Gezielter Knockdown von Genen im Plexus aderoid

Zusammenfassung

Hier beschreiben wir eine Methode, um die Genexpression im Plexus choroideus selektiv zu verändern und gleichzeitig Auswirkungen auf andere Hirnareale zu vermeiden.

Zusammenfassung

Der Plexus choroideus (ChP) dient sowohl unter physiologischen als auch unter pathologischen Bedingungen als kritisches Einfallstor für die Infiltration von Immunzellen in das zentrale Nervensystem (ZNS). Neuere Forschungen haben gezeigt, dass die Regulierung der ChP-Aktivität Schutz vor ZNS-Erkrankungen bieten kann. Die biologische Funktion des ChP zu untersuchen, ohne andere Hirnregionen zu beeinträchtigen, ist jedoch aufgrund seiner empfindlichen Struktur eine Herausforderung. In dieser Arbeit wird eine neue Methode zum Gen-Knockdown in ChP-Gewebe unter Verwendung von Adeno-assoziierten Viren (AAVs) oder Cyclisierungsrekombinationsenzymen (Cre)-Rekombinase-Proteinen, bestehend aus TAT-Sequenzen (CRE-TAT), vorgestellt. Die Ergebnisse zeigen, dass nach der Injektion von AAV oder CRE-TAT in den lateralen Ventrikel die Fluoreszenz ausschließlich im ChP konzentriert war. Mit diesem Ansatz gelang es in der Studie, den Adenosin-A2A-Rezeptor (A_2A R) im ChP mithilfe von RNA-Interferenz (RNAi) oder Cre/Locus von X-overP1 (Cre/LoxP)-Systemen auszuschalten, und zeigte, dass dieser Knockdown die Pathologie der experimentellen autoimmunen Enzephalomyelitis (EAE) lindern könnte. Diese Technik könnte wichtige Implikationen für die zukünftige Forschung über die Rolle des ChP bei ZNS-Erkrankungen haben.

Einleitung

Es wurde oft angenommen, dass der Plexus choroideus (ChP) zur Aufrechterhaltung der funktionellen Homöostase des Gehirns beiträgt, indem er Liquor cerebrospinalis (CSF) und den vom Gehirn abgeleiteten neurotrophen Faktor (BDNF) sezerniert1,2. Zunehmende Forschung in den letzten drei Jahrzehnten hat gezeigt, dass das ChP einen eindeutigen Weg für die Infiltration von Immunzellen in das zentrale Nervensystem (ZNS) darstellt.

Die Tight Junctions (TJs) des ChP, die aus einem monoschichtigen ChP-Epithel bestehen, halten die immunologische Homöostase aufrecht, indem sie verhindern, dass Makromoleküle und Immunzellen in das Gehirn eindringen³. Unter bestimmten pathologischen Bedingungen erkennt und reagiert das ChP-Gewebe jedoch auf gefahrenassoziierte molekulare Muster (DAMPs) im Liquor und im Blut, was zu einer abnormalen Immuninfiltration und einer Dysfunktion des Gehirns führt ^4,5. Trotz seiner entscheidenden Rolle machen es die geringe Größe und die einzigartige Lage des ChP im Gehirn schwierig, seine Funktion zu untersuchen, ohne andere Gehirnregionen zu beeinträchtigen. Daher ist die spezifische Manipulation der Genexpression im ChP ein idealer Ansatz, um seine Funktion zu verstehen.

