Направленный нокдаун генов в сосудистом сплетении

Резюме

В этой статье мы опишем метод избирательного изменения экспрессии генов в сосудистом сплетении, избегая при этом какого-либо воздействия на другие области мозга.

Аннотация

Сосудистое сплетение (ЧП) служит важнейшими воротами для инфильтрации иммунных клеток в центральную нервную систему (ЦНС) как при физиологических, так и при патологических состояниях. Недавние исследования показали, что регуляция активности ChP может обеспечить защиту от заболеваний ЦНС. Тем не менее, изучение биологической функции ChP, не затрагивая другие области мозга, является сложной задачей из-за его тонкой структуры. В этом исследовании представлен новый метод нокдауна генов в тканях ChP с использованием аденоассоциированных вирусов (AAV) или белка рекомбиназы фермента циклизации (Cre), состоящего из последовательности TAT (CRE-TAT). Результаты показывают, что после введения AAV или CRE-TAT в боковой желудочек флуоресценция концентрировалась исключительно в ChP. Используя этот подход, исследование успешно сбило рецептор аденозина_А2А (A_2AR) в ChP с помощью РНК-интерференции (РНК-интерференции) или Cre/локуса систем X-overP1 (Cre/LoxP) и показало, что этот нокдаун может облегчить патологию экспериментального аутоиммунного энцефаломиелита (ЭАЭ). Этот метод может иметь важное значение для будущих исследований роли ChP в заболеваниях ЦНС.

Введение

Часто считалось, что сосудистое сплетение помогает поддерживать функциональный гомеостаз мозга за счет секреции спинномозговой жидкости (ликвора) и нейротрофического фактора головного мозга (BDNF)^1,2. Растущее количество исследований за последние три десятилетия показало, что ChP представляет собой особый путь инфильтрации иммунных клеток в центральную нервную систему (ЦНС).

Плотные соединения (ТЖ) ChP, состоящие из монослойного эпителия ChP, поддерживают иммунологический гомеостаз, предотвращая проникновение макромолекул и иммунных клеток в мозг³. Однако при определенных патологических состояниях ткань ChP обнаруживает и реагирует на опасные молекулярные паттерны (DAMPs) в ликворе и крови, что приводит к аномальной иммунной инфильтрации и дисфункции мозга ^4,5. Несмотря на его важнейшую роль, небольшой размер ChP и уникальное расположение в мозге затрудняют изучение его функции, не затрагивая другие области мозга. Таким образом, манипулирование экспрессией генов именно в ChP является идеальным подходом к пониманию его функции.

Первоначально трансгенные линии фермента циклизационной рекомбинации (Cre), экспрессирующие Cre под контролем промоторов, специфичных для генов, экспрессируемых в ChP, обычно использовались для удаления генов-мишеней путем скрещивания с флоксированными генами-кандидатами ^6,7,8. Например, транскрипционный фактор Forkhead box J1 (FoxJ1) экспрессируется исключительно в эпителии ChP пренатального мозга мыши⁷. Так, линия FoxJ1-Cre часто использовалась для удаления генов, расположенных в ChP ^6,9. Однако успех этой стратегии в значительной степени зависит от специфики промоутера. Постепенно было обнаружено, что паттерн экспрессии FoxJ1 был недостаточно отчетливым, поскольку FoxJ1 также присутствовал в реснитчатых эпителиальных клетках в других частях мозга и периферической системы⁷. Для преодоления этого ограничения была проведена интрацеребровентрикулярная (ИКВ) инъекция Cre-рекомбиназы для доставки рекомбиназы в желудочки флоксированных трансгенных линий. Данная стратегия показала высокую специфичность, о чем свидетельствует наличие флуоресценции tdTomato исключительно в ткани ChP^10,11. Однако этот метод все еще ограничен наличием флоксированных трансгенных линий мышей. Чтобы решить эту проблему, исследователи использовали ICV-инъекцию аденоассоциированного вируса (AAV) для достижения ChP-специфического нокдауна или гиперэкспрессии генов-мишеней^12,13. Комплексная оценка различных серотипов AAV на ChP-инфекцию показала, что AAV2/5 и AAV2/8 проявляют сильные инфекционные способности в ChP, не инфицируя при этом другие области мозга. Тем не менее, было обнаружено, что AAV2/8 инфицирует окружающие эпендиму желудочки, в то время как группа AAV2/5 не показала инфекции¹⁴. Преимущество этого метода заключается в преодолении ограничений, связанных с приобретением флоксированных трансгенных животных.

