Modelo de Transplante Cardíaco Heterotópico Neonatal em Rato para Estudo da Transição Endotelial-Mesenquimal

Resumo

Este trabalho apresenta um modelo animal de fibrose induzida pela transição endotelial-mesenquimal, como visto em defeitos cardíacos congênitos, como estenose aórtica crítica ou síndrome do coração esquerdo hipoplásico, que permite a avaliação histológica detalhada do tecido, a identificação de vias de sinalização regulatórias e o teste de opções de tratamento.

Resumo

A fibroelastose endocárdica (EFE), definida pelo acúmulo de tecido subendocárdico, tem grande impacto no desenvolvimento do ventrículo esquerdo (VE) e impede que pacientes com estenose aórtica crítica congênita e síndrome do coração esquerdo hipoplásico (SHCE) façam reparo cirúrgico biventricular anatômico curativo. A ressecção cirúrgica é atualmente a única opção terapêutica disponível, mas a EFE frequentemente se repete, às vezes com um padrão de crescimento ainda mais infiltrativo no miocárdio adjacente.

Para entender melhor os mecanismos subjacentes da EFE e explorar estratégias terapêuticas, um modelo animal adequado para testes pré-clínicos foi desenvolvido. O modelo animal leva em consideração que a EFE é uma doença do coração imaturo e está associada a distúrbios de fluxo, como sustentado por observações clínicas. Assim, o transplante cardíaco heterotópico de corações de ratos doados neonatais é a base para esse modelo.

Um coração de rato neonatal é transplantado para o abdômen de um rato adolescente e conectado à aorta infrarrenal e à veia cava inferior do receptor. Enquanto a perfusão das artérias coronárias preserva a viabilidade do coração doador, a estagnação do fluxo dentro do VE induz o crescimento da EFE no coração muito imaturo. O mecanismo subjacente da formação do EFE é a transição das células endoteliais endocárdicas para as células mesenquimais (EndMT), que é um mecanismo bem descrito de desenvolvimento embrionário precoce das valvas e septos, mas também a principal causa de fibrose na insuficiência cardíaca. A formação de EFE pode ser observada macroscopicamente dentro de dias após o transplante. A ecocardiografia transabdominal é usada para monitorar a viabilidade do enxerto, a contratilidade e a patência das anastomoses. Após a eutanásia, o tecido da EFE é retirado, e apresenta as mesmas características histopatológicas que o tecido da EFE humana de pacientes com SHCE.

Este modelo in vivo permite estudar os mecanismos de desenvolvimento de EFE no coração e testar opções de tratamento para prevenir a formação desse tecido patológico e fornece a oportunidade para um exame mais generalizado da fibrose induzida por EndMT.

Introdução

A fibroelastose endocárdica (EFE), definida pelo acúmulo de fibras colágenas e elásticas no tecido subendocárdico, apresenta-se como um endocárdio espessado perolado ou opaco; A EFE sofre crescimento mais ativo durante o período fetal e início da infância¹. Em um estudo de autópsia, 70% dos casos com síndrome de hipoplasia do coração esquerdo (SHCE) estavam associados à presença de EFE².

As células que expressam marcadores para fibroblastos são a principal população celular na EFE, mas essas células também expressam concomitantemente marcadores endoteliais endocárdicos, o que é uma indicação da origem dessas células EFE. Nosso grupo estabeleceu anteriormente que o mecanismo subjacente da formação da EFE envolve uma mudança fenotípica de células endoteliais endocárdicas para fibroblastos através da transição endotelial-mesenquimal (EndMT)³. A EndMT pode ser detectada usando dupla coloração imunoistoquímica para marcadores endoteliais, como cluster de diferenciação (CD) 31 ou endotelial vascular (VE)-caderina (CD144) e marcadores de fibroblastos (por exemplo, alfa-actina de músculo liso, α-SMA). Além disso, também estabelecemos previamente o papel regulatório da via do TGF-ß nesse processo com ativação dos fatores de transcrição SLUG, SNAIL e TWIST³.

