脊索丛中基因的靶向敲除

摘要

在这里，我们描述了一种选择性地改变脉络丛中基因表达的方法，同时避免对其他大脑区域的任何影响。

摘要

脉络丛 （ChP） 是免疫细胞在生理和病理条件下浸润到中枢神经系统 （CNS） 的关键通道。最近的研究表明，调节 ChP 活性可以预防中枢神经系统疾病。然而，由于其微妙的结构，在不影响其他大脑区域的情况下研究 ChP 的生物学功能具有挑战性。本研究提出了一种使用腺相关病毒 （AAV） 或由 TAT 序列组成的环化重组酶 （Cre） 重组酶 （CRE-TAT） 重组酶蛋白在 ChP 组织中敲低基因的新方法。结果表明，将AAV或CRE-TAT注射到侧脑室后，荧光完全集中在ChP中。 利用这种方法，该研究利用RNA干扰（RNAi）或X-overP1（Cre/LoxP）系统的Cre/位点成功敲低了ChP中的腺苷A 2A受体（A_2A R），并表明这种敲低可以缓解实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）的病理。该技术可能对未来研究 ChP 在中枢神经系统疾病中的作用具有重要意义。

引言

脉络丛 （ChP） 通常被认为通过分泌脑脊液 （CSF） 和脑源性神经营养因子 （BDNF） 来帮助维持脑功能稳态^1,2。在过去三十年中，越来越多的研究表明，ChP 代表了免疫细胞浸润到中枢神经系统 （CNS） 的独特途径。

ChP 的紧密连接 （TJ） 由单层 ChP 上皮细胞组成，通过阻止大分子和免疫细胞进入大脑来维持免疫稳态³。然而，在某些病理条件下，ChP 组织会检测脑脊液和血液中的危险相关分子模式 （DAMP） 并做出反应，导致异常免疫浸润和脑功能障碍 ^4,5。尽管ChP起着关键作用，但它的小尺寸和在大脑中的独特位置使得很难在不影响其他大脑区域的情况下研究其功能。因此，在ChP中特异性地操纵基因表达是了解其功能的理想方法。

最初，环化重组酶 （Cre） 转基因系在 ChP 中表达的基因特异性启动子的控制下表达 Cre，通常用于通过与 flox 候选基因杂交来删除靶基因 ^6,7,8<....

研究方案

本研究中描述的所有动物程序均按照美国国立卫生研究院《实验动物护理和使用指南》中概述的指南进行，并经温州医科大学机构动物护理和使用委员会批准。

1. 动物

1. 购买年龄为8-12周，体重为20-22g的雄性C57BL / 6小鼠。
2. 获得转基因Rosa-LSL（Lox-StoP-Lox）-tdTomato（Ai9）小鼠系和雄性A_2AR flox^{/ flox} 小鼠。
3. 将小鼠随机分配到两组并饲养在笼子中，每个笼子最多5只小鼠，在标准的12小时光照/ 12小时黑暗循环下1周。
4. 为小鼠提供足够的食物和水，并将它们保持在25°C的恒定温度下。

2. 用 AAV2/5-shRNA 特异性敲低 A_2A R

1. 称量每只鼠标的重量并记下值。
2. 用1%戊巴比妥钠腹膜内麻醉小鼠，剂量为6-8mL / kg，相当于60-80mg / kg戊巴比妥，并将小鼠放在加热垫上保温。
   注意：根据小鼠的体重给予正确剂量的戊巴比妥钠以确保手术成功至关重要。麻醉不宜太深，因为它可能导致死亡，但不应太浅，因为小鼠可能会在手术过程中醒来，从而....

讨论

该研究提出了两种不同的方法来靶向敲低ChP基因。第一种方法涉及将含有Cre重组酶的CRE-TAT注射到A_2AR flox^{/ flox}小鼠中。第二种方法需要ICV注射携带A_2AR的shRNA的AAV2/5。通过利用这两种策略，本工作实现了 ChP 中 A 2A R 的选择性敲低，并能够证明抑制 ChP 中 A_2AR 信号传导对 EAE 病理学的保护作用。值得注意的是，该协议包括两个关键步骤。首先，立体定位操作是必.......

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
A2ARflox/flox mice	State Key Laboratory of Ophthalmology, Optometry and Visual Science, Wenzhou Medical University
AAV2/5-A2AR-ShRNA virus	Shanghai Heyuan Biotechnology Co. LTD	pt-4828
antifade mounting medium	Beyotime Biotechnology	0100-01
borosilicate glass capillary	Beijing Meiyaxian Technology Co. Ltd	B100-50-10
brain stereotaxic apparatus	RWD, Shenzhen	69100
C57BL/6 mice	Beijing Vital Charles River Laboratory Animal Technology Company
CRE-TAT recombinase	Millipore	SCR508
DAPI	Absin	B25A031
frozen slicing machine	Leica	CM1950
H37Ra	Becton Dickinson and company	231141
Hamilton syringe	Hamilton, American	P/N: 86259
Incomplete Freunds adjuvant	Sigma	F5506
Laser confocal microscope	Zeiss	LSM900
MOG35-55	Suzhou Qiangyao Biotechnology Co., LTD	4010006243
OCT glue	Epredia	6502p
paraformaldehyde	Chengdu Kelong Chemical Reagent Company	30525-89-4
pentobarbital sodium	Boyun Biotech	PC13003
Pipette gun	Eppendorf	N45014F
PrimeScript 1st Strand cDNA Synthesis Kit	Takara	6110A
Real- Time PCR System	BioRad	CFX96
Rosa-LSL (Lox-StoP-Lox)-tdTomato mice	Jackson Laboratory
sucrose	Sangon Biotech	A502792-0500
super high speed homogenizer	IKA	3737025
Trizol	Invitrogen	15596026
xylene solution	Chengdu Kelong Chemical Reagent Company	1330-20-7