Knockdown ciblé des gènes du plexus choroïde

Résumé

Nous décrivons ici une méthode permettant de modifier sélectivement l’expression des gènes dans le plexus choroïde tout en évitant tout impact dans d’autres zones du cerveau.

Résumé

Le plexus choroïde (ChP) sert de porte d’entrée essentielle pour l’infiltration des cellules immunitaires dans le système nerveux central (SNC) dans des conditions physiologiques et pathologiques. Des recherches récentes ont montré que la régulation de l’activité de la ChP peut offrir une protection contre les troubles du SNC. Cependant, il est difficile d’étudier la fonction biologique de la ChP sans affecter d’autres régions du cerveau en raison de sa structure délicate. Cette étude présente une nouvelle méthode d’inactivation des gènes dans les tissus ChP à l’aide de virus adéno-associés (AAV) ou d’une protéine recombinase de l’enzyme de recombinaison de cyclisation (Cre) constituée de la séquence TAT (CRE-TAT). Les résultats démontrent qu’après l’injection d’AAV ou de CRE-TAT dans le ventricule latéral, la fluorescence était exclusivement concentrée dans le ChP. En utilisant cette approche, l’étude a réussi à faire tomber le récepteur de l’adénosine A 2A (A_2A R) dans le ChP en utilisant l’interférence ARN (ARNi) ou Cre/locus des systèmes X-overP1 (Cre/LoxP), et a montré que ce knockdown pourrait atténuer la pathologie de l’encéphalomyélite auto-immune expérimentale (EAE). Cette technique pourrait avoir des implications importantes pour les recherches futures sur le rôle de la ChP dans les troubles du SNC.

Introduction

On a souvent pensé que le plexus choroïde (ChP) aidait à maintenir l’homéostasie fonctionnelle du cerveau en sécrétant du liquide céphalorachidien (LCR) et du facteur neurotrophique dérivé du cerveau (BDNF)^1,2. De plus en plus de recherches au cours des trois dernières décennies ont révélé que le ChP représente une voie distincte pour l’infiltration des cellules immunitaires dans le système nerveux central (SNC).

Les jonctions serrées (TJs) de la ChP, composées d’un épithélium ChP monocouche, maintiennent l’homéostasie immunologique en empêchant les macromolécules et les cellules immunitaires de pénétrer dans le cerveau³. Cependant, dans certaines conditions pathologiques, le tissu ChP détecte et réagit aux motifs moléculaires associés au danger (DAMP) dans le LCR et le sang, ce qui entraîne une infiltration immunitaire anormale et un dysfonctionnement cérébral ^4,5. Malgré son rôle essentiel, la petite taille de la ChP et son emplacement unique dans le cerveau rendent difficile l’étude de sa fonction sans affecter d’autres régions du cerveau. Par conséquent, la manipulation de l’expression des gènes spécifiquement dans la ChP est une approche idéale pour comprendre sa fonction.

Initialement, les lignées transgéniques de l’enzyme de recombinaison de cyclisation (Cre), qui expriment Cre sous le contrôle de promoteurs spécifiques aux gènes exprimés dans le ChP, étaient couramment utilisées pour supprimer des gènes cibles par croisement avec des gènes candidats floxés ^6,7,8. Par exemple, le facteur de transcription Forkhead box J1 (FoxJ1) est exclusivement exprimé dans l’épithélium ChP du cerveau prénatal de la souris⁷. Ainsi, la lignée FoxJ1-Cre a souvent été utilisée pour supprimer des gènes situés dans le ChP ^6,9. Cependant, le succès de cette stratégie repose en grande partie sur la spécificité du promoteur. On a progressivement découvert que le profil d’expression de FoxJ1 n’était pas assez distinctif, car FoxJ1 était également présent dans les cellules épithéliales ciliées dans d’autres parties du cerveau et du système périphérique⁷. Pour surmonter cette limitation, une injection intra-cérébroventriculaire (ICV) de Cre recombinase a été réalisée pour délivrer la recombinase dans les ventricules des lignées transgéniques floxées. Cette stratégie a montré une spécificité élevée, comme en témoigne la présence de fluorescence tdTomato uniquement dans le tissu ChP^10,11. Cependant, cette méthode est encore limitée par la disponibilité de lignées de souris transgéniques floxées. Pour résoudre ce problème, les chercheurs ont utilisé l’injection ICV de virus adéno-associé (AAV) pour obtenir le knockdown spécifique de la ChP ou la surexpression des gènes cibles^12,13. Une évaluation complète de différents sérotypes AAV pour l’infection à ChP a révélé que AAV2/5 et AAV2/8 présentent de fortes capacités d’infection dans le ChP, tout en n’infectant pas d’autres régions du cerveau. Cependant, AAV2/8 s’est avéré infecter l’épendyme entourant les ventricules, alors que le groupe AAV2/5 n’a montré aucune infection¹⁴. Cette méthode a l’avantage de s’affranchir des limites de l’acquisition d’animaux transgéniques floxés.

