI 6-SFR	Zeiss		Surgical microscope
Zen, Blue Edition, 3.6	Zen		inverted microscope software