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要約

ここでは、脈絡叢の遺伝子発現を選択的に変化させながら、他の脳領域への影響を回避する方法について説明します。

要約

脈絡叢(ChP)は、生理学的および病理学的条件下で中枢神経系(CNS)への免疫細胞浸潤の重要なゲートウェイとして機能します。最近の研究では、ChP活性を調節することで、中枢神経系疾患に対する保護が得られる可能性があることが示されています。しかし、ChPはデリケートな構造をしているため、他の脳領域に影響を与えずにChPの生物学的機能を研究することは困難です。本研究は、アデノ随伴ウイルス(AAV)またはTAT配列からなる環化組換え酵素(Cre)リコンビナーゼタンパク質(CRE-TAT)を用いて、ChP組織における遺伝子ノックダウンのための新しい方法を提示する。この結果は、AAVまたはCRE-TATを側脳室に注入した後、蛍光がChPにのみ集中していたことを示しています。 このアプローチにより、RNA干渉(RNAi)またはX-overP1(Cre/LoxP)システムのCre/遺伝子座を使用して、ChPのアデノシンA 2A受容体(A2A R)をノックダウンすることに成功し、このノックダウンが実験的自己免疫性脳脊髄炎(EAE)の病態を緩和できることを示しました。この手法は、中枢神経系疾患におけるChPの役割に関する将来の研究に重要な意味を持つ可能性があります。

概要

脈絡叢(ChP)は、脳脊髄液(CSF)と脳由来神経栄養因子(BDNF)を分泌することにより、脳の機能的恒常性の維持に役立つと考えられていました1,2。過去30年間にわたる研究の増加により、ChPが中枢神経系(CNS)への免疫細胞浸潤の明確な経路であることが明らかになりました。

単層ChP上皮からなるChPのタイトジャンクション(TJ)は、高分子や免疫細胞が脳に侵入するのを防ぐことで免疫ホメオスタシスを維持しています3。しかし、特定の病理学的条件下では、ChP組織はCSFおよび血液中の危険関連分子パターン(DAMP)を検出して応答し、異常な免疫浸潤および脳機能障害を引き起こします4,5。ChPは重要な役割を担っているにもかかわらず、サイズが小さく、脳内のユニークな位置にあるため、他の脳領域に影響を与えずにその機能を研究することは困難です。したがって、ChPにおける遺伝子発現を特異的に操作することは、ChPの機能を理解するための理想的なアプローチです。

当初は、ChPに発現する遺伝子に特異的なプロモーターの制御下でCreを発現する環化組換え酵素(Cre)トランスジェニック株が、フロッサーした候補遺伝子と交配して標的遺伝子を欠失させるのが一般的であった6,7,8。例えば、転写因子Forkhead box J1(FoxJ1)は、マウスの出生前脳のChP上皮に排他的に発現している7。したがって、FoxJ1-Cre系統は、ChP6,9に位置する遺伝子を欠失させるためにしばしば使用された。しかし、この戦略の成功は、プロモーターの特異性に大きく依存しています。FoxJ1は脳や末梢系の他の部分の繊毛上皮細胞にも存在していたため、FoxJ1の発現パターンは十分に特徴的ではないことが徐々に発見されました7。この制限を克服するために、Creリコンビナーゼの脳室内(ICV)注射を実施して、フロッセ化されたトランスジェニック系統の心室にリコンビナーゼを送達しました。この戦略は、ChP組織のみにtdTomato蛍光が存在することからも明らかなように、高い特異性を示しました10,11。しかし、この方法は、フロックス処理されたトランスジェニックマウス株の利用可能性によってまだ制限されています。この問題に対処するために、研究者はアデノ随伴ウイルス(AAV)のICV注射を使用して、ChP特異的ノックダウンまたは標的遺伝子の過剰発現を達成しました12,13。ChP感染のさまざまなAAV血清型を包括的に評価したところ、AAV2/5およびAAV2/8はChPで強力な感染能力を示しますが、他の脳領域には感染しないことが明らかになりました。しかし、AAV2/8は脳室周囲の上衣に感染することがわかったのに対し、AAV2/5群は感染を示さなかった14。この方法は、フロッコスしたトランスジェニック動物を取得する際の限界を克服するという利点を有する。

本稿では、アデノシンA 2A受容体(A 2A R)のshRNAを運ぶAAV2/5のICVと、A2A RのChP特異的ノックダウンを達成するためのTAT配列(CRE-TAT)リコンビナーゼからなるCreリコンビナーゼタンパク質の2つの方法を用いて、ChPにおける遺伝子ノックダウンの段階的なプロトコルについて説明します。この研究結果は、ChP中のA2ARをノックダウンすることで、実験的な自己免疫性脳脊髄炎(EAE)を緩和できることを示唆しています。この詳しいプロトコルはChPの機能調査およびChPの遺伝子の特定の打撃に有用な指導を提供する。

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プロトコル

この研究で説明されているすべての動物手順は、実験動物のケアと使用に関するNIHガイドに概説されているガイドラインに従って実施され、温州医科大学の施設動物ケアおよび使用委員会によって承認されました。

1.動物

  1. 8〜12週齢、体重20〜22gの雄のC57BL / 6マウスを購入します。
  2. トランスジェニックRosa-LSL(Lox-StoP-Lox)-tdTomato(Ai9)マウス系統、および雄のA2ARflox/flox マウスを入手します。
  3. マウスを無作為に2つのグループに割り当て、ケージごとに最大5匹のマウスをケージに入れ、標準的な12時間のライト/12時間の暗サイクルで1週間飼育します。
  4. マウスに十分な餌と水を与え、25°Cで一定の温度に保ちます。

2. AAV2/5-shRNAによるA 2A RsのChP特異的ノックダウン

  1. 各マウスの重量を量り、値を書き留めます。
  2. 60〜80 mg / kgのペントバルビタールに相当する6〜8 mL / kgの投与量で1%ペントバルビタールナトリウムでマウスを腹腔内に麻酔し、マウスを加熱パッドの上に置いて保温します。.
    注:手術を成功させるには、マウスの体重に応じて正しい用量のペントバルビタールナトリウムを投与することが重要です。麻酔は死に至る可能性があるため深すぎてはいけませんが、処置中にマウスが目を覚まし、ウイルス注射の効果に影響を与える可能性があるため、浅すぎてはいけません。つま先をつまんで適切な麻酔量を確認し、マウスが反応しないことを確認します。
  3. 専用のマウスシェーバーを使用して、麻酔をかけたマウスの上毛を刈ります。
  4. 乾燥を防ぐために両眼に軟膏を塗り、マウスを脳定位固定装置に固定して脳を固定します。滅菌ドレープで動物を覆います。
  5. マウスの頭頸部の皮膚をヨードフォア消毒剤と75%アルコールで3回徹底的に殺菌し、術後の感染を減らします。次に、1%リドカインをマウスの頭皮に局所的に塗布し、顕微鏡下で頭蓋骨を完全に露出させるために小さな切開を行います。
    注意: 手順全体を通して滅菌器具を使用してください。
  6. 10 μLシリンジを2本用意し、1本はAAV2/5-A 2A R-shRNA(力価:6.27 × 10 9 vg/μL)を、もう1本はAAV2/5-Scramble(力価:6.21× 109 vg/μL)を購入したシリンジを用意します。
    注:シリンジを使用する場合は、前端をガラスキャピラリーに接続する必要があり、ガラスキャピラリーの長さを制御することで10μLの範囲を得ることができます。
  7. 顕微鏡を使用してブレグマとラムダの位置を特定し、座標点を設定します(AP:-0.58;ML:±1.10;DL:-2.20)を10 μLシリンジに装着しました(図1)。座標点は、マウス脳定位固定装置アトラス15に基づく。
  8. 調整した座標点で頭蓋骨に小さな穴を開けます。
    注:顕微鏡下では、頭蓋骨の表面に対して滅菌マイクロドリルを使用して穴あけが行われます。穿孔後、脳を覆っている髄膜を取り除き、その下にある脳実質を露出させることで、血管の損傷を防ぎます。このステップは、ガラス毛細血管の先端が髄膜によって壊れるのを防ぎます。ドリルで開けた穴の直径は、針先が脳組織に入るのに十分なものでなければなりません。
  9. AAV2/5-A2AR-shRNAウイルス2μLを100nL/minの定常速度で横方向注射 により 脳室に投与する。針を10分間所定の位置に置いてから引き抜きます。なお、ウイルスは一方的な注射で投与された。
  10. 医療用バイオフィブリン接着剤を使用して損傷した皮膚を速やかに密封し、ウイルスの損失を防ぎ、接着剤をすばやく塗布しない場合は、針を外した後にCSFで洗い流すことができます。また、綿棒を使用してCSFを拭くと、ウイルスの損失を引き起こす可能性があるため、使用しないでください。
  11. 回復を促進するために、マウスを加熱パッドの上に置き、体温を37.0±0.5°Cに維持し、マウスの頭皮に1%リドカインを局所的に塗布します。.AAV2/5-A2AR-shRNAウイルスの発現とその後のA2ARノックダウンに必要であるため、EAEモデルを誘導する前にマウスを2週間回復させます。