A EndMT é um processo fisiológico que ocorre durante o desenvolvimento cardíaco embrionário e leva à formação de septos e valvas a partir de coxins endocárdicos4, mas também causa fibrose orgânica na insuficiência cardíaca, fibrose renal ou câncer e desempenha um papel fundamental na aterosclerose vascular 5,6,7,8. A EndMT na fibrose cardíaca é regulada principalmente pela via do TGF-β, como relatamos nós e outros ^3,9. Vários estímulos têm sido descritos para induzir EndMT: inflamação¹⁰, hipóxia¹¹, alterações mecânicas 12 e distúrbios de fluxo, incluindo alterações do fluxo sanguíneo intracavitário 13, e EndMT também pode ser consequência de uma doença genética ¹⁴.

Esse modelo animal foi desenvolvido utilizando os principais componentes do desenvolvimento da EFE cardíaca, que são a imaturidade e as alterações do fluxo sanguíneo intracavitário, especificamente a estagnação do fluxo. A imaturidade foi completada com o uso de corações de ratos neonatais como doadores, uma vez que os ratos neonatais são conhecidos por serem imaturos em termos de desenvolvimento imediatamente após o nascimento. O transplante cardíaco heterotópico ofereceu restrição de fluxo intracavitário¹⁵.

Do ponto de vista clínico, esse modelo animal permite investigar melhor o impacto da EndMT no ventrículo esquerdo (VE) em crescimento. A restrição de crescimento imposta ao coração fetal e neonatal pela formação de EFE induzida por EndMT¹⁶ impede que pacientes com obstruções da via de saída do ventrículo esquerdo (ODVE), como estenose aórtica crítica congênita e síndrome do coração esquerdo hipoplásico (SHCE), façam reparo cirúrgico biventricular anatômico curativo¹⁷. Esse modelo animal facilita o estudo dos mecanismos celulares e a regulação da formação tecidual por meio da EndMT e permite testar opções de tratamento farmacológico ^3,18.

A ecocardiografia transabdominal é usada para monitorar a viabilidade do enxerto, a contratilidade e a patência das anastomoses. Após a eutanásia, a formação de EFE pode ser observada macroscopicamente dentro de 3 dias após o transplante. O tecido da EFE apresenta as mesmas características histopatológicas do tecido da EFE humana de pacientes com ODVE.

Assim, este modelo animal, embora desenvolvido para uso pediátrico no espectro da SHCE, pode ser aplicado no estudo de várias doenças com base no mecanismo molecular da EndMT.

Protocolo

Todos os procedimentos com animais foram conduzidos de acordo com o Conselho Nacional de Pesquisa. 2011. Guia para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório: Oitava Edição. Os protocolos dos animais foram revisados e aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais do Boston Children's Hospital.

Antes da cirurgia, todos os instrumentais cirúrgicos são autoclavados a vapor, e o tampão Krebs-Henseleit modificado, com concentração final de 22 mmol/L de KCl, é preparado como solução cardioplégica (Tabela 1). A solução é esterilizada por filtro e armazenada a 4 °C durante a noite. Um microscópio cirúrgico (12,5x) é necessário para o procedimento de transplante cardíaco neonatal heterotópico em ratos.

1. Preparo e anestesia

1. Use ratos Lewis machos/fêmeas com um peso de cerca de 150 g (5-6 semanas de idade) como receptores.
2. Para começar, raspe generosamente o abdômen do rato com uma navalha.
3. Colocar o rato em uma câmara de isoflurano e ligar o fluxo de oxigênio a 2 L/min com isoflurano a 2% até que o animal esteja adequadamente sedado mas ainda respirando espontaneamente. Injetar 45 mg/kg de quetamina e 5 mg/kg de xilazina por via intraperitoneal (IP), bem como 300 U/kg de heparina. Confirme a anestesia adequada com um teste de pinça dos dedos.
   NOTA: Monitorar cuidadosamente a respiração espontânea e a frequência cardíaca através da palpação do tórax para garantir um estado hemodinâmico estável durante todo o processo.
4. Para a intubação, colocar o rato em uma prateleira oblíqua (Figura 1), prender os dentes anteriores com uma corda e colocar a cabeça voltada para o cirurgião.
5. Coloque a luz na parte externa do pescoço na área das cordas vocais, pegue a língua com dois dedos e empurre-a levemente para cima e para a esquerda para fornecer a visão ideal para a intubação. Use uma cânula de 18 G, 2 em cânula para um rato de 100-150 g. Fixar o tubo intratraqueal com fita adesiva.
   NOTA: Recomenda-se a intubação cirúrgica com aumento de 3,5x.
6. Conecte a cânula de intubação ao ventilador de pequenos animais e ajuste as configurações de acordo com as instruções do fabricante com base no tamanho do animal.
   Observação : use as seguintes configurações para um rato de 150 g: modo de volume; frequência respiratória, 55/min; volume corrente, 1,3 mL 50 % relação I/E, mas este pode ser ajustado adequadamente conforme necessário. Assegurar movimento torácico adequado bilateral e igual, e administrar isoflurano continuamente a 0,5%–2% através do ventilador.
7. Coloque o rato em uma almofada de aquecimento (para manter a temperatura corporal normal) em posição supina com a cauda voltada para o cirurgião. Esterilizar o abdome três vezes com solução de betadina e etanol 70% alternadamente. Administrar lubrificante ocular e cobrir o rato com um campo cirúrgico estéril, deixando o abdome descoberto.

2. Preparo cirúrgico e transplante heterotópico do coração de doador neonatal no rato receptor

1. Realizar laparotomia mediana com bisturi lâmina 15 para incisão da pele e tesoura para abertura da parede abdominal anterior, seguida de exposição romba da aorta abdominal retroperitoneal e veia cava inferior (VCI) com aplicadores de ponta de algodão.
2. Mobilize os intestinos (incluindo o cólon descendente) e coloque-os em direção ao quadrante superior direito. Cubra os intestinos com gaze morna embebida em soro fisiológico. Use afastadores para garantir a exposição ideal da VCI e da aorta abdominal.
3. Realizar dissecção romba da VCI infrarrenal e da aorta abdominal até a bifurcação. Ligate todas as artérias e veias ramificadas infrarrenais (por exemplo, artéria mesentérica inferior e artérias linfonodais) com uma sutura de náilon 10-0.
   OBS: Existe grande variabilidade na anatomia desses ramos laterais. Monitorar visualmente o pulso e a frequência cardíaca da aorta quando não houver outra monitorização hemodinâmica disponível. Avaliar a profundidade adequada da anestesia a cada 15 min através de um teste de pinça dos dedos. Ajustar a concentração de isoflurano em conformidade.
4. Depois que o coração doador for colhido de um rato neonatal, entregue o coração excisado em condições estéreis em uma bacia cirúrgica contendo tampão Krebs-Henseleit para o campo cirúrgico. Irrigar o coração doador intermitentemente com solução cardioplégica gelada.
   NOTA: Quando um segundo cirurgião está disponível, o coração deve ser preparado ao mesmo tempo, pois um segundo cirurgião reduz o tempo total de anestesia do animal receptor e o tempo de isquemia do coração doador. Quando um segundo cirurgião não estiver disponível, cubra o abdome do receptor com soro fisiológico morno e monitore o animal durante o procedimento de coleta.
5. Aplicar quatro pequenas pinças vasculares atraumáticas nos segmentos distal e proximal da aorta infrarrenal e da VCI. Se necessário, oclua temporariamente um vaso renal desfavorável com uma sutura de seda 7-0 e libere a sutura após o procedimento. Colocar um fio de náilon 10-0 verticalmente na parede anterior da aorta para facilitar a aortotomia. Realizar aortotomia com dois pequenos cortes horizontais (em forma de cunha) com microtesoura, puxando levemente a sutura.
   NOTA: Para remover quaisquer coágulos sanguíneos, recomenda-se a lavagem do lúmen aórtico com soro fisiológico heparinizado.
6. Colocar o coração do doador no lado esquerdo (do ponto de vista do animal) da aorta e fixar a aorta infrarrenal do receptor e a aorta ascendente do doador término-a-lado nas posições 12 e 6 horas da aortotomia com suturas. Continue com a terceira e quarta suturas nas posições 3 horas e 9 horas, virando suavemente o coração para o lado direito da aorta após a terceira sutura. Completar a anastomose arterial adicionando uma a duas suturas em cada interespaço.
   OBS: Deve-se tomar cuidado para não tocar a aorta ascendente do doador ou a aorta abdominal do receptor com pinça ao criar a anastomose para evitar danos teciduais.
7. Girar o rato no sentido anti-horário, com a cabeça voltada para a mão esquerda do cirurgião. Mova a aorta do doador para o lado esquerdo da aorta abdominal para permitir uma visão ideal da VCI.
8. Realizar venotomia na VCI, levemente proximal à anastomose aórtica, utilizando-se lâmina 11 para punção e microtesoura para ajuste adequado do tamanho de acordo com o diâmetro do tronco pulmonar do doador. Novamente, lave a luz intracaval com soro fisiológico heparinizado.
9. Inicia-se com a anastomose venosa entre a VCI do receptor e o tronco pulmonar do doador, que é melhor obtida colocando-se pontos de náilon 11-0 interrompidos na parede posterior do vaso, a partir das 12 horas e 6 horas (relacionados à VCI), e depois coloca-se uma sutura contínua de náilon 11-0 na parede frontal (das 6 horas em direção às 12 horas).
10. Cobrir as anastomoses com pequenas tiras de uma esponja de gelatina absorvível e remover as pinças microvasculares começando distalmente. Use um aplicador de ponta de algodão para comprimir levemente as esponjas para obter a hemostasia ideal.
11. Observe o enchimento dos vasos coronários do enxerto no momento da liberação das pinças microvasculares distais, e certifique-se de que o coração doador comece a bater imediatamente quando a pinça proximal é liberada.
    NOTA: A viabilidade do enxerto pode ser pontuada de 0 a 4 no intraoperatório de acordo com um escore de Stanford modificado¹⁹ para confirmar a função adequada do enxerto.
12. Coloque os intestinos de volta no abdômen, garantindo não distorcer a anastomose arterial e venosa.
13. Administrar meloxicam (1mg/kg) e ethiqa XR (0,65 mg/kg) por via subcutânea enquanto o animal estiver totalmente anestesiado para verificar a analgesia pós-operatória. Em seguida, fechar a parede abdominal com uma sutura contínua de vicryl absorvível 5-0 antes de fechar a pele com uma sutura de vicryl absorvível 6-0 por via intracutânea.
    Observação : orientação sobre falhas comuns e solução de problemas é apresentada na tabela 2.