Ursprünglich wurden transgene Linien von Cyclisierungsrekombinationsenzymen (Cre), die Cre unter der Kontrolle von Promotoren exprimieren, die für Gene spezifisch sind, die in der ChP exprimiert werden, verwendet, um Zielgene durch Züchtung mit floxierten Kandidatengenen zu löschen ^6,7,8. Zum Beispiel wird der Transkriptionsfaktor Forkhead box J1 (FoxJ1) ausschließlich im ChP-Epithel des pränatalen Mäusegehirns exprimiert⁷. So wurde die FoxJ1-Cre-Linie häufig verwendet, um Gene zu löschen, die sich im ChP ^6,9 befinden. Der Erfolg dieser Strategie hängt jedoch stark von der Spezifität des Projektträgers ab. Nach und nach wurde entdeckt, dass das FoxJ1-Expressionsmuster nicht ausgeprägt genug war, da FoxJ1 auch in Flimmerepithelzellen in anderen Teilen des Gehirns und des peripheren Systems vorhanden war⁷. Um diese Einschränkung zu überwinden, wurde eine intrazerebroventrikuläre (ICV) Injektion von Cre-Rekombinase durchgeführt, um Rekombinase in die Ventrikel von gefloxten transgenen Linien zu bringen. Diese Strategie zeigte eine hohe Spezifität, was durch das Vorhandensein von tdTomato-Fluoreszenz allein im ChP-Gewebe belegt^{wird 10,11}. Diese Methode ist jedoch noch durch die Verfügbarkeit von floxierten transgenen Mauslinien begrenzt. Um dieses Problem anzugehen, haben Forscher die ICV-Injektion des Adeno-assoziierten Virus (AAV) eingesetzt, um einen ChP-spezifischen Knockdown oder die Überexpression von Zielgenen zu erreichen^12,13. Eine umfassende Untersuchung verschiedener AAV-Serotypen für eine ChP-Infektion ergab, dass AAV2/5 und AAV2/8 starke Infektionsfähigkeiten in der ChP aufweisen, während sie andere Hirnregionen nicht infizieren. Es wurde jedoch festgestellt, dass AAV2/8 das Ependym um die Ventrikel herum infizierte, während die AAV2/5-Gruppe keine Infektion aufwies¹⁴. Diese Methode hat den Vorteil, dass sie die Einschränkungen beim Erwerb von transgenen Tieren überwindet.

Dieser Artikel beschreibt ein Schritt-für-Schritt-Protokoll für den Gen-Knockdown im ChP mit zwei Methoden: ICV von AAV2/5, das shRNA des Adenosin-A2A-Rezeptors (A 2A R) trägt, und Cre-Rekombinase-Protein, das aus einer TAT-Sequenz (CRE-TAT)-Rekombinase besteht, um einen ChP-spezifischen Knockdown von A_2A R zu erreichen. Die Studienergebnisse deuten darauf hin, dass der Abbau von A_2AR in der ChP die experimentelle autoimmune Enzephalomyelitis (EAE) lindern kann. Dieses detaillierte Protokoll bietet nützliche Hinweise für ChP-Funktionsstudien und den spezifischen Knockdown von Genen im ChP.

Protokoll

Alle in dieser Studie beschriebenen Tierbehandlungen wurden in Übereinstimmung mit den Richtlinien des NIH-Leitfadens für die Pflege und Verwendung von Labortieren durchgeführt und vom Institutional Animal Care and Use Committee der Wenzhou Medical University genehmigt.

1. Tiere

1. Kaufen Sie männliche C57BL/6-Mäuse im Alter von 8-12 Wochen und einem Gewicht von 20-22 g.
2. Besorgen Sie sich die transgene Rosa-LSL (Lox-StoP-Lox)-tdTomato (Ai9) Mauslinie und männliche A_2AR flox^/flox Mäuse.
3. Verteilen Sie die Mäuse nach dem Zufallsprinzip auf zwei Gruppen und halten Sie sie 1 Woche lang in Käfigen mit maximal fünf Mäusen pro Käfig unter einem Standardzyklus von 12 Stunden Licht und 12 Stunden Dunkel.
4. Versorgen Sie die Mäuse mit ausreichend Futter und Wasser und halten Sie sie auf einer konstanten Temperatur von 25 °C.

