Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Temsili Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

Burada, diğer beyin bölgelerinde herhangi bir etkiden kaçınırken koroid pleksustaki gen ekspresyonlarını seçici olarak değiştirmek için bir yöntem açıklıyoruz.

Özet

Koroid pleksus (ChP), hem fizyolojik hem de patolojik koşullar altında merkezi sinir sistemine (MSS) immün hücre infiltrasyonu için kritik bir geçit görevi görür. Son araştırmalar, ChP aktivitesinin düzenlenmesinin CNS bozukluklarına karşı koruma sağlayabileceğini göstermiştir. Bununla birlikte, diğer beyin bölgelerini etkilemeden ChP'nin biyolojik işlevini incelemek, hassas yapısı nedeniyle zordur. Bu çalışma, adeno-ilişkili virüsler (AAV'ler) veya TAT dizisinden (CRE-TAT) oluşan siklizasyon rekombinasyon enzimi (Cre) rekombinaz proteini kullanılarak ChP dokusunda gen yıkımı için yeni bir yöntem sunmaktadır. Sonuçlar, lateral ventriküle AAV veya CRE-TAT enjekte edildikten sonra, floresansın sadece ChP'de yoğunlaştığını göstermektedir. Bu yaklaşımı kullanarak, çalışma, RNA interferansı (RNAi) veya X-overP1 (Cre / LoxP) sistemlerinin Cre / lokusu kullanılarak ChP'deki adenozin A2A reseptörünü (A2AR) başarılı bir şekilde yıktı ve bu yıkımın deneysel otoimmün ensefalomiyelit (EAE) patolojisini hafifletebileceğini gösterdi. Bu teknik, ChP'nin CNS bozukluklarındaki rolü üzerine gelecekteki araştırmalar için önemli etkilere sahip olabilir.

Giriş

Koroid pleksusun (ChP) genellikle beyin omurilik sıvısı (BOS) ve beyin kaynaklı nörotrofik faktör (BDNF) salgılayarak beyin fonksiyonel homeostazının korunmasına yardımcı olduğu düşünülüyordu1,2. Son otuz yılda artan araştırmalar, CHP'nin merkezi sinir sistemine (CNS) bağışıklık hücresi infiltrasyonu için farklı bir yolu temsil ettiğini ortaya koymuştur.

Tek katmanlı bir ChP epitelinden oluşan ChP'nin sıkı bağlantıları (TJ'ler), makromoleküllerin ve bağışıklık hücrelerinin beyne girmesini önleyerek immünolojik homeostazı korur3. Bununla birlikte, belirli pato....

Protokol

Bu çalışmada açıklanan tüm hayvan prosedürleri, NIH Laboratuvar Hayvanlarının Bakımı ve Kullanımı Kılavuzunda belirtilen ve Wenzhou Tıp Üniversitesi'ndeki Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi tarafından onaylanan yönergelere uygun olarak yürütülmüştür.

1. Hayvanlar

  1. 8-12 haftalık ve 20-22 g ağırlığındaki erkek C57BL/6 fareleri satın alın.
  2. Transgenik Rosa-LSL (Lox-StoP-Lox)-tdTomato (Ai9) fare serisini ve erkek A2AR flox/flox farelerini edinin.
  3. Fareleri rastgele iki gruba atayın ve 1 hafta boyunca standart 12 saat ışık/12 saat karanlık döngü altında kafes başına en f....

Temsili Sonuçlar

AAV2 / 5-shRNA veya CRE-TAT'ın ICV enjeksiyonu ile ChP'ye özgü A2AR yıkımı
EAE patogenezinde nöral bilginin güçlü bir düzenleyicisi olarak CHP'deki A2AR'nin rolü belirsizliğini korumaktadır. ChP'ye özgü A 2A R ekspresyonunun yıkılması, EAE ve diğer sinir sistemi iltihaplanmalarında A2AR'nin merkezi bağışıklık sistemi üzerindeki düzenleyici etkilerine ışık tutabilir. Bu çalışmada, A 2A R flox/ flox farelerinin CHP'.......

Tartışmalar

Araştırma, ChP genlerinin hedeflenen yıkımı için iki farklı yaklaşım sundu. İlk yaklaşım, Cre rekombinaz içeren CRE-TAT'ın A2AR flox/flox farelerine ICV enjeksiyonunu içeriyordu. İkinci yaklaşım, A2AR'nin shRNA'sını taşıyan AAV2/5'in ICV enjeksiyonunu gerektiriyordu. Bu iki stratejiyi kullanarak, çalışma ChP içinde A 2A R'nin seçici olarak yıkılmasını sağladı ve ChP'de A2AR sinyalini inhibe etmenin EAE patolojisi üzerindeki koruyucue.......

Açıklamalar

Yazarlar, beyan etmek için rekabet eden mali çıkarları veya başka açıklamaları olmadığını belirtmektedir.

Teşekkürler

Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı'nın (31800903 No'lu Hibe, W. Zheng'e verildi) ve Wenzhou Bilim ve Teknoloji Projesi'nin (No. Y2020426, Y. Y. Weng'e verildi) bu çalışma için desteğini minnetle kabul ediyoruz.

....

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
A2ARflox/flox miceState Key Laboratory of Ophthalmology, Optometry and Visual Science, Wenzhou Medical University
AAV2/5-A2AR-ShRNA virusShanghai Heyuan Biotechnology Co. LTDpt-4828
antifade mounting mediumBeyotime Biotechnology0100-01
borosilicate glass capillaryBeijing Meiyaxian Technology Co. LtdB100-50-10
brain stereotaxic apparatusRWD, Shenzhen69100
C57BL/6 miceBeijing Vital Charles River Laboratory Animal Technology Company
CRE-TAT recombinaseMilliporeSCR508
DAPIAbsinB25A031
frozen slicing machineLeicaCM1950
H37RaBecton Dickinson and company231141
Hamilton syringeHamilton, AmericanP/N: 86259
Incomplete Freunds adjuvantSigmaF5506
Laser confocal microscopeZeissLSM900
MOG35-55Suzhou Qiangyao Biotechnology Co., LTD4010006243
OCT glueEpredia6502p
paraformaldehydeChengdu Kelong Chemical Reagent Company30525-89-4
pentobarbital sodiumBoyun BiotechPC13003
Pipette gunEppendorfN45014F
PrimeScript 1st Strand cDNA Synthesis KitTakara 6110A
Real- Time PCR SystemBioRadCFX96
Rosa-LSL (Lox-StoP-Lox)-tdTomato miceJackson Laboratory
sucroseSangon BiotechA502792-0500
super high speed homogenizerIKA3737025
TrizolInvitrogen15596026
xylene solutionChengdu Kelong Chemical Reagent Company1330-20-7

Referanslar

  1. Damkier, H. H., Brown, P. D., Praetorius, J. Cerebrospinal fluid secretion by the choroid plexus. Physiological Reviews. 93 (4), 1847-1892 (2013).
  2. Lun, M. P., Monuki, E. S., Lehtinen, M. K. Development and functions of the cho....

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

Koroid PleksusGen Y k mmm n H cre nfiltrasyonuMerkezi Sinir SistemiCNS BozukluklarChP Aktivite Reg lasyonuAdeno li kili Vir slerSiklizasyon Rekombinasyon EnzimiTAT DizisiCRE TATFloresanLateral Ventrik l EnjeksiyonuAdenozin A2A Resept rRNA nterfanX overP1 in Cre lokusuDeneysel Otoimm n EnsefalomiyelitEAE

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır