Knockdown direcionado de genes no plexo coroide

Resumo

Aqui, descrevemos um método para alterar seletivamente a expressão gênica no plexo coroide, evitando qualquer impacto em outras áreas cerebrais.

Resumo

O plexo coroide (PCh) serve como uma porta de entrada crítica para a infiltração de células imunes no sistema nervoso central (SNC) em condições fisiológicas e patológicas. Pesquisas recentes mostraram que regular a atividade da ChP pode oferecer proteção contra distúrbios do SNC. No entanto, estudar a função biológica da ChP sem afetar outras regiões cerebrais é um desafio devido à sua estrutura delicada. Este estudo apresenta um novo método para knockdown gênico em tecido ChP usando vírus adenoassociados (AAVs) ou enzima de recombinação de ciclização (Cre) proteína recombinase consistindo de sequência TAT (CRE-TAT). Os resultados demonstram que, após a injeção de AAV ou CRE-TAT no ventrículo lateral, a fluorescência foi concentrada exclusivamente na ChP. Usando esta abordagem, o estudo derrubou com sucesso o receptor de adenosina A 2A (A_2A R) na ChP usando RNA de interferência (RNAi) ou Cre/locus de sistemas X-overP1 (Cre/LoxP), e mostrou que esse knockdown poderia aliviar a patologia da encefalomielite autoimune experimental (EAE). Essa técnica pode ter implicações importantes para pesquisas futuras sobre o papel da ChP nos distúrbios do SNC.

Introdução

Acreditava-se que o plexo coroide (PCc) ajudava a manter a homeostase funcional do cérebro por meio da secreção de líquido cefalorraquidiano (LCR) e fator neurotrófico derivado do cérebro (BDNF)^1,2. Pesquisas crescentes nas últimas três décadas têm revelado que a ChP representa uma via distinta para a infiltração de células imunes no sistema nervoso central (SNC).

As tight junctions (TJs) da ChP, compostas por um epitélio de ChP monocamada, mantêm a homeostase imunológica, impedindo a entrada de macromoléculas e células imunes no cérebro³. No entanto, sob certas condições patológicas, o tecido ChP detecta e responde a padrões moleculares associados ao perigo (DAMPs) no LCR e no sangue, levando a infiltração imunológica anormal e disfunção cerebral ^4,5. Apesar de seu papel crítico, o pequeno tamanho da ChP e a localização única no cérebro dificultam o estudo de sua função sem afetar outras regiões cerebrais. Portanto, manipular a expressão gênica especificamente na ChP é uma abordagem ideal para entender sua função.

Inicialmente, linhagens transgênicas da enzima de recombinação de ciclização (Cre), que expressam Cre sob o controle de promotores específicos de genes expressos na ChP, foram comumente utilizadas para deletar genes-alvo por meio de cruzamento com genes candidatos floxados ^6,7,8. Por exemplo, o fator de transcrição Forkhead box J1 (FoxJ1) é expresso exclusivamente no epitélio ChP do cérebro pré-natal de camundongos⁷. Assim, a linhagem FoxJ1-Cre foi frequentemente utilizada para deletar genes localizados na ChP ^6,9. No entanto, o sucesso desta estratégia depende muito da especificidade do promotor. Descobriu-se gradualmente que o padrão de expressão de FoxJ1 não era suficientemente distinto, pois FoxJ1 também estava presente em células epiteliais ciliadas em outras partes do cérebro e sistema periférico⁷. Para superar essa limitação, foi realizada injeção intracerebroventricular (ICV) de Cre recombinase para liberar a recombinase nos ventrículos das linhas transgênicas floxed. Essa estratégia apresentou alta especificidade, evidenciada pela presença de fluorescência do tdTomato apenas no tecido da^ChP10,11. No entanto, este método ainda é limitado pela disponibilidade de linhagens de camundongos transgênicos floxed. Para resolver essa questão, pesquisadores têm empregado a injeção de ICV de vírus adenoassociado (AAV) para alcançar knockdown específico de ChP ou a superexpressão de genes-alvo^12,13. Uma avaliação abrangente de diferentes sorotipos de AAV para infecção por ChP revelou que AAV2/5 e AAV2/8 exibem fortes habilidades de infecção na ChP, enquanto não infectam outras regiões cerebrais. No entanto, AAV2/8 infectou o ependima ao redor dos ventrículos, enquanto o grupo AAV2/5 não apresentou infecção¹⁴. Este método tem a vantagem de superar as limitações da aquisição de animais transgênicos floxed.

Este artigo descreve um protocolo passo-a-passo para knockdown gênico na ChP usando dois métodos: ICV de AAV2/5 carregando shRNA do receptor de adenosina A 2A (A 2A R) e proteína Cre recombinase consistindo de sequência TAT (CRE-TAT) recombinase para alcançar knockdown ChP-específico de A_2A R. Os resultados do estudo sugerem que derrubar A_2AR na ChP pode aliviar a encefalomielite autoimune experimental (EAE). Este protocolo detalhado fornece orientação útil para estudos da função ChP e knockdown específico de genes na ChP.

Protocolo

Todos os procedimentos em animais descritos neste estudo foram conduzidos de acordo com as diretrizes descritas no Guia do NIH para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório e aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da Universidade Médica de Wenzhou.

1. Animais

1. Compre camundongos C57BL/6 machos com idade entre 8-12 semanas e pesando 20-22 g.
2. Obter a linhagem transgênica Rosa-LSL (Lox-StoP-Lox)-tdTomato (Ai9) e camundongos machos A_2AR^flox/fox .
3. Atribua aleatoriamente os camundongos a dois grupos e aloja-se em gaiolas, com um máximo de cinco camundongos por gaiola, sob um ciclo padrão de 12 h claro/12 h escuro por 1 semana.
4. Fornecer aos ratos comida e água suficientes e mantê-los a uma temperatura constante a 25 °C.

2. Knockdown específico de ChP de A_2ARs com AAV2/5-shRNA

1. Pese cada mouse e anote os valores.
2. Anestesiar os camundongos por via intraperitoneal com pentobarbital sódico a 1% na dose de 6-8 mL/kg equivalente a 60-80 mg/kg de pentobarbital e colocar o mouse em uma almofada de aquecimento para mantê-lo aquecido.
   NOTA: É crucial administrar a dosagem correta de pentobarbital sódico de acordo com o peso do rato para garantir o sucesso da cirurgia. A anestesia não deve ser muito profunda, pois pode resultar em mortalidade, mas não deve ser muito superficial, pois o camundongo pode acordar durante o procedimento, potencialmente afetando a eficácia da injeção do vírus. Verifique a dose adequada de anestesia por pinça dos dedos dos pés e certifique-se de que os ratos não respondem.
3. Use um barbeador de rato especializado para aparar o cabelo superior dos ratos anestesiados.
4. Aplique pomada ocular em ambos os olhos para evitar o ressecamento e fixe os ratos em um aparelho estereotáxico para imobilizar o cérebro. Cubra o animal com um campo estéril.
5. Esterilize completamente a pele da cabeça e pescoço dos ratos com três rodadas de desinfetante iodóforo e álcool a 75% para reduzir a infecção pós-operatória. Em seguida, aplique lidocaína a 1% topicamente no couro cabeludo de camundongos e faça uma pequena incisão para expor totalmente o crânio sob um microscópio.
   OBS: Utilizar instrumentos estéreis durante todo o procedimento.
6. Preparar duas seringas de 10 μL: uma com AAV2/5-A 2A R-shRNA comprado (título: 6,27 × 10⁹ vg/μL) e outra com AAV2/5-Scramble comprado (título:_6,21× 10⁹ vg/μL).
   NOTA: Ao usar a seringa, a extremidade frontal precisa ser conectada a um capilar de vidro, e uma faixa de 10 μL pode ser obtida controlando o comprimento do capilar de vidro.
7. Utilizar o microscópio para localizar o bregma e lambda e definir o ponto de coordenadas (AP: -0,58; LM: ±1,10; DL: -2,20) na seringa de 10 μL (Figura 1). O ponto coordenado é baseado no atlas estereotáxico cerebral de camundongos¹⁵.
8. Faça um pequeno orifício no crânio no ponto de coordenada ajustado.
   NOTA: Sob o microscópio, a perfuração é realizada usando uma microbroca estéril contra a superfície do crânio. Após a perfuração, removendo as meninges que cobrem o cérebro e expondo o parênquima cerebral subjacente, a lesão nos vasos sanguíneos é evitada. Essa etapa evita que a ponta do capilar de vidro seja quebrada pelas meninges. O diâmetro do orifício perfurado deve ser suficiente para permitir que a ponta da agulha entre no tecido cerebral.
9. Administrar 2 μL do vírus AAV2/5-A_2AR-shRNA no ventrículo cerebral através de injeção lateral a uma taxa constante de 100 nL/min. Mantenha a agulha no lugar por 10 minutos antes de retirar. Note-se que o vírus foi administrado com injeção unilateral.
10. Sele a pele lesionada usando cola de biofibrina médica imediatamente para evitar a perda de vírus, que pode ser enxaguado com LCR depois de remover a agulha se a cola não for aplicada rapidamente. Além disso, não use cotonetes para limpar o LCR, pois também pode causar perda de vírus.
11. Para facilitar a recuperação, coloque o mouse em uma almofada de aquecimento para manter a temperatura corporal em 37,0 ± 0,5 °C e aplique lidocaína a 1% topicamente no couro cabeludo do mouse. Permitir que os camundongos se recuperem por 2 semanas antes de induzir o modelo EAE, pois esse período é necessário para a expressão do vírus AAV2/5-A_2AR-shRNA e subsequente knockdown A_2AR.