2. ChP-spezifischer Knockdown von A_2ARs mit AAV2/5-shRNA

1. Wiegen Sie jede Maus und notieren Sie sich die Werte.
2. Betäuben Sie die Mäuse intraperitoneal mit 1% Pentobarbital-Natrium in einer Dosierung von 6-8 ml/kg, was 60-80 mg/kg Pentobarbital entspricht, und legen Sie die Maus auf ein Heizkissen, um sie warm zu halten.
   HINWEIS: Es ist wichtig, die richtige Dosierung von Pentobarbital-Natrium entsprechend dem Gewicht der Maus zu verabreichen, um eine erfolgreiche Operation zu gewährleisten. Die Anästhesie sollte nicht zu tief sein, da dies zur Sterblichkeit führen kann, aber auch nicht zu flach, da die Maus während des Eingriffs aufwachen und die Wirksamkeit der Virusinjektion beeinträchtigen könnte. Überprüfen Sie die richtige Anästhesiedosis, indem Sie die Zehen zusammenkneifen und sicherstellen, dass die Mäuse nicht ansprechen.
3. Verwenden Sie einen speziellen Mausrasierer, um die oberen Haare der betäubten Mäuse zu trimmen.
4. Tragen Sie Augensalbe auf beide Augen auf, um ein Austrocknen zu verhindern, und fixieren Sie die Mäuse auf einem stereotaktischen Apparat, um das Gehirn zu immobilisieren. Decken Sie das Tier mit einem sterilen Tuch ab.
5. Sterilisieren Sie die Haut von Kopf und Hals der Mäuse gründlich mit drei Runden Jodophor-Desinfektionsmittel und 75%igem Alkohol, um die postoperative Infektion zu reduzieren. Tragen Sie dann 1% Lidocain topisch auf die Kopfhaut von Mäusen auf und machen Sie einen kleinen Schnitt, um den Schädel unter einem Mikroskop vollständig freizulegen.
   HINWEIS: Verwenden Sie während des gesamten Eingriffs sterile Instrumente.
6. Bereiten Sie zwei 10-μl-Spritzen vor: eine mit gekaufter AAV2/5-A 2A R-shRNA (Titer: 6,27 × 10 9 vg/μl) und die andere mit gekauftem AAV2/5-Scramble (Titer:_6,21× 10⁹ vg/μl).
   HINWEIS: Bei Verwendung der Spritze muss das vordere Ende an eine Glaskapillare angeschlossen werden, und ein Bereich von 10 μl kann durch Steuerung der Länge der Glaskapillare erreicht werden.
7. Verwenden Sie das Mikroskop, um das Bregma und das Lambda zu lokalisieren und den Koordinatenpunkt einzustellen (AP: -0,58; ML: ±1,10; DL: -2,20) auf der 10-μl-Spritze (Abbildung 1). Der Koordinatenpunkt basiert auf dem stereotaktischen Atlas¹⁵ des Mäusegehirns.
8. Bohren Sie am angepassten Koordinatenpunkt ein kleines Loch in den Schädel.
   HINWEIS: Unter dem Mikroskop wird mit einem sterilen Mikrobohrer gegen die Oberfläche des Schädels gebohrt. Nach dem Bohren wird durch die Entfernung der Hirnhäute, die das Gehirn bedecken, und die Freilegung des darunter liegenden Hirnparenchyms eine Verletzung der Blutgefäße verhindert. Dieser Schritt verhindert, dass die Spitze der Glaskapillare durch die Hirnhäute abgebrochen wird. Der Durchmesser des Bohrlochs sollte ausreichend sein, damit die Nadelspitze in das Hirngewebe eindringen kann.
9. Verabreichung von 2 μl AAV2/5-A_2AR-shRNA-Virus in die Hirnkammer durch laterale Injektion mit einer konstanten Rate von 100 nL/min. Halten Sie die Nadel 10 Minuten lang an Ort und Stelle, bevor Sie sie zurückziehen. Beachten Sie, dass das Virus mit einseitiger Injektion verabreicht wurde.
10. Versiegeln Sie die verletzte Haut umgehend mit medizinischem Biofibrin-Kleber, um Virusverlust zu verhindern, der nach dem Entfernen der Nadel mit Liquor ausgespült werden kann, wenn der Kleber nicht schnell aufgetragen wird. Verwenden Sie auch keine Wattestäbchen, um den Liquor abzuwischen, da dies ebenfalls zu Virenverlust führen kann.
11. Um die Regeneration zu erleichtern, legen Sie die Maus auf ein Heizkissen, um die Körpertemperatur bei 37,0 ± 0,5 °C zu halten, und tragen Sie 1% Lidocain topisch auf die Kopfhaut der Maus auf. Lassen Sie die Mäuse 2 Wochen lang erholen, bevor Sie das EAE-Modell induzieren, da dieser Zeitraum für die Expression des AAV2/5-A 2A R-shRNA-Virus und den anschließenden A_2AR-Knockdown erforderlich ist.

