Knockdown mirato dei geni nel plesso coroideo

Riepilogo

Qui, descriviamo un metodo per alterare selettivamente le espressioni geniche nel plesso coroideo evitando qualsiasi impatto in altre aree cerebrali.

Abstract

Il plesso coroideo (ChP) funge da porta d'accesso critica per l'infiltrazione delle cellule immunitarie nel sistema nervoso centrale (SNC) sia in condizioni fisiologiche che patologiche. Recenti ricerche hanno dimostrato che la regolazione dell'attività di ChP può offrire protezione contro i disturbi del SNC. Tuttavia, studiare la funzione biologica del ChP senza influenzare altre regioni del cervello è impegnativo a causa della sua delicata struttura. Questo studio presenta un nuovo metodo per il knockdown genico nel tessuto ChP utilizzando virus adeno-associati (AAV) o proteina ricombinasi dell'enzima di ricombinazione della ciclizzazione (Cre) costituita dalla sequenza TAT (CRE-TAT). I risultati dimostrano che dopo l'iniezione di AAV o CRE-TAT nel ventricolo laterale, la fluorescenza è stata concentrata esclusivamente nel ChP. Utilizzando questo approccio, lo studio ha abbattuto con successo il recettore dell'adenosina A_2A (_{A 2A}R) nel ChP utilizzando l'interferenza dell'RNA (RNAi) o Cre/locus dei sistemi X-overP1 (Cre/LoxP) e ha dimostrato che questo knockdown potrebbe alleviare la patologia dell'encefalomielite autoimmune sperimentale (EAE). Questa tecnica può avere importanti implicazioni per la ricerca futura sul ruolo della ChP nei disturbi del SNC.

Introduzione

Si è spesso pensato che il plesso coroideo (ChP) aiutasse a mantenere l'omeostasi funzionale del cervello secernendo liquido cerebrospinale (CSF) e fattore neurotrofico derivato dal cervello (BDNF)^1,2. L'aumento della ricerca negli ultimi tre decenni ha rivelato che il ChP rappresenta un percorso distinto per l'infiltrazione delle cellule immunitarie nel sistema nervoso centrale (SNC).

Le giunzioni strette (TJ) del ChP, composte da un epitelio ChP monostrato, mantengono l'omeostasi immunologica impedendo alle macromolecole e alle cellule immunitarie di entrare nel cervello³. Tuttavia, in determinate condizioni patologiche, il tessuto ChP rileva e risponde ai modelli molecolari associati al pericolo (DAMP) nel liquido cerebrospinale e nel sangue, portando a infiltrazioni immunitarie anomale e disfunzioni cerebrali ^4,5. Nonostante il suo ruolo critico, le piccole dimensioni del ChP e la sua posizione unica nel cervello rendono difficile studiarne la funzione senza influenzare altre regioni cerebrali. Pertanto, manipolare l'espressione genica in modo specifico nel ChP è un approccio ideale per comprenderne la funzione.

Inizialmente, le linee transgeniche dell'enzima di ricombinazione della ciclizzazione (Cre), che esprimono Cre sotto il controllo di promotori specifici per i geni espressi nel ChP, sono state comunemente utilizzate per eliminare i geni bersaglio mediante l'ibridazione con i geni candidati^floxed 6,7,8. Ad esempio, il fattore di trascrizione Forkhead box J1 (FoxJ1) è espresso esclusivamente nell'epitelio ChP del cervello prenatale del topo⁷. Pertanto, la linea FoxJ1-Cre è stata spesso utilizzata per eliminare i geni situati nel ChP ^6,9. Tuttavia, il successo di questa strategia dipende fortemente dalla specificità del promotore. Si scoprì gradualmente che il modello di espressione di FoxJ1 non era abbastanza distintivo, poiché FoxJ1 era presente anche nelle cellule epiteliali ciliate in altre parti del cervello e del sistema periferico⁷. Per superare questa limitazione, è stata eseguita un'iniezione intra-cerebroventricolare (ICV) di Cre ricombinasi per veicolare la ricombinasi nei ventricoli delle linee transgeniche floxate. Questa strategia ha mostrato un'elevata specificità, come evidenziato dalla presenza di fluorescenza tdTomato esclusivamente nel tessuto ChP^10,11. Tuttavia, questo metodo è ancora limitato dalla disponibilità di linee di topi transgenici floxati. Per affrontare questo problema, i ricercatori hanno impiegato l'iniezione ICV di virus adeno-associato (AAV) per ottenere il knockdown specifico per ChP o la sovraespressione dei geni bersaglio^12,13. Una valutazione completa di diversi sierotipi di AAV per l'infezione da ChP ha rivelato che AAV2/5 e AAV2/8 mostrano forti capacità di infezione nel ChP, pur non infettando altre regioni cerebrali. Tuttavia, è stato riscontrato che AAV2/8 infetta l'ependima che circonda i ventricoli, mentre il gruppo AAV2/5 non ha mostrato alcuna infezione¹⁴. Questo metodo ha il vantaggio di superare i limiti dell'acquisizione di animali transgenici floxati.