В данной статье описан пошаговый протокол нокдауна гена в ChP с использованием двух методов: ICV AAV2/5, несущей шРНК рецептора аденозина А2А (_А2А R) и белкаCre-рекомбиназы, состоящего из последовательности ТАТ (CRE-TAT) рекомбиназы для достижения ChP-специфического нокдауна A_2AR. Результаты исследования свидетельствуют о том, что сбивание A_2AR в ChP может облегчить экспериментальный аутоиммунный энцефаломиелит (ЭАЭ). Этот подробный протокол содержит полезные рекомендации для изучения функции ChP и специфического нокдауна генов в ChP.

протокол

Все процедуры с животными, описанные в этом исследовании, были проведены в соответствии с рекомендациями, изложенными в Руководстве NIH по уходу и использованию лабораторных животных и одобренными Комитетом по уходу и использованию животных в Медицинском университете Вэньчжоу.

1. Животные

1. Приобретите самцов мышей C57BL/6 в возрасте 8-12 недель и весом 20-22 г.
2. Получена трансгенная линия мышей Rosa-LSL (Lox-StoP-Lox)-tdTomato (Ai9) и самцы мышей A_2AR flox^/flox .
3. Случайным образом распределите мышей по двум группам и поместите их в клетки, максимум пять мышей в клетку, в соответствии со стандартным циклом 12 часов света / 12 часов темноты в течение 1 недели.
4. Обеспечьте мышей достаточным количеством пищи и воды и поддерживайте их постоянную температуру 25 °C.