3. Captação do coração do doador neonatal

1. Colocar o rato doador neonatal em câmara insuflada com isoflurano (2%) para sedação. Administrar quetamina (75 mg/kg) e xilazina (5 mg/kg), bem como heparina (300 U/kg) por via intraperitoneal.
2. Confirme a profundidade da anestesia por pinça dos dedos dos pés e coloque o rato em posição supina com a cauda voltada para você. Esterilizar todo o tórax e parede abdominal com betadina e etanol 70% três vezes alternativamente. Cubra o rato com um campo cirúrgico estéril.
3. Com microscópio cirúrgico de 12,5x, remova toda a parede torácica anterior iniciando com uma incisão horizontal com bisturi de 15 lâminas no xifoide, seguida de incisões verticais laterais até as axilas de ambos os lados com tesoura. A parede torácica anterior pode então ser removida continuando com outra incisão horizontal logo abaixo do pescoço.
4. Dissecar a VCI, as veias cavas superiores direita e esquerda e os vasos pulmonares com tesoura e, em seguida, circundar e ligar todos os vasos com fio de seda 7-0. Administrar 3 mL de solução de Krebs-Henseleit modificada com alto teor de potássio e gelado no átrio direito, puncionando a VCI com uma agulha de 30 G e empurrando levemente o diafragma para baixo com pinças.
5. Corte a VCI, as CVS, os vasos pulmonares e a aorta com tesoura. Transeccionar as artérias pulmonares na medida do possível e a aorta distal ao tronco braquiocefálico para garantir o comprimento adequado com bisturi com 11 lâminas.
6. Separe o tronco pulmonar e a aorta ascendente com uma microtesoura e lave o coração com solução cardioplégica gelada usando uma seringa de 3 mL.