Questo articolo descrive un protocollo passo-passo per il knockdown genico nel ChP utilizzando due metodi: ICV di AAV2/5 che trasporta shRNA del recettore dell'adenosina A 2A (_{A 2A}R) e proteina ricombinasi Cre costituita dalla sequenza TAT (CRE-TAT) ricombinasi per ottenere il knockdown specifico per ChP di A_2A R. I risultati dello studio suggeriscono che abbattere A_2AR nella ChP può alleviare l'encefalomielite autoimmune sperimentale (EAE). Questo protocollo dettagliato fornisce una guida utile per gli studi sulla funzione della ChP e per il knockdown specifico dei geni nella ChP.

Protocollo

Tutte le procedure sugli animali descritte in questo studio sono state condotte in conformità con le linee guida delineate nella Guida NIH per la cura e l'uso degli animali da laboratorio e approvate dal Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali presso l'Università di Medicina di Wenzhou.

1. Animali

1. Acquista topi maschi C57BL/6 di età compresa tra 8 e 12 settimane e del peso di 20-22 g.
2. Ottenere la linea murina transgenica Rosa-LSL (Lox-StoP-Lox)-tdTomato (Ai9) e topi maschi A_2AR^flox/flox .
3. Assegnare in modo casuale i topi a due gruppi e alloggiarli in gabbie, con un massimo di cinque topi per gabbia, con un ciclo standard di 12 ore di luce/12 ore di buio per 1 settimana.
4. Fornire ai topi cibo e acqua a sufficienza e mantenerli a una temperatura costante di 25 °C.