Cet article décrit un protocole étape par étape pour l’inactivation des gènes dans la ChP à l’aide de deux méthodes : ICV de l’AAV2/5 portant l’ARNsh du récepteur de l’adénosine A 2A (A 2A R) et la protéine de recombinase Cre constituée de la séquence TAT (CRE-TAT) recombinase pour obtenir une inhibition spécifique de la ChP de A_2A R. Les résultats de l’étude suggèrent que l’élimination de A_2AR dans le ChP peut atténuer l’encéphalomyélite auto-immune expérimentale (EAE). Ce protocole détaillé fournit des conseils utiles pour les études de la fonction ChP et l’inactivation spécifique des gènes dans la ChP.

Protocole

Toutes les procédures animales décrites dans cette étude ont été menées conformément aux directives décrites dans le Guide des NIH pour le soin et l’utilisation des animaux de laboratoire et approuvées par le Comité institutionnel de soins et d’utilisation des animaux de l’Université médicale de Wenzhou.

1. Animaux

1. Achetez des souris mâles C57BL/6 âgées de 8 à 12 semaines et pesant 20 à 22 g.
2. Obtenir la lignée de souris transgénique Rosa-LSL (Lox-StoP-Lox)-tdTomato (Ai9) et des souris mâles A_2AR flox^/flox .
3. Assignez au hasard les souris à deux groupes et logez-les dans des cages, avec un maximum de cinq souris par cage, selon un cycle standard de 12 h de lumière / 12 h d’obscurité pendant 1 semaine.
4. Fournissez aux souris suffisamment de nourriture et d’eau et maintenez-les à une température constante de 25 °C.

