Eliminación selectiva de genes en el plexo coroideo

Resumen

Aquí, describimos un método para alterar selectivamente las expresiones génicas en el plexo coroideo mientras se evita cualquier impacto en otras áreas del cerebro.

Resumen

El plexo coroideo (ChP) sirve como una puerta de entrada crítica para la infiltración de células inmunitarias en el sistema nervioso central (SNC) tanto en condiciones fisiológicas como patológicas. Investigaciones recientes han demostrado que la regulación de la actividad de la CHP puede ofrecer protección contra los trastornos del SNC. Sin embargo, estudiar la función biológica de la ChP sin afectar a otras regiones cerebrales es un reto debido a su delicada estructura. Este estudio presenta un método novedoso para la eliminación de genes en el tejido ChP utilizando virus adenoasociados (AAV) o proteína recombinasa de la enzima de recombinación de ciclación (Cre) que consiste en la secuencia TAT (CRE-TAT). Los resultados demuestran que después de inyectar AAV o CRE-TAT en el ventrículo lateral, la fluorescencia se concentró exclusivamente en la ChP. Utilizando este enfoque, el estudio eliminó con éxito el receptor de adenosina A 2A (A_2A R) en la ChP utilizando sistemas de ARN de interferencia (ARNi) o Cre/locus de X-overP1 (Cre/LoxP), y demostró que esta eliminación podría aliviar la patología de la encefalomielitis autoinmune experimental (EAE). Esta técnica puede tener implicaciones importantes para futuras investigaciones sobre el papel de la ChP en los trastornos del SNC.

Introducción

A menudo se pensaba que el plexo coroideo (ChP) ayudaba a mantener la homeostasis funcional del cerebro mediante la secreción de líquido cefalorraquídeo (LCR) y factor neurotrófico derivado del cerebro (BDNF)^1,2. El aumento de la investigación en las últimas tres décadas ha revelado que la ChP representa una vía distinta para la infiltración de células inmunitarias en el sistema nervioso central (SNC).

Las uniones estrechas (TJs) de la ChP, compuestas por un epitelio ChP monocapa, mantienen la homeostasis inmunológica impidiendo que las macromoléculas y las células inmunitarias entr....

Protocolo

Todos los procedimientos con animales descritos en este estudio se llevaron a cabo de acuerdo con las pautas descritas en la Guía de los NIH para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio y aprobadas por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad Médica de Wenzhou.

1. Animales

1. Compre ratones machos C57BL/6 de 8 a 12 semanas de edad y con un peso de 20 a 22 g.
2. Obtener la línea de ratones transgénicos Rosa-LSL (Lox-StoP-Lox)-tdTomato (Ai9) y ratones machos A_2AR flox^/flox .
3. Asigne aleatoriamente a los ratones a dos grupos y los aloje en jaulas, c....

Discusión

La investigación presentó dos enfoques distintos para la eliminación dirigida de los genes ChP. El primer enfoque consistió en la inyección ICV de CRE-TAT, que contiene Cre recombinasa, en ratones A_2AR flox^/flox. El segundo abordaje consistió en la inyección de AAV2/5 portadora de ARNh de A_2AR. Mediante la utilización de estas dos estrategias, el trabajo logró la eliminación selectiva de A 2A R dentro de la ChP y pudo demostrar los efectos protectores de la inhibición de la se?.......

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
A2ARflox/flox mice	State Key Laboratory of Ophthalmology, Optometry and Visual Science, Wenzhou Medical University
AAV2/5-A2AR-ShRNA virus	Shanghai Heyuan Biotechnology Co. LTD	pt-4828
antifade mounting medium	Beyotime Biotechnology	0100-01
borosilicate glass capillary	Beijing Meiyaxian Technology Co. Ltd	B100-50-10
brain stereotaxic apparatus	RWD, Shenzhen	69100
C57BL/6 mice	Beijing Vital Charles River Laboratory Animal Technology Company
CRE-TAT recombinase	Millipore	SCR508
DAPI	Absin	B25A031
frozen slicing machine	Leica	CM1950
H37Ra	Becton Dickinson and company	231141
Hamilton syringe	Hamilton, American	P/N: 86259
Incomplete Freunds adjuvant	Sigma	F5506
Laser confocal microscope	Zeiss	LSM900
MOG35-55	Suzhou Qiangyao Biotechnology Co., LTD	4010006243
OCT glue	Epredia	6502p
paraformaldehyde	Chengdu Kelong Chemical Reagent Company	30525-89-4
pentobarbital sodium	Boyun Biotech	PC13003
Pipette gun	Eppendorf	N45014F
PrimeScript 1st Strand cDNA Synthesis Kit	Takara	6110A
Real- Time PCR System	BioRad	CFX96
Rosa-LSL (Lox-StoP-Lox)-tdTomato mice	Jackson Laboratory
sucrose	Sangon Biotech	A502792-0500
super high speed homogenizer	IKA	3737025
Trizol	Invitrogen	15596026
xylene solution	Chengdu Kelong Chemical Reagent Company	1330-20-7