2. Knockdown ChP-specifico di A _2ARs con AAV2/5-shRNA

1. Pesa ogni mouse e annota i valori.
2. Anestetizzare i topi per via intraperitoneale con pentobarbital sodico all'1% al dosaggio di 6-8 ml/kg equivalenti a 60-80 mg/kg di pentobarbital e posizionare il mouse su un termoforo per tenerlo al caldo.
   NOTA: È fondamentale somministrare il corretto dosaggio di pentobarbital sodico in base al peso del topo per garantire il successo dell'intervento. L'anestesia non deve essere troppo profonda, in quanto potrebbe causare mortalità, ma non deve essere troppo superficiale, poiché il topo potrebbe svegliarsi durante la procedura, compromettendo potenzialmente l'efficacia dell'iniezione del virus. Verificare la corretta dose di anestesia pizzicando le dita dei piedi e assicurandosi che i topi non rispondano.
3. Usa un rasoio per topi specializzato per tagliare i peli superiori dei topi anestetizzati .
4. Applicare un unguento per gli occhi su entrambi gli occhi per evitare che si secchino e fissare i topi su un apparato stereotassico per immobilizzare il cervello. Copri l'animale con un telo sterile.
5. Sterilizzare accuratamente la pelle della testa e del collo dei topi con tre cicli di disinfettante iodoforo e alcol al 75% per ridurre l'infezione postoperatoria. Quindi applicare l'1% di lidocaina per via topica sul cuoio capelluto dei topi e praticare una piccola incisione per esporre completamente il cranio al microscopio.
   NOTA: Utilizzare strumenti sterili durante tutta la procedura.
6. Preparare due siringhe da 10 μL: una con AAV2/5-A_2AR-shRNA acquistata (titolo: 6,27 × 10⁹ vg/μL) e l'altra con AAV2/5-Scramble acquistata (titolo: 6,21 × 10⁹ vg/μL).
   NOTA: Quando si utilizza la siringa, l'estremità anteriore deve essere collegata a un capillare di vetro ed è possibile ottenere un intervallo di 10 μL controllando la lunghezza del capillare di vetro.
7. Utilizzare il microscopio per individuare il bregma e il lambda e impostare il punto di coordinate (AP: -0,58; ML: ±1,10; DL: -2.20) sulla siringa da 10 μL (Figura 1). Il punto di coordinate si basa sull'atlante stereotassico¹⁵ del cervello del topo.
8. Praticare un piccolo foro nel cranio nel punto di coordinate regolato.
   NOTA: Al microscopio, la perforazione viene eseguita utilizzando una microfresa sterile contro la superficie del cranio. Dopo la perforazione, rimuovendo le meningi che coprono il cervello ed esponendo il parenchima cerebrale sottostante, si prevengono lesioni ai vasi sanguigni. Questo passaggio impedisce che la punta del capillare di vetro venga spezzata dalle meningi. Il diametro del foro praticato deve essere sufficiente per consentire alla punta dell'ago di entrare nel tessuto cerebrale.
9. Somministrare 2 μL di virus AAV2/5-A_2AR-shRNA nel ventricolo cerebrale tramite iniezione laterale a una velocità costante di 100 nL/min. Tenere l'ago in posizione per 10 minuti prima di estrarlo. Si noti che il virus è stato somministrato con iniezione unilaterale.
10. Sigillare prontamente la pelle lesa utilizzando colla medica di biofibrina per prevenire la perdita di virus, che può essere risciacquata con liquido cerebrospinale dopo aver rimosso l'ago se la colla non viene applicata rapidamente. Inoltre, non utilizzare cotton fioc per pulire il liquido cerebrospinale, poiché potrebbe anche causare la perdita di virus.
11. Per facilitare il recupero, posizionare il mouse su un termoforo per mantenere la temperatura corporea a 37,0 ± 0,5 °C e applicare l'1% di lidocaina per via topica sul cuoio capelluto del topo. Lasciare che i topi si riprendano per 2 settimane prima di indurre il modello EAE, poiché questo periodo è necessario per l'espressione del virus AAV2/5-A 2A R-shRNA e il successivo knockdown di_{A 2A}R.

3. Knockdown specifico per ChP di A _2AR con un sistema Cre/locus di X-overP1 (Cre/LoxP)

NOTA: Le seguenti procedure possono essere eseguite utilizzando il metodo descritto in precedenza. Fare riferimento ai passaggi 2.1-2.11 per i metodi di iniezione dettagliati.

1. Iniettare 2 μL di CRE-TAT ricombinasi in ciascun ventricolo laterale di un topo Rosa-LSL (Lox-StoP-Lox)-tdTomato come gruppo sperimentale e 2 μL di soluzione fisiologica sterile tamponata con fosfato (PBS) come gruppo di controllo. Utilizzando lo stesso protocollo di cui sopra (paragrafo 2), iniettare 2 μL di CRE-TAT ricombinasi in ciascuno dei ventricoli laterali di topi flox A_2AR flox^/flox insieme a 2 μL di PBS sterile come gruppo di controllo.
2. Preparare sezioni di tessuto congelate ed eseguire la colorazione nucleare 2 settimane dopo l'iniezione di ricombinasi CRE-TAT. Per ulteriori informazioni, vedere i passaggi 4.1-4.3.

4. Perfusione transcardica nei topi

1. Somministrare 60-80 mg/kg di pentobarbital sodico per anestetizzare in profondità i topi. Confermare il piano dell'anestesia pizzicando un dito del piede ed eseguire la perfusione transcardica utilizzando 40 mL di soluzione sterile di PBS seguita da 20 mL di paraformaldeide (PFA) al 4%.
   NOTA: Il successo della perfusione è indicato da un colore bianco nel fegato, mentre la presenza di polmoni ingrossati o di deflusso di PBS dalla bocca durante la perfusione suggerisce un fallimento della procedura.
2. Estrai rapidamente il cervello del topo, garantendo una degradazione minima delle proteine.
3. Immergere il cervello del topo in PFA/PBS al 4% durante la notte per la post-fissazione, seguita dalla sostituzione con una soluzione di PB al 30% di saccarosio per 72 ore.
   NOTA: È fondamentale evitare un'eccessiva disidratazione del tessuto cerebrale, quindi il cervello non deve essere lasciato nella soluzione di saccarosio PB per troppo tempo.