3. Knockdown específico de ChP de A_2AR com um Cre/locus do sistema X-overP1 (Cre/LoxP)

Observação : os procedimentos a seguir podem ser obtidos usando o método descrito anteriormente. Consulte os passos 2.1-2.11 para obter métodos de injeção detalhados.

1. Injetar 2 μL de CRE-TAT recombinase em cada ventrículo lateral de um camundongo Rosa-LSL (Lox-StoP-Lox)-tdTomato como grupo experimental e 2 μL de solução salina tamponada com fosfato estéril (PBS) como grupo controle. Usando o mesmo protocolo acima (seção 2), injete 2 μL de CRE-TAT recombinase em cada um dos ventrículos laterais de camundongos A_2AR flox^/flox juntamente com 2 μL de PBS estéril como grupo controle.
2. Preparar cortes de tecido congelado e realizar coloração nuclear 2 semanas após a injeção de CRE-TAT recombinase. Consulte as etapas 4.1-4.3 para obter mais informações.

4. Perfusão transcárdica em camundongos

1. Administrar 60-80 mg/kg de pentobarbital sódico para anestesiar profundamente os camundongos. Confirmar o plano de anestesia por uma pinça dos dedos dos pés e realizar a perfusão transcárdica usando 40 mL de solução estéril de PBS seguida de 20 mL de paraformaldeído (PFA) a 4%.
   NOTA: A perfusão bem-sucedida é indicada por uma cor branca no fígado, enquanto a presença de pulmões aumentados ou saída de PBS da boca durante a perfusão sugere uma falha do procedimento.
2. Extraia rapidamente o cérebro do rato, garantindo uma degradação mínima das proteínas.
3. Submergir o cérebro de camundongos em PFA/PBS a 4% durante a noite para pós-fixação, seguido de substituição por solução de sacarose PB a 30% por 72 h.
   NOTA: É fundamental evitar a desidratação excessiva do tecido cerebral, por isso o cérebro não deve ser deixado na solução de sacarose PB por muito tempo.