3. X-overP1(Cre/LoxP)系Cre/遺伝子座を有するA 2A RのChP特異的ノックダウン

注: 次の手順は、前述の方法で実行できます。詳細な注入方法については、手順2.1〜2.11を参照してください。

  1. 実験群としてRosa-LSL(Lox-StoP-Lox)-tdTomatoマウスの各側脳室に2μLのCRE-TATリコンビナーゼを注入し、対照群として2μLの滅菌リン酸緩衝生理食塩水(PBS)を注入します。上記と同じプロトコル(セクション2)を使用して、2μLのCRE-TATリコンビナーゼをA2ARフロックス/フロックス マウスの各側脳室に、対照群として2μLの滅菌PBSとともに注入します。
  2. 凍結組織切片を調製し、CRE-TATリコンビナーゼ注射の2週間後に核染色を行います。詳細については、手順4.1〜4.3を参照してください。

4. マウスの経心灌流

  1. 60〜80 mg / kgのペントバルビタールナトリウムを投与して、マウスに深く麻酔をかけます。.つま先をつまんで麻酔面を確認し、40 mL の滅菌 PBS 溶液とそれに続く 20 mL の 4% パラホルムアルデヒド (PFA) を使用して経心灌流を行います。
    注:灌流の成功は肝臓の白色で示されますが、灌流中の肺の肥大または口からのPBSの流出の存在は、手順の失敗を示唆しています。
  2. マウスの脳を迅速に抽出し、タンパク質の分解を最小限に抑えます。
  3. マウスの脳を4% PFA/PBSに一晩浸して固定後、30%スクロースPB溶液で72時間交換します。
    注:脳組織の過度の脱水を避けることが重要であるため、脳をスクロースPB溶液に長時間放置しないでください。

5. 凍結組織の切片化と染色

  1. 以前に脱水したマウスの脳を最適切断温度(OCT)接着剤に埋め込み、埋め込まれた脳を凍結し、スライド式ミクロトームを使用して冠状切片を厚さ20μmで切断します。
  2. スライドガラスの上に脳の切片を置きます。脳切片が乾いたら、その後の実験のために-20°Cの冷蔵庫に保管します。
  3. 各スライドガラスをフレームケースに入れ、PBSで満たされた容器にフレームを沈めて、スライドを完全にすすいでください。ブレインスライドをPBS溶液で3回、毎回10分間静かにすすぎます。
    注意: 脳の部分がスライドガラスから落ちないように注意する必要があります。
  4. 脳スライドを4',6-ジアミジノ-2-フェニルインドール(DAPI)溶液で10分間染色します。
  5. 脳スライドをPBS溶液で5分間すすぎます。
  6. 褪色防止剤封入剤を脳切片に1滴塗布します。
  7. 脳切片にカバーガラスを置き、マニキュアでカバーガラスを密封し、従来の蛍光顕微鏡を使用して切片を分析します。

6. EAE誘導

注:shRNAまたはCRE-TATリコンビナーゼ注入の2週間後にEAE誘導を行います11。

  1. 2.5 mgのミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質(MOG35-55)と2 mLのPBSを混合して水溶液を作成します。 結核菌 (H37Ra)と不完全なフロイントアジュバント(IFA)を混合して、完全なフロイントアジュバント(CFA)オイル溶液を調製します。
  2. 水溶液と油溶液を1:1の比率で混合します。ティーパイプを使用して、混合物を水中油状態に泡立てます。
    注:ティーパイプは三方パイプとも呼ばれます。MOG35-55 とCFAを完全に混合するために溶液の流れる方向を制御できるプラスチックチューブです。
  3. 高速ホモジナイザーを使用して、氷浴条件下でEAEモデル用のMOG抗原エマルジョンを作製します。
  4. 60〜80 mg / kgのペントバルビタールに相当する6〜8 mL / kgの投与量で、1%ペントバルビタールナトリウムでマウスを腹腔内に麻酔します。.
  5. MOG抗原エマルジョンを4つの異なるポイント(首、背中、左右の腰)に10mL / kgの容量でそれぞれ合計4回の注射で皮下注射します。
    注:注射部位が異なれば、マウスの罹患率や死亡率にさまざまな影響を与える可能性があるため、注射部位を慎重に選択することが重要です。さらに、MOG注射を繰り返すと免疫寛容につながる可能性があるため、研究チームはこの潜在的な問題を防ぐために単一の注射方法を選択しました。
  6. MOG注射後、直ちに500 ng / mLの百日咳毒素(PT)を5 mg / kgの投与量で腹腔内に注射します。.
    注:PTは血液脳関門(BBB)の透過性を高め、T細胞の脳への浸潤を促進します。
  7. 48時間後、PT溶液を同じ量で腹腔内に注射する。