2. ChP-специфический нокдаун A _2ARs с AAV2/5-шРНК

1. Взвесьте каждую мышку и запишите значения.
2. Обезболивайте мышей внутрибрюшинно 1% пентобарбиталом натрия в дозировке 6-8 мл/кг, что эквивалентно 60-80 мг/кг пентобарбитала, и поместите мышь на грелку, чтобы она оставалась теплой.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Очень важно ввести правильную дозировку пентобарбитала натрия в соответствии с весом мыши, чтобы обеспечить успешную операцию. Анестезия не должна быть слишком глубокой, так как это может привести к летальному исходу, но и не должна быть слишком поверхностной, так как мышь может проснуться во время процедуры, что потенциально повлияет на эффективность инъекции вируса. Проверьте правильную дозу анестезии, ущипнув палец ноги и убедившись, что мыши не реагируют.
3. Используйте специализированную бритву для мышей, чтобы подстричь верхние волосы мышей, находящихся под наркозом.
4. Нанесите глазную мазь на оба глаза, чтобы предотвратить высыхание, и зафиксируйте мышей на стереотаксическом аппарате, чтобы обездвижить мозг. Накройте животное стерильной простыней.
5. Тщательно простерилизуйте кожу головы и шеи мышей тремя циклами йодофорного дезинфицирующего средства и 75% спирта, чтобы уменьшить послеоперационную инфекцию. Затем нанесите 1% лидокаин местно на кожу головы мышей и сделайте небольшой разрез, чтобы полностью обнажить череп под микроскопом.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте стерильные инструменты на протяжении всей процедуры.
6. Подготовьте два шприца по 10 мкл: один с приобретенной AAV2/5-A_2AR-shRNA (титр: 6,27 × 10 9 vg/мкл), а другой с приобретенным AAV2/5-Scramble (титр: 6,21 × 10⁹ vg/мкл).
   ПРИМЕЧАНИЕ: При использовании шприца передний конец должен быть подключен к стеклянному капилляру, и диапазон 10 мкл можно получить, контролируя длину стеклянного капилляра.
7. С помощью микроскопа найдите брегму и лямбду и установите координатную точку (AP: -0,58; ML: ±1.10; DL: -2,20) на шприце объемом 10 мкл (рис. 1). Координатная точка основана на стереотаксическом атласе мозга мыши¹⁵.
8. Просверлите небольшое отверстие в черепе в скорректированной координатной точке.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Под микроскопом сверление выполняется стерильным микросверлом по поверхности черепа. После бурения, удаляя мозговые оболочки, покрывающие мозг, и обнажая нижележащую паренхиму мозга, предотвращается травмирование кровеносных сосудов. Этот шаг предотвращает разрыв кончика стеклянного капилляра мозговыми оболочками. Диаметр просверленного отверстия должен быть достаточным для того, чтобы кончик иглы мог войти в ткани мозга.
9. Ввести 2 мкл вируса AAV2/5-A_2AR-shRNA в желудочек головного мозга путем боковой инъекции с постоянной скоростью 100 нл/мин. Держите иглу на месте в течение 10 минут перед извлечением. Отметим, что вирус вводился путем односторонней инъекции.
10. Своевременно загерметизируйте поврежденную кожу с помощью медицинского биофибринового клея, чтобы предотвратить потерю вируса, который можно смыть спинномозговой жидкостью после удаления иглы, если клей не наносится быстро. Кроме того, не используйте ватные палочки для протирания ликвора, так как это также может привести к потере вируса.
11. Чтобы облегчить восстановление, поместите мышь на грелку, чтобы поддерживать температуру тела на уровне 37,0 ± 0,5 °C, и нанесите 1% лидокаин местно на кожу головы мыши. Дайте мышам восстановиться в течение 2 недель, прежде чем индуцировать модель EAE, так как этот период необходим для экспрессии вируса AAV2/5-A 2A R-shRNA и последующего нокдауна A_2AR.

3. ChP-специфичный нокдаун A _2AR с Cre/локусом системы X-overP1 (Cre/LoxP)

ПРИМЕЧАНИЕ: Следующие процедуры могут быть выполнены с помощью метода, описанного выше. Подробные методы впрыска см. в шагах 2.1-2.11.

1. Ввести 2 мкл рекомбиназы CRE-TAT в каждый боковой желудочек мыши Rosa-LSL (Lox-StoP-Lox)-tdTomato в качестве экспериментальной группы и 2 мкл стерильного фосфатно-солевого буфера (PBS) в качестве контрольной группы. Используя тот же протокол, что и выше (раздел 2), введите 2 мкл рекомбиназы CRE-TAT в каждый из боковых желудочков мышей типа A_2AR flox^/flox вместе с 2 мкл стерильного PBS в качестве контрольной группы.
2. Подготовьте замороженные срезы тканей и проведите ядерное окрашивание через 2 недели после инъекции рекомбиназы CRE-TAT. Дополнительные сведения см. в шагах 4.1-4.3.

4. Транскардиальная перфузия у мышей

1. Вводят 60-80 мг/кг пентобарбитала натрия для глубокой анестезии мышей. Подтвердите плоскость анестезии щипком пальца ноги и выполните транскардиальную перфузию с использованием 40 мл стерильного раствора PBS с последующим введением 20 мл 4% параформальдегида (PFA).
   ПРИМЕЧАНИЕ: На успешную перфузию указывает белый цвет печени, в то время как наличие увеличенных легких или оттока PBS изо рта во время перфузии указывает на неудачу процедуры.
2. Быстро извлекают мозг мыши, обеспечивая минимальную деградацию белка.
3. Погрузите мозг мыши в 4% PFA/PBS на ночь для постфиксации с последующей заменой на 30% раствор сахарозы PB на 72 часа.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Очень важно избегать чрезмерного обезвоживания мозговой ткани, поэтому мозг не следует оставлять в растворе сахарозы PB слишком долго.