5. Sezionamento e colorazione dei tessuti congelati

1. Incorporare il cervello di topo precedentemente disidratato in colla a temperatura di taglio ottimale (OCT), congelare il cervello incorporato e utilizzare un microtomo scorrevole per tagliare sezioni coronali con uno spessore di 20 μm.
2. Posiziona le sezioni cerebrali sul vetrino. Una volta che le sezioni cerebrali sono asciutte, conservarle in frigorifero a -20 °C per gli esperimenti successivi.
3. Metti ogni vetrino in una custodia e immergi il telaio in un contenitore pieno di PBS per risciacquare accuratamente il vetrino. Sciacquare delicatamente i vetrini cerebrali con la soluzione PBS tre volte, per 10 minuti ogni volta.
   NOTA: Prestare attenzione per evitare che le sezioni cerebrali cadano dal vetrino.
4. Colorare i vetrini cerebrali con una soluzione di 4′,6-diamidino-2-fenilindolo (DAPI) per 10 minuti.
5. Sciacquare i vetrini cerebrali con soluzione PBS per 5 minuti.
6. Applicare una goccia di mezzo di montaggio antisbiadimento sulle sezioni cerebrali.
7. Posiziona un vetrino coprioggetto sulle sezioni cerebrali, sigilla il vetrino coprioggetto con smalto per unghie e analizza le sezioni utilizzando un microscopio a fluorescenza convenzionale.

6. Induzione EAE

NOTA: Eseguire l'induzione EAE dopo 2 settimane dall'iniezione di shRNA o CRE-TAT ricombinasi¹¹.

1. Creare una soluzione acquosa mescolando 2,5 mg di glicoproteina oligodendrocitaria mielinica (MOG_35-55) con 2 mL di PBS. Preparare una soluzione completa di olio adiuvante di Freunds (CFA) mescolando M. tuberculosis (H37Ra) con adiuvante di Freunds (IFA) incompleto.
2. Mescolare le soluzioni acquose e oleose in rapporto 1:1. Usa una pipa a T per montare la miscela in uno stato di olio in acqua.
   NOTA: Il tubo a T è anche chiamato tubo a tre vie. È un tubo di plastica in grado di controllare la direzione del flusso della soluzione per miscelare completamente il MOG_35-55 e il CFA.
3. Utilizzare un omogeneizzatore ad alta velocità per produrre l'emulsione dell'antigene MOG per il modello EAE in condizioni di bagno di ghiaccio.
4. Anestetizzare i topi per via intraperitoneale con pentobarbital sodico all'1% alla dose di 6-8 ml/kg equivalenti a 60-80 mg/kg di pentobarbital.
5. Iniettare per via sottocutanea l'emulsione dell'antigene MOG in quattro punti diversi (collo, schiena, fianchi sinistro e destro) a un volume di 10 ml/kg per un totale di quattro iniezioni ciascuna.
   NOTA: È importante selezionare attentamente il sito di iniezione, poiché siti diversi possono avere effetti diversi sulla morbilità e sulla mortalità dei topi. Inoltre, ripetute iniezioni di MOG possono portare alla tolleranza immunitaria, quindi il team di ricerca ha scelto un singolo metodo di iniezione per prevenire questo potenziale problema.
6. Iniettare immediatamente 500 ng/mL di tossina della pertosse (PT) per via intraperitoneale alla dose di 5 mg/kg dopo l'iniezione di MOG.
   NOTA: Il PT aumenta la permeabilità della barriera emato-encefalica (BBB) e facilita l'infiltrazione delle cellule T nel cervello.
7. Dopo 48 ore, iniettare per via intraperitoneale la soluzione di PT allo stesso volume.

7. Punteggio di deficit neurologico

1. Valutare e classificare i topi giornalmente utilizzando una scala di valutazione 16 che va da 0 a¹⁵ per valutare l'incidenza e la gravità dell'EAE in base ai seguenti deficit neurologici:
   Coda: 0 indica l'assenza di segni, 1 rappresenta una coda semiparalizzata e 2 indica una coda completamente paralizzata.
   Arti: 0 indica l'assenza di segni, 1 rappresenta un'andatura debole o alterata, 2 indica la paresi e 3 rappresenta un arto completamente paralizzato.
2. Assegna un punteggio di 12 a un animale tetraplegico con paralisi completa e assegna un punteggio di 15 alla mortalità.