3. ChP-spezifischer Knockdown von A_2AR mit einem Cre/Locus von X-overP1 (Cre/LoxP) System

HINWEIS: Die folgenden Verfahren können mit der zuvor beschriebenen Methode erreicht werden. In den Schritten 2.1 bis 2.11 finden Sie detaillierte Informationen zu den Injektionsmethoden.

1. Injizieren Sie 2 μl CRE-TAT-Rekombinase in jeden Seitenventrikel einer Rosa-LSL (Lox-StoP-Lox)-tdTomato-Maus als Versuchsgruppe und 2 μl sterile phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) als Kontrollgruppe. Unter Verwendung des gleichen Protokolls wie oben (Abschnitt 2) werden 2 μl CRE-TAT-Rekombinase in jeden der lateralen Ventrikel von A_2A^{R-Flox/Flox-Mäusen} zusammen mit 2 μl sterilem PBS als Kontrollgruppe injiziert.
2. Bereiten Sie gefrorene Gewebeschnitte vor und führen Sie 2 Wochen nach der CRE-TAT-Rekombinase-Injektion eine Kernfärbung durch. Weitere Informationen finden Sie in den Schritten 4.1 bis 4.3.

4. Transkardiale Perfusion bei Mäusen

1. Verabreichen Sie 60-80 mg/kg Pentobarbital-Natrium, um die Mäuse tief zu betäuben. Bestätigen Sie die Anästhesieebene durch eine Zehenkneifung und führen Sie eine transkardiale Perfusion mit 40 ml steriler PBS-Lösung gefolgt von 20 ml 4%igem Paraformaldehyd (PFA) durch.
   HINWEIS: Eine erfolgreiche Perfusion wird durch eine weiße Farbe in der Leber angezeigt, während das Vorhandensein einer vergrößerten Lunge oder eines PBS-Abflusses aus dem Mund während der Perfusion auf ein Versagen des Verfahrens hindeutet.
2. Schnelles Extrahieren des Mäusegehirns, um einen minimalen Proteinabbau zu gewährleisten.
3. Tauchen Sie das Mäusegehirn über Nacht zur Nachfixierung in 4 % PFA/PBS ein, gefolgt von einem Ersatz durch 30 % Saccharose-PB-Lösung für 72 Stunden.
   HINWEIS: Es ist wichtig, eine übermäßige Dehydrierung des Hirngewebes zu vermeiden, daher sollte das Gehirn nicht zu lange in der Saccharose-PB-Lösung belassen werden.

5. Schneiden und Färben von gefrorenem Gewebe

1. Betten Sie das zuvor dehydrierte Mäusegehirn in OCT-Kleber (Optimum Cutting Temperature) ein, frieren Sie das eingebettete Gehirn ein und schneiden Sie mit einem gleitenden Mikrotom koronale Schnitte mit einer Dicke von 20 μm.
2. Legen Sie die Hirnabschnitte auf den Objektträger. Sobald die Hirnabschnitte getrocknet sind, lagern Sie sie für nachfolgende Experimente in einem -20 °C heißen Kühlschrank.
3. Legen Sie jeden Objektträger in ein Rahmengehäuse und tauchen Sie den Rahmen in einen mit PBS gefüllten Behälter, um den Objektträger gründlich abzuspülen. Spülen Sie die Objektträger dreimal vorsichtig mit PBS-Lösung ab, jeweils 10 Minuten lang.
   HINWEIS: Es ist Vorsicht geboten, um zu verhindern, dass die Hirnabschnitte vom Objektträger fallen.
4. Färben Sie die Objektträger 10 Minuten lang mit 4′,6-Diamidino-2-phenylindol (DAPI)-Lösung.
5. Spülen Sie die Objektträger 5 Minuten lang mit PBS-Lösung.
6. Tragen Sie einen Tropfen Antifade-Eindeckmittel auf die Gehirnabschnitte auf.
7. Legen Sie ein Deckglas auf die Hirnschnitte, versiegeln Sie das Deckglas mit Nagellack und analysieren Sie die Schnitte mit einem herkömmlichen Fluoreszenzmikroskop.

6. EAE-Induktion

HINWEIS: Führen Sie die EAE-Induktion nach 2 Wochen der shRNA- oder CRE-TAT-Rekombinase-Injektion^{durch 11}.

1. Stellen Sie eine wässrige Lösung her, indem Sie 2,5 mg Myelin-Oligodendrozyten-Glykoprotein (MOG_35-55) mit 2 ml PBS mischen. Bereiten Sie eine vollständige Freunds-Adjuvans-Öllösung (CFA) vor, indem Sie M. tuberculosis (H37Ra) mit unvollständigem Freunds-Adjuvans (IFA) mischen.
2. Mischen Sie die wässrige und die Öllösung im Verhältnis 1:1. Verwende ein T-Rohr, um die Mischung in einen Öl-in-Wasser-Zustand zu bringen.
   HINWEIS: Das T-Rohr wird auch als Dreiwegerohr bezeichnet. Es handelt sich um ein Kunststoffrohr, das die Richtung der fließenden Lösung steuern kann, um MOG_35-55 und CFA vollständig zu mischen.
3. Verwenden Sie einen Hochgeschwindigkeits-Homogenisator, um die MOG-Antigen-Emulsion für das EAE-Modell unter Eisbadbedingungen herzustellen.
4. Die Mäuse werden intraperitoneal mit 1% Pentobarbital-Natrium in einer Dosierung von 6-8 ml/kg entsprechend 60-80 mg/kg Pentobarbital anästhesiert.
5. Subkutan injizieren Sie die MOG-Antigen-Emulsion in vier verschiedene Punkte (Nacken, Rücken, linke und rechte Hüfte) in einem Volumen von 10 ml/kg für jeweils vier Injektionen.
   HINWEIS: Es ist wichtig, die Injektionsstelle sorgfältig auszuwählen, da verschiedene Stellen unterschiedliche Auswirkungen auf die Morbidität und Mortalität von Mäusen haben können. Darüber hinaus können wiederholte MOG-Injektionen zu einer Immuntoleranz führen, so dass das Forschungsteam eine einzige Injektionsmethode wählte, um dieses potenzielle Problem zu verhindern.
6. Nach der MOG-Injektion werden sofort 500 ng/ml Pertussistoxin (PT) intraperitoneal in einer Dosierung von 5 mg/kg injiziert.
   HINWEIS: PT erhöht die Durchlässigkeit der Blut-Hirn-Schranke (BHS) und erleichtert die Infiltration von T-Zellen in das Gehirn.
7. Nach 48 h wird die PT-Lösung im gleichen Volumen intraperitoneal injiziert.

7. Neurologischer Defizit-Score

1. Bewerten und bewerten Sie die Mäuse täglich anhand einer Bewertungsskala¹⁶ von 0 bis 15, um die Inzidenz und den Schweregrad von EAE anhand der folgenden neurologischen Defizite zu beurteilen:
   Schwanz: 0 zeigt keine Anzeichen an, 1 steht für einen halb gelähmten Schwanz und 2 für einen vollständig gelähmten Schwanz.
   Gliedmaßen: 0 steht für keine Anzeichen, 1 für einen schwachen oder veränderten Gang, 2 für Parese und 3 für eine vollständig gelähmte Gliedmaße.
2. Weisen Sie einem querschnittsgelähmten Tier mit vollständiger Lähmung einen Wert von 12 zu und weisen Sie der Mortalität einen Wert von 15 zu.

8. Hämatoxylin-Eosin (H&E)-Färbung

1. Nimm das dehydrierte Mäusegehirn und bette es in geschmolzenes Paraffin ein. Lassen Sie den Paraffinblock abkühlen und für die spätere Verwendung fest werden.
   HINWEIS: Der Paraffinblock sollte vollständig trocken und kühl sein, um Gewebeschäden zu vermeiden.
2. Schneiden Sie den Paraffinblock für das Mäusegehirn in 5 μm dicke Objektträger. Den Paraffin-Mäuse-Hirnschnitt auf einen Objektträger legen und im 60 °C heißen Ofen 3 h trocknen.
3. Tauchen Sie die Objektträger nacheinander für 10 Minuten in Xylollösung I, Xylollösung II für 10 Minuten, 100% Alkohol I für 3 Minuten, 100% Alkohol II für 3 Minuten, 95% Alkohol für 3 Minuten, 90% Alkohol für 3 Minuten, 80% Alkohol für 3 Minuten, 70% Alkohol für 3 Minuten und destilliertes Wasser für 1 Minute.