5. Срезы и окрашивание замороженных тканей

1. Поместите ранее обезвоженный мозг мыши в клей с оптимальной температурой резки (OCT), заморозьте встроенный мозг и используйте скользящий микротом для вырезания корональных срезов толщиной 20 мкм.
2. Поместите срезы мозга на предметное стекло. Как только срезы мозга высохнут, храните их в холодильнике при температуре -20 °C для последующих экспериментов.
3. Поместите каждое предметное стекло в футляр и погрузите раму в контейнер, наполненный PBS, чтобы тщательно промыть предметное стекло. Аккуратно промойте предметные стекла раствором PBS три раза, каждый раз в течение 10 минут.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Следует соблюдать осторожность, чтобы предотвратить падение участков мозга со предметного стекла.
4. Окрасьте предметные стекла головного мозга раствором 4',6-диамидино-2-фенилиндола (DAPI) в течение 10 мин.
5. Промыть предметные стекла мозга раствором PBS в течение 5 мин.
6. Нанесите одну каплю монтирующего средства против затухания на участки мозга.
7. Поместите покровное стекло на срезы мозга, запечатайте его лаком для ногтей и проанализируйте срезы с помощью обычного флуоресцентного микроскопа.

6. Индукция ЭАЭ

ПРИМЕЧАНИЕ: Выполняйте индукцию ЭАЭ через 2 недели после инъекции шРНК или CRE-TAT рекомбиназы¹¹.

1. Создают водный раствор, смешивая 2,5 мг гликопротеина олигодендроцитов миелина (MOG_35-55) с 2 мл PBS. Приготовьте полный масляный раствор адъюванта Фройнда (CFA), смешав M. tuberculosis (H37Ra) с неполным адъювантом Freunds (IFA).
2. Смешайте водный и масляный растворы в соотношении 1:1. Используйте тройник, чтобы взбить смесь до состояния масла в воде.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Тройник также называется трехходовой трубой. Это пластиковая трубка, которая может контролировать направление потока раствора для полного смешивания MOG_35-55 и CFA.
3. Используйте высокоскоростной гомогенизатор для приготовления эмульсии антигена MOG для модели EAE в условиях ледяной бани.
4. Обезболивают мышей внутрибрюшинно 1% пентобарбиталом натрия в дозировке 6-8 мл/кг, что эквивалентно 60-80 мг/кг пентобарбитала.
5. Подкожно ввести эмульсию с антигеном MOG в четыре разные точки (шея, спина, левое и правое бедра) в объеме 10 мл/кг, всего четыре инъекции каждая.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Важно тщательно выбирать место инъекции, так как разные места могут по-разному влиять на заболеваемость и смертность мышей. Кроме того, повторные инъекции MOG могут привести к иммунной толерантности, поэтому исследовательская группа выбрала один метод инъекции, чтобы предотвратить эту потенциальную проблему.
6. Немедленно ввести 500 нг/мл коклюшного токсина (ПТ) внутрибрюшинно в дозировке 5 мг/кг после инъекции MOG.
   ПРИМЕЧАНИЕ: ПТ повышает проницаемость гематоэнцефалического барьера (ГЭБ) и облегчает инфильтрацию Т-клеток в мозг.
7. Через 48 ч внутрибрюшинно вводят раствор ПТ в том же объеме.

7. Оценка неврологического дефицита

1. Ежедневно оценивайте и оценивайте мышей по оценочной шкале 16 в диапазоне от 0 до¹⁵ для оценки частоты и тяжести ЭАЭ в соответствии со следующими неврологическими дефицитами:
   Хвост: 0 указывает на отсутствие признаков, 1 означает полупарализованный хвост, а 2 указывает на полностью парализованный хвост.
   Конечности: 0 указывает на отсутствие признаков, 1 означает слабую или измененную походку, 2 указывает на парез и 3 означает полностью парализованную конечность.
2. Присвойте парализованному животному, имеющему полный паралич, 12 баллов, а смертность — 15 баллов.