2. Knockdown spécifique à la ChP de A_2AR avec AAV2/5-shRNA

1. Pesez chaque souris et notez les valeurs.
2. Anesthésiez les souris par voie intrapéritonéale avec 1 % de pentobarbital sodique à une dose de 6 à 8 mL/kg équivalant à 60 à 80 mg/kg de pentobarbital, et placez la souris sur un coussin chauffant pour la garder au chaud.
   REMARQUE : Il est crucial d’administrer la dose correcte de pentobarbital sodique en fonction du poids de la souris pour assurer le succès de la chirurgie. L’anesthésie ne doit pas être trop profonde, car elle peut entraîner la mort, mais ne doit pas être trop superficielle, car la souris peut se réveiller pendant la procédure, ce qui peut affecter l’efficacité de l’injection du virus. Vérifiez la dose d’anesthésie appropriée en pinçant les orteils et en vous assurant que les souris ne répondent pas.
3. Utilisez un rasoir spécialisé pour couper les poils supérieurs des souris anesthésiées.
4. Appliquez une pommade oculaire sur les deux yeux pour éviter qu’ils ne se dessèchent et fixez les souris sur un appareil stéréotaxique pour immobiliser le cerveau. Couvrez l’animal d’un drap stérile.
5. Stérilisez soigneusement la peau de la tête et du cou des souris avec trois séries de désinfectant iodophore et d’alcool à 75% pour réduire l’infection postopératoire. Appliquez ensuite 1% de lidocaïne par voie topique sur le cuir chevelu des souris et faites une petite incision pour exposer complètement le crâne au microscope.
   REMARQUE : Utilisez des instruments stériles tout au long de la procédure.
6. Préparez deux seringues de 10 μL : l’une avec l’ARNh R AAV2/5-A_2Aacheté (titre : 6,27 × 10 9 vg/μL) et l’autre avec l’AAV2/5-Scramble acheté (titre : 6,21 × 10⁹ vg/μL).
   REMARQUE : Lors de l’utilisation de la seringue, l’extrémité avant doit être connectée à un capillaire en verre, et une plage de 10 μL peut être obtenue en contrôlant la longueur du capillaire en verre.
7. Utilisez le microscope pour localiser le bregma et le lambda et définissez le point de coordonnées (AP : -0,58 ; ML : ±1,10 ; DL : -2,20) sur la seringue de 10 μL (Figure 1). Le point de coordonnées est basé sur l’atlas stéréotaxique du cerveau de souris¹⁵.
8. Percez un petit trou dans le crâne au point de coordonnées ajusté.
   REMARQUE : Sous le microscope, le forage est effectué à l’aide d’une microperceuse stérile contre la surface du crâne. Après le forage, en enlevant les méninges recouvrant le cerveau et en exposant le parenchyme cérébral sous-jacent, on prévient les lésions des vaisseaux sanguins. Cette étape permet d’éviter que l’extrémité du capillaire en verre ne soit cassée par les méninges. Le diamètre du trou percé doit être suffisant pour permettre à la pointe de l’aiguille de pénétrer dans le tissu cérébral.
9. Administrer 2 μL de virus AAV2/5-A_2AR-shRNA dans le ventricule cérébral par injection latérale à un débit constant de 100 nL/min. Gardez l’aiguille en place pendant 10 minutes avant de la retirer. Il est à noter que le virus a été administré par injection unilatérale.
10. Scellez rapidement la peau blessée à l’aide de colle à biofibrine médicale pour éviter la perte de virus, qui peut être rincée avec du LCR après avoir retiré l’aiguille si la colle n’est pas appliquée rapidement. De plus, n’utilisez pas de cotons-tiges pour essuyer le LCR, car cela pourrait également entraîner une perte de virus.
11. Pour faciliter la récupération, placez la souris sur un coussin chauffant pour maintenir la température corporelle à 37,0 ± 0,5 °C, et appliquez 1% de lidocaïne par voie topique sur le cuir chevelu de la souris. Laissez les souris récupérer pendant 2 semaines avant d’induire le modèle EAE, car cette période est nécessaire à l’expression du virus AAV2/5-A 2A R-shRNA et à l’inactivation ultérieure de A_2AR.

3. Knockdown spécifique à la ChP de A_2AR avec un système Cre/locus de X-overP1 (Cre/LoxP)

REMARQUE : Les procédures suivantes peuvent être réalisées à l’aide de la méthode décrite précédemment. Reportez-vous aux étapes 2.1 à 2.11 pour connaître les méthodes d’injection détaillées.

1. Injecter 2 μL de CRE-TAT recombinase dans chaque ventricule latéral d’une souris Rosa-LSL (Lox-StoP-Lox)-tdTomato en tant que groupe expérimental et 2 μL de solution saline stérile tamponnée au phosphate (PBS) en tant que groupe témoin. En utilisant le même protocole que ci-dessus (section 2), injecter 2 μL de CRE-TAT recombinase dans chacun des ventricules latéraux de souris A_2AR flox^/flox avec 2 μL de PBS stérile comme groupe témoin.
2. Préparer les coupes de tissus congelés et effectuer la coloration nucléaire 2 semaines après l’injection de recombinase CRE-TAT. Reportez-vous aux étapes 4.1 à 4.3 pour plus d’informations.

4. Perfusion transcardique chez la souris

1. Administrer 60 à 80 mg/kg de pentobarbital sodique pour anesthésier en profondeur les souris. Confirmer le plan d’anesthésie par un pincement de l’orteil et effectuer une perfusion transcardique à l’aide de 40 mL de solution stérile de PBS suivie de 20 mL de paraformaldéhyde (PFA) à 4 %.
   REMARQUE : Une perfusion réussie est indiquée par une couleur blanche dans le foie, tandis que la présence de poumons hypertrophiés ou d’un écoulement PBS de la bouche pendant la perfusion suggère un échec de la procédure.
2. Extraire rapidement le cerveau de la souris, en assurant une dégradation minimale des protéines.
3. Immergez le cerveau de la souris dans 4 % de PFA/PBS pendant la nuit pour la post-fixation, puis remplacez-le par une solution de PB à 30 % de saccharose pendant 72 h.
   REMARQUE : Il est essentiel d’éviter une déshydratation excessive du tissu cérébral, de sorte que le cerveau ne doit pas être laissé trop longtemps dans la solution de saccharose PB.