9. Quantitative Analyse der Polymerase-Kettenreaktion (qPCR)

1. Nachdem Sie die Mäuse mit PBS durchblutet haben, entfernen Sie das ChP aus den Ventrikeln und extrahieren Sie die RNA mit Trizol. Synthetisieren Sie die cDNA mit dem ersten Strang-cDNA-Synthesekit.
2. Führen Sie die qPCR-Analyse mit Ex Taq SYBR-green Premix und einem Real-Time-PCR-System durch. Verwenden Sie die folgenden A_2AR-Primer: vorwärts - GCCATCCCATTCGCCATCA; umgekehrt - GCAATAGCCAAGAGGCTGAAGA.

Ergebnisse

ChP-spezifischer_A2AR-Knockdown durch ICV-Injektion von AAV2/5-shRNA oder CRE-TAT
Die Rolle von A_2AR in der ChP als mächtiger Regulator neuronaler Information in der EAE-Pathogenese bleibt unklar. Das Ausschalten der ChP-spezifischen A 2A R-Expression könnte Aufschluss über die regulatorischen Auswirkungen von A_2AR auf das zentrale Immunsystem bei EAE und anderen Entzündungen des Nervensystems geben. In dieser Studie wurde die ICV-Injektion von CRE-TAT ve...

Diskussion

In der Studie wurden zwei unterschiedliche Ansätze für den gezielten Knockdown von ChP-Genen vorgestellt. Der erste Ansatz beinhaltete die ICV-Injektion von CRE-TAT, das Cre-Rekombinase enthält, in A_2A^{R-Flox/Flox-Mäuse}. Der zweite Ansatz beinhaltete die ICV-Injektion von AAV2/5, das shRNA von A_2AR trägt. Durch die Verwendung dieser beiden Strategien gelang es der selektiven Knockdown von A 2A R innerhalb der ChP und konnte die schützende Wirkung der Hemmung des A_2AR-Signa...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
A2ARflox/flox mice	State Key Laboratory of Ophthalmology, Optometry and Visual Science, Wenzhou Medical University
AAV2/5-A2AR-ShRNA virus	Shanghai Heyuan Biotechnology Co. LTD	pt-4828
antifade mounting medium	Beyotime Biotechnology	0100-01
borosilicate glass capillary	Beijing Meiyaxian Technology Co. Ltd	B100-50-10
brain stereotaxic apparatus	RWD, Shenzhen	69100
C57BL/6 mice	Beijing Vital Charles River Laboratory Animal Technology Company
CRE-TAT recombinase	Millipore	SCR508
DAPI	Absin	B25A031
frozen slicing machine	Leica	CM1950
H37Ra	Becton Dickinson and company	231141
Hamilton syringe	Hamilton, American	P/N: 86259
Incomplete Freunds adjuvant	Sigma	F5506
Laser confocal microscope	Zeiss	LSM900
MOG35-55	Suzhou Qiangyao Biotechnology Co., LTD	4010006243
OCT glue	Epredia	6502p
paraformaldehyde	Chengdu Kelong Chemical Reagent Company	30525-89-4
pentobarbital sodium	Boyun Biotech	PC13003
Pipette gun	Eppendorf	N45014F
PrimeScript 1st Strand cDNA Synthesis Kit	Takara	6110A
Real- Time PCR System	BioRad	CFX96
Rosa-LSL (Lox-StoP-Lox)-tdTomato mice	Jackson Laboratory
sucrose	Sangon Biotech	A502792-0500
super high speed homogenizer	IKA	3737025
Trizol	Invitrogen	15596026
xylene solution	Chengdu Kelong Chemical Reagent Company	1330-20-7