8. Окрашивание гематоксилин-эозином (H&E)

1. Возьмите обезвоженный мышиный мозг и поместите его в расплавленный парафин. Дайте парафиновому блоку остыть и затвердеть для последующего использования.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Парафиновый блок должен быть полностью сухим и прохладным, чтобы избежать повреждения тканей.
2. Разрежьте блок парафина мозга мыши на предметные стекла толщиной 5 мкм. Поместите парафиновый срез мышиного мозга на предметное стекло и высушите его в духовке при температуре 60 °C в течение 3 часов.
3. Погружают предметные стекла последовательно в раствор ксилола I на 10 мин, раствор ксилола II на 10 мин, 100% спирт I на 3 мин, 100% спирт II на 3 мин, 95% спирт на 3 мин, 90% спирт на 3 мин, 80% спирт на 3 мин, 70% спирт на 3 мин и дистиллированную воду на 1 мин.

9. Количественный анализ полимеразной цепной реакции (кПЦР)

1. После перфузии мышей ПБС удаляют ЧП из желудочков и выделяют РНК с помощью Тризола. Синтезируйте кДНК с помощью первого набора для синтеза цепной кДНК.
2. Проведите qPCR-анализ с использованием премикса Ex Taq SYBR-green и системы ПЦР в режиме реального времени. Используйте следующие грунтовки A_2AR: форвард - GCCATCCCATTCGCCATCA; реверс - GCAATAGCCAAGAGGCTGAAGA.

Результаты

ChP-специфичный нокдаун A_2AR путем ICV-инъекции AAV2/5-shRNA или CRE-TAT
Роль_А2АР в ЧП как мощного регулятора нейронной информации в патогенезе ЭАЭ остается неясной. Подавление экспрессии ChP-специфичного A 2A R может пролить свет на регуляторные эффекты A_2AR на центральную им...

Обсуждение

В исследовании были представлены два различных подхода к направленному нокдауну генов ChP. Первый подход включал в себя ICV-инъекцию CRE-TAT, содержащей Cre-рекомбиназу, мышам линии A_2AR flox^/flox . Второй подход заключался в введении ICV AAV2/5, несущей шРНК_A2AR. _{Используя}эти две ст?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
A2ARflox/flox mice	State Key Laboratory of Ophthalmology, Optometry and Visual Science, Wenzhou Medical University
AAV2/5-A2AR-ShRNA virus	Shanghai Heyuan Biotechnology Co. LTD	pt-4828
antifade mounting medium	Beyotime Biotechnology	0100-01
borosilicate glass capillary	Beijing Meiyaxian Technology Co. Ltd	B100-50-10
brain stereotaxic apparatus	RWD, Shenzhen	69100
C57BL/6 mice	Beijing Vital Charles River Laboratory Animal Technology Company
CRE-TAT recombinase	Millipore	SCR508
DAPI	Absin	B25A031
frozen slicing machine	Leica	CM1950
H37Ra	Becton Dickinson and company	231141
Hamilton syringe	Hamilton, American	P/N: 86259
Incomplete Freunds adjuvant	Sigma	F5506
Laser confocal microscope	Zeiss	LSM900
MOG35-55	Suzhou Qiangyao Biotechnology Co., LTD	4010006243
OCT glue	Epredia	6502p
paraformaldehyde	Chengdu Kelong Chemical Reagent Company	30525-89-4
pentobarbital sodium	Boyun Biotech	PC13003
Pipette gun	Eppendorf	N45014F
PrimeScript 1st Strand cDNA Synthesis Kit	Takara	6110A
Real- Time PCR System	BioRad	CFX96
Rosa-LSL (Lox-StoP-Lox)-tdTomato mice	Jackson Laboratory
sucrose	Sangon Biotech	A502792-0500
super high speed homogenizer	IKA	3737025
Trizol	Invitrogen	15596026
xylene solution	Chengdu Kelong Chemical Reagent Company	1330-20-7