4. Recuperação do receptor e monitorização do enxerto

1. Após a cirurgia, dê ao rato tempo suficiente para acordar, o que geralmente ocorre em uma janela de tempo de 15 minutos, e deixe-o se recuperar em uma almofada de aquecimento.
   OBS: Não são necessários antibióticos devido ao baixíssimo risco de infecção e para não comprometer o modelo experimental, não sendo aplicada restrição a alimentos ou água.
2. Após o transplante, monitore a função do enxerto por palpação do coração transplantado diariamente, mas considere que isso às vezes pode ser difícil de avaliar devido à sobreposição intestinal.
   NOTA: A ecocardiografia abdominal pode medir com maior precisão a viabilidade do enxerto. Para o ecocardiograma, sedar levemente o rato com isoflurano (1-2%) inalado através de um cone nasal e posicioná-lo sobre uma almofada de aquecimento. O ecocardiograma é geralmente realizado no 1º dia de pós-operatório (DPO), DPO 7 e DPO 14. Para permitir a avaliação da frequência cardíaca e da contratilidade, pode-se facilmente obter cortes de eixo longo e eixo curto (Figura 2A, B). Para avaliar as anastomoses, utilizar o ecodopplercardiograma (Figura 3A) e confirmar a formação de tecido EFE visto como uma camada endocárdica eco-brilhante dentro da cavidade ventricular esquerda (Figura 3B, C).

Resultados

Viabilidade e batimento do enxerto
Neste trabalho, a viabilidade do enxerto foi avaliada visualmente após a retirada de todas as pinças, sendo permitido um tempo aproximado de reperfusão de 10-15 min com abdome aberto para observação do enxerto. O mesmo sistema de pontuação para verificar objetivamente a viabilidade do enxerto foi utilizado para a avaliação visual ao final da cirurgia e para o ecocardiograma no DPO 1, DPO 7 e DPO 14.

0 = ausência de função do ó...

Discussão

Este modelo animal de transplante heterotópico de um coração de rato doador neonatal no abdome do receptor cria a possibilidade de estudar a fibrose derivada de EndMT por meio de avaliação histológica detalhada do tecido, identificar vias de sinalização regulatórias e testar opções de tratamento. Uma vez que EndMT é o mecanismo subjacente para doenças fibróticas do coração, este modelo tem grande valor no campo da cirurgia cardíaca pediátrica e além. Nesse modelo, muitos fatores podem influenciar negat...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Advanced Ventilator System For Rodents, SAR-1000	CWE, Inc.	12-03100	small animal ventilator
aSMA	Sigma	A2547	Antibody for Immunohistochemistry
Axio observer Z1	Carl Zeiss		inverted microscope
Betadine Solution	Avrio Health L.P.	367618150092
CD31	Invitrogen	MA1-80069	Antibody for Immunohistochemistry
DAPI	Invitrogen	D1306	Antibody for Immunohistochemistry
DemeLON Nylon black 10-0	DemeTECH	NL76100065F0P	10-0 Nylon suture
ETFE IV Catheter, 18G x 2	TERUMO SURFLO	SR-OX1851CA	intubation cannula
Micro Clip 8mm	Roboz Surgical Instrument Co.	RS-6471	microvascular clamps
Nylon black monofilament 11-0	SURGICAL SPECIALTIES CORP	AA0130	11-0 Nylon
O.C.T. Compound	Tissue-Tek	4583	Embedding medium for frozen tissue specimen
p-SMAD2/3	Invitrogen	PA5-110155	Antibody for Immunohistochemistry
Rodent, Tilting WorkStand	Hallowell EMC.	000A3467	oblique shelf for intubation
Silk Sutures, Non-absorbable, 7-0	Braintree Scientific	NC9201231	Silk suture
Slug/Snail	Abcam	ab180714	Antibody for Immunohistochemistry
Undyed Coated Vicryl 5-0 P-3 18"	Ethicon	J493G	5-0 Vicryl
Undyed Coated Vicryl 6-0 P-3 18"	Ethicon	J492G	6-0 Vicryl
VE-Cadherin	Abcam	ab231227	Antibody for Immunohistochemistry
Zeiss OPMI 6-SFR	Zeiss		Surgical microscope
Zen, Blue Edition, 3.6	Zen		inverted microscope software