8. Colorazione con ematossilina-eosina (H&E)

1. Prendi il cervello di topo disidratato e incorporalo in paraffina fusa. Lasciare raffreddare e solidificare il blocco di paraffina per un uso successivo.
   NOTA: Il blocco di paraffina deve essere completamente asciutto e fresco per evitare danni ai tessuti.
2. Tagliare il blocco di paraffina cerebrale di topo in vetrini spessi 5 μm. Disporre la sezione di cervello di topo di paraffina su un vetrino e asciugarla in forno a 60 °C per 3 ore.
3. Immergere i vetrini in sequenza nella soluzione di xilene I per 10 min, nella soluzione di xilene II per 10 min, nell'alcol 100% I per 3 min, nell'alcol 100% II per 3 min, nell'alcol al 95% per 3 min, nell'alcol al 90% per 3 min, nell'alcool all'80% per 3 min, nell'alcool al 70% per 3 min e nell'acqua distillata per 1 min.

9. Analisi quantitativa della reazione a catena della polimerasi (qPCR)

1. Dopo aver perfuso i topi con PBS, rimuovere il ChP dai ventricoli ed estrarre l'RNA con Trizol. Sintetizzare il cDNA utilizzando il primo kit di sintesi del cDNA a filamento.
2. Eseguire l'analisi qPCR utilizzando la premiscela Ex Taq SYBR-green e un sistema di PCR in tempo reale. Utilizzare i seguenti primer A_2AR: avanti - GCCATCCCATTCGCCATCA; inverso - GCAATAGCCAAGAGGCTGAAGA.

Risultati

Knockdown di A_2AR specifico per ChP mediante iniezione ICV di AAV2/5-shRNA o CRE-TAT
Il ruolo di A_2AR nel ChP come potente regolatore dell'informazione neurale nella patogenesi dell'EAE rimane poco chiaro. Abbattere l'espressione di A 2A_Rspecifica per ChP potrebbe far luce sugli effetti regolatori di A_2AR sul sistema immunitario centrale nell'EAE e in altre infiammazioni del sistema nervoso. Questo studio ha utilizzato l'iniezione ICV di CRE-TAT per ridurre ...

Discussione

La ricerca ha presentato due approcci distinti per il knockdown mirato dei geni ChP. Il primo approccio prevedeva l'iniezione ICV di CRE-TAT, che contiene Cre ricombinasi, in topi flox A_2AR^/flox. Il secondo approccio ha comportato l'iniezione ICV di AAV2/5 trasportatore di shRNA di A_2AR. Utilizzando queste due strategie, il lavoro ha ottenuto il knockdown selettivo di A 2A R all'interno del ChP ed è stato in grado di dimostrare gli effetti protettivi dell'inibizione della segnalazione di...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
A2ARflox/flox mice	State Key Laboratory of Ophthalmology, Optometry and Visual Science, Wenzhou Medical University
AAV2/5-A2AR-ShRNA virus	Shanghai Heyuan Biotechnology Co. LTD	pt-4828
antifade mounting medium	Beyotime Biotechnology	0100-01
borosilicate glass capillary	Beijing Meiyaxian Technology Co. Ltd	B100-50-10
brain stereotaxic apparatus	RWD, Shenzhen	69100
C57BL/6 mice	Beijing Vital Charles River Laboratory Animal Technology Company
CRE-TAT recombinase	Millipore	SCR508
DAPI	Absin	B25A031
frozen slicing machine	Leica	CM1950
H37Ra	Becton Dickinson and company	231141
Hamilton syringe	Hamilton, American	P/N: 86259
Incomplete Freunds adjuvant	Sigma	F5506
Laser confocal microscope	Zeiss	LSM900
MOG35-55	Suzhou Qiangyao Biotechnology Co., LTD	4010006243
OCT glue	Epredia	6502p
paraformaldehyde	Chengdu Kelong Chemical Reagent Company	30525-89-4
pentobarbital sodium	Boyun Biotech	PC13003
Pipette gun	Eppendorf	N45014F
PrimeScript 1st Strand cDNA Synthesis Kit	Takara	6110A
Real- Time PCR System	BioRad	CFX96
Rosa-LSL (Lox-StoP-Lox)-tdTomato mice	Jackson Laboratory
sucrose	Sangon Biotech	A502792-0500
super high speed homogenizer	IKA	3737025
Trizol	Invitrogen	15596026
xylene solution	Chengdu Kelong Chemical Reagent Company	1330-20-7