5. Corte e coloração de tecidos congelados

1. Incorpore o cérebro de camundongo previamente desidratado em cola de temperatura de corte ideal (OCT), congele o cérebro embutido e use um micrótomo deslizante para cortar seções coronais com uma espessura de 20 μm.
2. Coloque as seções cerebrais na lâmina de vidro. Quando as seções cerebrais estiverem secas, armazene-as em uma geladeira de -20 °C para experimentos subsequentes.
3. Coloque cada lâmina de vidro em uma caixa de moldura e submerja a moldura em um recipiente cheio de PBS para enxaguar completamente a lâmina. Enxaguar suavemente as lâminas cerebrais com solução de PBS três vezes, por 10 min cada vez.
   NOTA: Deve-se ter cuidado para evitar que as seções cerebrais caiam da lâmina de vidro.
4. Manchar as lâminas cerebrais com solução de 4′,6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) por 10 min.
5. Enxaguar as lâminas cerebrais com solução PBS por 5 min.
6. Aplique uma gota de meio de montagem antifade nas seções cerebrais.
7. Coloque uma lamínula nas seções cerebrais, sele a lamínula com esmalte e analise as seções usando um microscópio de fluorescência convencional.

6. Indução do EAE

NOTA: Realizar indução de EAE após 2 semanas da injeção de shRNA ou CRE-TAT recombinase¹¹.

1. Criar uma solução aquosa misturando 2,5 mg de glicoproteína de oligodendrócitos de mielina (MOG_35-55) com 2 mL de PBS. Preparar uma solução completa de óleo de adjuvante de Freunds (CFA) misturando M. tuberculosis (H37Ra) com adjuvante de Freunds incompleto (IFA).
2. Misture as soluções aquosas e oleosas na proporção de 1:1. Use um tubo de tee para bater a mistura em um estado de óleo em água.
   NOTA: O tee pipe também é chamado de tubo de três vias. É um tubo de plástico que pode controlar a direção da solução de fluxo para misturar totalmente o MOG_35-55 e CFA.
3. Use um homogeneizador de alta velocidade para fazer a emulsão de antígeno MOG para o modelo EAE em condições de banho de gelo.
4. Anestesiar os camundongos por via intraperitoneal com pentobarbital sódico a 1% na dose de 6-8 mL/kg equivalente a 60-80 mg/kg de pentobarbital.
5. Injetar subcutaneamente a emulsão do antígeno MOG em quatro pontos diferentes (pescoço, costas, quadris esquerdo e direito) a um volume de 10 mL/kg para um total de quatro injeções cada.
   NOTA: É importante selecionar cuidadosamente o local de injeção, pois diferentes locais podem ter efeitos variados na morbidade e mortalidade de camundongos. Além disso, injeções repetidas de MOG podem levar à tolerância imunológica, então a equipe de pesquisa escolheu um único método de injeção para evitar esse problema potencial.
6. Injetar imediatamente 500 ng/mL de toxina pertussis (TP) por via intraperitoneal na dose de 5 mg/kg após a injeção de MOG.
   NOTA: O PT aumenta a permeabilidade da barreira hematoencefálica (BHE) e facilita a infiltração de células T no cérebro.
7. Após 48 h, injetar intraperitonealmente a solução de TP no mesmo volume.

7. Escore de déficit neurológico

1. Avaliar e classificar os camundongos diariamente usando uma escala de classificação¹⁶ que varia de 0 a 15 para avaliar a incidência e gravidade do EAE de acordo com os seguintes déficits neurológicos:
   Cauda: 0 indica nenhum sinal, 1 representa uma cauda semiparalisada e 2 indica uma cauda totalmente paralisada.
   Membros: 0 indica nenhum sinal, 1 representa uma marcha fraca ou alterada, 2 indica paresia e 3 representa um membro totalmente paralisado.
2. Atribua a um animal tetraplégico com paralisia completa uma pontuação de 12 e atribua à mortalidade uma pontuação de 15.