7.神経学的欠損スコア

  1. 0〜15の範囲の評価スケール16 を使用してマウスを毎日評価および等級付けし、次の神経学的欠損に従ってEAEの発生率と重症度を評価します。
    尾: 0 は兆候がないことを示し、1 は半麻痺の尾を表し、2 は完全に麻痺した尾を示します。
    手足: 0 は兆候がないことを示し、1 は歩行が弱いか変化していることを表し、2 は麻痺を示し、3 は完全に麻痺した手足を表します。
  2. 完全な麻痺を持つ四肢麻痺の動物にスコア 12 を割り当て、死亡率のスコアを 15 に割り当てます。

8. ヘマトキシリン-エオシン(H&E)染色

  1. 脱水したマウスの脳を、溶融パラフィンに埋め込みます。後で使用するために、パラフィンブロックを冷まして固化させます。
    注意: パラフィンブロックは、組織の損傷を避けるために完全に乾燥して冷却する必要があります。
  2. マウス脳パラフィンブロックを厚さ5 μmのスライドにカットします。パラフィンマウスの脳切片をスライドガラス上に置き、60°Cのオーブンで3時間乾燥させます。
  3. スライドをキシレン溶液Iに10分間、キシレン溶液IIに10分間、100%アルコールIに3分間、100%アルコールIIに3分間、95%アルコールに3分間、90%アルコールに3分間、80%アルコールに3分間、70%アルコールに3分間、蒸留水に1分間浸します。

9. 定量的ポリメラーゼ連鎖反応(qPCR)分析

  1. マウスにPBSを灌流した後、心室からChPを除去し、TrizolでRNAを抽出します。最初の鎖cDNA合成キットを使用してcDNAを合成します。
  2. Ex Taq SYBR-green プレミックスとリアルタイム PCR システムを使用して qPCR 解析を実施します。次のA 2ARプライマーを使用してください:フォワード-GCCATCCCATTCGCCATCA;逆 - GCAATAGCCAAGAGGCTGAAGA。

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結果

AAV2/5-shRNAまたはCRE-TATのICV注入によるChP特異的A2ARノックダウン
EAEの病因における神経情報の強力な調節因子としてのChPにおけるA2ARの役割は、依然として不明である。ChP特異的なA 2A Rの発現をノックダウンすることで、EAEやその他の神経系の炎症における中枢免疫系に対するA2AR調節効果に光を当てることができる可能性があります。この研究で?...

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ディスカッション

この研究では、ChP遺伝子の標的ノックダウンのための2つの異なるアプローチが提示されました。最初のアプローチは、Creリコンビナーゼを含むCRE-TATをA2ARflox/floxマウス にICV注入することでした。2番目のアプローチは、A2ARのshRNAを運ぶAAV2/5のICV注入を伴いました。これら2つの戦略を利用することにより、この研究はChP内のA2ARの選択的ノックダウンを達成し、E...

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開示事項

著者らは、競合する金銭的利益や宣言すべきその他の開示はないと述べています。

謝辞

この研究に対する中国国家自然科学基金会(助成金第31800903号、W. Zheng氏)および温州科学技術プロジェクト(第Y2020426号、Y. Y. Weng氏)の支援に感謝します。

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資料

NameCompanyCatalog NumberComments
A2ARflox/flox miceState Key Laboratory of Ophthalmology, Optometry and Visual Science, Wenzhou Medical University
AAV2/5-A2AR-ShRNA virusShanghai Heyuan Biotechnology Co. LTDpt-4828
antifade mounting mediumBeyotime Biotechnology0100-01
borosilicate glass capillaryBeijing Meiyaxian Technology Co. LtdB100-50-10
brain stereotaxic apparatusRWD, Shenzhen69100
C57BL/6 miceBeijing Vital Charles River Laboratory Animal Technology Company
CRE-TAT recombinaseMilliporeSCR508
DAPIAbsinB25A031
frozen slicing machineLeicaCM1950
H37RaBecton Dickinson and company231141
Hamilton syringeHamilton, AmericanP/N: 86259
Incomplete Freunds adjuvantSigmaF5506
Laser confocal microscopeZeissLSM900
MOG35-55Suzhou Qiangyao Biotechnology Co., LTD4010006243
OCT glueEpredia6502p
paraformaldehydeChengdu Kelong Chemical Reagent Company30525-89-4
pentobarbital sodiumBoyun BiotechPC13003
Pipette gunEppendorfN45014F
PrimeScript 1st Strand cDNA Synthesis KitTakara 6110A
Real- Time PCR SystemBioRadCFX96
Rosa-LSL (Lox-StoP-Lox)-tdTomato miceJackson Laboratory
sucroseSangon BiotechA502792-0500
super high speed homogenizerIKA3737025
TrizolInvitrogen15596026
xylene solutionChengdu Kelong Chemical Reagent Company1330-20-7

参考文献

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