5. Coupe et coloration des tissus congelés

1. Intégrez le cerveau de souris préalablement déshydraté dans de la colle à température de coupe optimale (OCT), congelez le cerveau intégré et utilisez un microtome coulissant pour découper des sections coronales d’une épaisseur de 20 μm.
2. Placez les sections cérébrales sur la lame de verre. Une fois que les sections du cerveau sont sèches, conservez-les dans un réfrigérateur à -20 °C pour les expériences ultérieures.
3. Placez chaque lame de verre dans un boîtier de cadre et plongez le cadre dans un récipient rempli de PBS pour rincer abondamment la lame. Rincez doucement les lames cérébrales avec la solution PBS trois fois, pendant 10 minutes à chaque fois.
   REMARQUE : Des précautions doivent être prises pour éviter que les sections du cerveau ne tombent de la lame de verre.
4. Colorer les lames cérébrales avec une solution de 4′,6-diamidino-2-phénylindole (DAPI) pendant 10 min.
5. Rincez les lames cérébrales avec une solution PBS pendant 5 min.
6. Appliquez une goutte de produit de montage anti-décoloration sur les sections du cerveau.
7. Placez une lamelle sur les sections du cerveau, scellez la lamelle avec du vernis à ongles et analysez les sections à l’aide d’un microscope à fluorescence conventionnel.

6. Induction de l’EAE

REMARQUE : Effectuer l’induction de l’EAE après 2 semaines d’injection de shRNA ou de CRE-TAT^{recombinase 11}.

1. Créez une solution aqueuse en mélangeant 2,5 mg de glycoprotéine oligodendrocytaire de myéline (MOG_35-55) avec 2 mL de PBS. Préparer une solution complète d’adjuvant de Freunds (CFA) en mélangeant M. tuberculosis (H37Ra) avec un adjuvant de Freunds incomplet (IFA).
2. Mélangez les solutions aqueuses et huileuses dans un rapport de 1 :1. Utilisez un tuyau en T pour fouetter le mélange jusqu’à ce qu’il soit huileux dans l’eau.
   REMARQUE : Le tuyau en T est également appelé tuyau à trois voies. Il s’agit d’un tube en plastique qui peut contrôler la direction de la solution qui s’écoule pour mélanger complètement le MOG_35-55 et le CFA.
3. Utilisez un homogénéisateur à grande vitesse pour fabriquer l’émulsion d’antigène MOG pour le modèle EAE dans des conditions de bain de glace.
4. Anesthésier les souris par voie intrapéritonéale avec 1 % de pentobarbital sodique à une dose de 6 à 8 mL/kg équivalant à 60 à 80 mg/kg de pentobarbital.
5. Injecter par voie sous-cutanée l’émulsion d’antigène MOG en quatre points différents (cou, dos, hanches gauche et droite) à raison d’un volume de 10 mL/kg pour un total de quatre injections chacune.
   REMARQUE : Il est important de choisir soigneusement le site d’injection, car différents sites peuvent avoir des effets variables sur la morbidité et la mortalité des souris. De plus, les injections répétées de MOG peuvent entraîner une tolérance immunitaire, de sorte que l’équipe de recherche a choisi une seule méthode d’injection pour prévenir ce problème potentiel.
6. Injecter immédiatement 500 ng/mL de toxine coqueluche (TP) par voie intrapéritonéale à une dose de 5 mg/kg après l’injection de MOG.
   REMARQUE : Le ressuage augmente la perméabilité de la barrière hémato-encéphalique (BHE) et facilite l’infiltration des lymphocytes T dans le cerveau.
7. Après 48 h, injecter la solution de ressuage par voie intrapéritonéale au même volume.

7. Score de déficit neurologique

1. Évaluez et notez quotidiennement les souris à l’aide d’une échelle d’évaluation¹⁶ allant de 0 à 15 pour évaluer l’incidence et la gravité de l’EAE en fonction des déficits neurologiques suivants :
   Queue : 0 indique qu’il n’y a aucun signe, 1 représente une queue à moitié paralysée et 2 indique une queue complètement paralysée.
   Membres : 0 indique l’absence de signes, 1 représente une démarche faible ou altérée, 2 indique une parésie et 3 représente un membre complètement paralysé.
2. Attribuez un score de 12 à un animal tétraplégique atteint d’une paralysie complète et un score de 15 à la mortalité.