8. Coloração hematoxilina-eosina (H&E)

1. Pegue o cérebro de camundongo desidratado e embuta-o em parafina derretida. Deixe o bloco de parafina esfriar e solidificar para uso posterior.
   NOTA: O bloco de parafina deve estar completamente seco e fresco para evitar danos teciduais.
2. Corte o bloco de parafina cerebral de camundongo em lâminas de 5 μm de espessura. Coloque a secção do cérebro do rato em parafina numa lâmina de vidro e seque-a num forno a 60 °C durante 3 horas.
3. Submergir as lâminas sequencialmente em solução de xileno I por 10 min, solução de xileno II por 10 min, álcool 100% I por 3 min, álcool 100% II por 3 min, álcool 95% por 3 min, álcool 90% por 3 min, álcool 80% por 3 min, álcool 70% por 3 min e água destilada por 1 min.

9. Análise quantitativa da reação em cadeia da polimerase (qPCR)

1. Depois de perfundir os camundongos com PBS, remova a ChP dos ventrículos e extraia o RNA com Trizol. Sintetizar o cDNA usando o primeiro Strand cDNA Synthesis Kit.
2. Realize análise de qPCR usando pré-mistura verde Ex Taq SYBR e um sistema de PCR em tempo real. Use os seguintes primers A_2AR: forward - GCCATCCCATTCGCCATCA; reverso - GCAATAGCCAAGAGGCTGAAGA.

Resultados

knockdown de A_2AR específico para ChP por injeção ICV de AAV2/5-shRNA ou CRE-TAT
O papel de A_2AR na ChP como um poderoso regulador da informação neural na patogênese do EAE permanece obscuro. Derrubar a expressão de A 2A R específica de ChP poderia lançar luz sobre os efeitos regulatórios de A_2AR no sistema imunológico central em EAE e outras inflamações do sistema nervoso. Este estudo usou a injeção ICV de CRE-TAT para diminuir a expressão d...

Discussão

A pesquisa apresentou duas abordagens distintas para o knockdown direcionado de genes ChP. A primeira abordagem envolveu a injeção ICV de CRE-TAT, que contém Cre recombinase, em camundongos A_2AR flox^/flox. A segunda abordagem envolveu a injeção de ICV de AAV2/5 carregando shRNA de A_2AR. Utilizando essas duas estratégias, o trabalho conseguiu o knockdown seletivo de A 2A R dentro da ChP e foi capaz de demonstrar os efeitos protetores da inibição da sinalização A_2AR na ...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
A2ARflox/flox mice	State Key Laboratory of Ophthalmology, Optometry and Visual Science, Wenzhou Medical University
AAV2/5-A2AR-ShRNA virus	Shanghai Heyuan Biotechnology Co. LTD	pt-4828
antifade mounting medium	Beyotime Biotechnology	0100-01
borosilicate glass capillary	Beijing Meiyaxian Technology Co. Ltd	B100-50-10
brain stereotaxic apparatus	RWD, Shenzhen	69100
C57BL/6 mice	Beijing Vital Charles River Laboratory Animal Technology Company
CRE-TAT recombinase	Millipore	SCR508
DAPI	Absin	B25A031
frozen slicing machine	Leica	CM1950
H37Ra	Becton Dickinson and company	231141
Hamilton syringe	Hamilton, American	P/N: 86259
Incomplete Freunds adjuvant	Sigma	F5506
Laser confocal microscope	Zeiss	LSM900
MOG35-55	Suzhou Qiangyao Biotechnology Co., LTD	4010006243
OCT glue	Epredia	6502p
paraformaldehyde	Chengdu Kelong Chemical Reagent Company	30525-89-4
pentobarbital sodium	Boyun Biotech	PC13003
Pipette gun	Eppendorf	N45014F
PrimeScript 1st Strand cDNA Synthesis Kit	Takara	6110A
Real- Time PCR System	BioRad	CFX96
Rosa-LSL (Lox-StoP-Lox)-tdTomato mice	Jackson Laboratory
sucrose	Sangon Biotech	A502792-0500
super high speed homogenizer	IKA	3737025
Trizol	Invitrogen	15596026
xylene solution	Chengdu Kelong Chemical Reagent Company	1330-20-7