Gezielter Knockdown von Genen im Plexus aderoid

Zusammenfassung

Hier beschreiben wir eine Methode, um die Genexpression im Plexus choroideus selektiv zu verändern und gleichzeitig Auswirkungen auf andere Hirnareale zu vermeiden.

Zusammenfassung

Der Plexus choroideus (ChP) dient sowohl unter physiologischen als auch unter pathologischen Bedingungen als kritisches Einfallstor für die Infiltration von Immunzellen in das zentrale Nervensystem (ZNS). Neuere Forschungen haben gezeigt, dass die Regulierung der ChP-Aktivität Schutz vor ZNS-Erkrankungen bieten kann. Die biologische Funktion des ChP zu untersuchen, ohne andere Hirnregionen zu beeinträchtigen, ist jedoch aufgrund seiner empfindlichen Struktur eine Herausforderung. In dieser Arbeit wird eine neue Methode zum Gen-Knockdown in ChP-Gewebe unter Verwendung von Adeno-assoziierten Viren (AAVs) oder Cyclisierungsrekombinationsenzymen (Cre)-Rekombinase-Proteinen, bestehend aus TAT-Sequenzen (CRE-TAT), vorgestellt. Die Ergebnisse zeigen, dass nach der Injektion von AAV oder CRE-TAT in den lateralen Ventrikel die Fluoreszenz ausschließlich im ChP konzentriert war. Mit diesem Ansatz gelang es in der Studie, den Adenosin-A2A-Rezeptor (A_2A R) im ChP mithilfe von RNA-Interferenz (RNAi) oder Cre/Locus von X-overP1 (Cre/LoxP)-Systemen auszuschalten, und zeigte, dass dieser Knockdown die Pathologie der experimentellen autoimmunen Enzephalomyelitis (EAE) lindern könnte. Diese Technik könnte wichtige Implikationen für die zukünftige Forschung über die Rolle des ChP bei ZNS-Erkrankungen haben.

Einleitung

Es wurde oft angenommen, dass der Plexus choroideus (ChP) zur Aufrechterhaltung der funktionellen Homöostase des Gehirns beiträgt, indem er Liquor cerebrospinalis (CSF) und den vom Gehirn abgeleiteten neurotrophen Faktor (BDNF) sezerniert1,2. Zunehmende Forschung in den letzten drei Jahrzehnten hat gezeigt, dass das ChP einen eindeutigen Weg für die Infiltration von Immunzellen in das zentrale Nervensystem (ZNS) darstellt.

Die Tight Junctions (TJs) des ChP, die aus einem monoschichtigen ChP-Epithel bestehen, halten die immunologische Homöostase aufrecht, indem sie verhindern, dass M....

Protokoll

Alle in dieser Studie beschriebenen Tierbehandlungen wurden in Übereinstimmung mit den Richtlinien des NIH-Leitfadens für die Pflege und Verwendung von Labortieren durchgeführt und vom Institutional Animal Care and Use Committee der Wenzhou Medical University genehmigt.

1. Tiere

1. Kaufen Sie männliche C57BL/6-Mäuse im Alter von 8-12 Wochen und einem Gewicht von 20-22 g.
2. Besorgen Sie sich die transgene Rosa-LSL (Lox-StoP-Lox)-tdTomato (Ai9) Mauslinie und männliche A_2AR flox^/flox Mäuse.
3. Verteilen Sie die Mäuse nach dem Zufallsprinzip auf zwei Gruppen und halten Sie sie 1 Woche....

Diskussion

In der Studie wurden zwei unterschiedliche Ansätze für den gezielten Knockdown von ChP-Genen vorgestellt. Der erste Ansatz beinhaltete die ICV-Injektion von CRE-TAT, das Cre-Rekombinase enthält, in A_2A^{R-Flox/Flox-Mäuse}. Der zweite Ansatz beinhaltete die ICV-Injektion von AAV2/5, das shRNA von A_2AR trägt. Durch die Verwendung dieser beiden Strategien gelang es der selektiven Knockdown von A 2A R innerhalb der ChP und konnte die schützende Wirkung der Hemmung des A_2AR-Signa.......

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
A2ARflox/flox mice	State Key Laboratory of Ophthalmology, Optometry and Visual Science, Wenzhou Medical University
AAV2/5-A2AR-ShRNA virus	Shanghai Heyuan Biotechnology Co. LTD	pt-4828
antifade mounting medium	Beyotime Biotechnology	0100-01
borosilicate glass capillary	Beijing Meiyaxian Technology Co. Ltd	B100-50-10
brain stereotaxic apparatus	RWD, Shenzhen	69100
C57BL/6 mice	Beijing Vital Charles River Laboratory Animal Technology Company
CRE-TAT recombinase	Millipore	SCR508
DAPI	Absin	B25A031
frozen slicing machine	Leica	CM1950
H37Ra	Becton Dickinson and company	231141
Hamilton syringe	Hamilton, American	P/N: 86259
Incomplete Freunds adjuvant	Sigma	F5506
Laser confocal microscope	Zeiss	LSM900
MOG35-55	Suzhou Qiangyao Biotechnology Co., LTD	4010006243
OCT glue	Epredia	6502p
paraformaldehyde	Chengdu Kelong Chemical Reagent Company	30525-89-4
pentobarbital sodium	Boyun Biotech	PC13003
Pipette gun	Eppendorf	N45014F
PrimeScript 1st Strand cDNA Synthesis Kit	Takara	6110A
Real- Time PCR System	BioRad	CFX96
Rosa-LSL (Lox-StoP-Lox)-tdTomato mice	Jackson Laboratory
sucrose	Sangon Biotech	A502792-0500
super high speed homogenizer	IKA	3737025
Trizol	Invitrogen	15596026
xylene solution	Chengdu Kelong Chemical Reagent Company	1330-20-7