8. Coloration à l’hématoxyline-éosine (H&E)

1. Prenez le cerveau de souris déshydraté et incorporez-le dans de la paraffine fondue. Laissez le bloc de paraffine refroidir et se solidifier pour une utilisation ultérieure.
   REMARQUE : Le bloc de paraffine doit être complètement sec et frais pour éviter d’endommager les tissus.
2. Coupez le bloc de paraffine du cerveau de souris en lames de 5 μm d’épaisseur. Placez la section de cerveau de souris en paraffine sur une lame de verre et séchez-la dans un four à 60 °C pendant 3 h.
3. Immergez les lames séquentiellement dans la solution de xylène I pendant 10 min, la solution de xylène II pendant 10 min, l’alcool 100 % I pendant 3 min, l’alcool 100 % II pendant 3 min, l’alcool à 95 % pendant 3 min, l’alcool à 90 % pendant 3 min, l’alcool à 80 % pendant 3 min, l’alcool à 70 % pendant 3 min et l’eau distillée pendant 1 min.

9. Analyse quantitative de réaction en chaîne par polymérase (qPCR)

1. Après avoir perfusé les souris avec du PBS, retirez le ChP des ventricules et extrayez l’ARN avec Trizol. Synthétisez l’ADNc à l’aide du premier kit de synthèse d’ADNc Strand.
2. Effectuez une analyse qPCR à l’aide du prémélange Ex Taq SYBR-green et d’un système de PCR en temps réel. Utilisez les amorces A_2AR suivantes : vers l’avant - GCCATCCCATTCGCCATCA ; revers - GCAATAGCCAAGAGGCTGAAGA.

Résultats

Knockdown A_2AR spécifique à la ChP par injection ICV d’AAV2/5-shRNA ou de CRE-TAT
Le rôle de A_2AR dans la ChP en tant que puissant régulateur de l’information neuronale dans la pathogenèse de l’EAE reste incertain. L’inhibition de l’expression A 2A R spécifique de la ChP pourrait fairela lumière sur les effets régulateurs de l’A_2AR sur le système immunitaire central dans l’EAE et d’autres inflammations du système nerveux. Cette étu...

Discussion

La recherche a présenté deux approches distinctes pour l’inactivation ciblée des gènes ChP. La première approche a consisté en l’injection ICV de CRE-TAT, qui contient de la Cre recombinase, dans des souris A_2AR^flox/flox. La deuxième approche a consisté en l’injection d’AAV2/5 dans l’ICV portant l’ARNh de A_2AR. En utilisant ces deux stratégies, le travail a permis d’obtenir l’inhibition sélective de A 2A R dans le CHP et a pu démontrer les effets protecteurs de ...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
A2ARflox/flox mice	State Key Laboratory of Ophthalmology, Optometry and Visual Science, Wenzhou Medical University
AAV2/5-A2AR-ShRNA virus	Shanghai Heyuan Biotechnology Co. LTD	pt-4828
antifade mounting medium	Beyotime Biotechnology	0100-01
borosilicate glass capillary	Beijing Meiyaxian Technology Co. Ltd	B100-50-10
brain stereotaxic apparatus	RWD, Shenzhen	69100
C57BL/6 mice	Beijing Vital Charles River Laboratory Animal Technology Company
CRE-TAT recombinase	Millipore	SCR508
DAPI	Absin	B25A031
frozen slicing machine	Leica	CM1950
H37Ra	Becton Dickinson and company	231141
Hamilton syringe	Hamilton, American	P/N: 86259
Incomplete Freunds adjuvant	Sigma	F5506
Laser confocal microscope	Zeiss	LSM900
MOG35-55	Suzhou Qiangyao Biotechnology Co., LTD	4010006243
OCT glue	Epredia	6502p
paraformaldehyde	Chengdu Kelong Chemical Reagent Company	30525-89-4
pentobarbital sodium	Boyun Biotech	PC13003
Pipette gun	Eppendorf	N45014F
PrimeScript 1st Strand cDNA Synthesis Kit	Takara	6110A
Real- Time PCR System	BioRad	CFX96
Rosa-LSL (Lox-StoP-Lox)-tdTomato mice	Jackson Laboratory
sucrose	Sangon Biotech	A502792-0500
super high speed homogenizer	IKA	3737025
Trizol	Invitrogen	15596026
xylene solution	Chengdu Kelong Chemical Reagent Company	1330-20-7