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요약

여기에서는 맥락총의 유전자 발현을 선택적으로 변경하면서 다른 뇌 영역에는 영향을 주지 않는 방법을 설명합니다.

초록

맥락총(ChP)은 생리학적 및 병리학적 조건 모두에서 면역 세포가 중추신경계(CNS)로 침투하는 중요한 관문 역할을 합니다. 최근 연구에 따르면 ChP 활동을 조절하면 중추신경계 장애를 예방할 수 있습니다. 그러나 다른 뇌 영역에 영향을 주지 않고 ChP의 생물학적 기능을 연구하는 것은 섬세한 구조로 인해 어렵습니다. 이 연구는 아데노 관련 바이러스(AAV) 또는 TAT 서열(CRE-TAT)로 구성된 고리화 재조합 효소(Cre) 재조합 효소 단백질을 사용하여 ChP 조직에서 유전자 녹다운을 위한 새로운 방법을 제시합니다. 결과는 AAV 또는 CRE-TAT를 측심실에 주입한 후 형광이 ChP에만 집중되었음을 보여줍니다. 이 접근법을 사용하여 RNA 간섭(RNAi) 또는 X-overP1의 Cre/locus(Cre/LoxP) 시스템을 사용하여 ChP의 아데노신 A 2A 수용체(A2A R)를 성공적으로 녹다운하고 이 녹다운이 실험적 자가면역 뇌척수염(EAE)의 병리를 완화할 수 있음을 보여주었습니다. 이 기술은 중추신경계 장애에서 ChP의 역할에 대한 향후 연구에 중요한 영향을 미칠 수 있습니다.

서문

맥락총(ChP)은 뇌척수액(CSF)과 뇌 유래 신경영양인자(BDNF)를 분비하여 뇌 기능적 항상성을 유지하는 데 도움이 되는 것으로 여겨지곤 합니다1,2. 지난 30년 동안 진행된 연구에서 ChP가 면역 세포가 중추신경계(CNS)로 침투하는 뚜렷한 경로를 나타낸다는 사실이 밝혀졌습니다.

단층 ChP 상피로 구성된 ChP의 단단한 연접(TJ)은 거대분자와 면역세포가 뇌로 들어가는 것을 막아 면역학적 항상성을 유지한다3. 그러나 특정 병리학적 조건에서 ChP 조직은 뇌척수액과 혈액의 위험 관련 분자 패턴(DAMP)을 감지하고 반응하여 비정상적인 면역 침윤 및 뇌 기능 장애를 유발합니다 4,5. 중요한 역할에도 불구하고 ChP의 작은 크기와 뇌의 독특한 위치로 인해 다른 뇌 영역에 영향을 미치지 않고 기능을 연구하기가 어렵습니다. 따라서 ChP에서 유전자 발현을 특이적으로 조작하는 것은 그 기능을 이해하는 데 이상적인 접근 방식입니다.

초기에, ChP에서 발현된 유전자에 특이적인 프로모터의 제어 하에 Cre를 발현하는 고리화 재조합 효소(Cre) 형질전환 계통은 플록싱된 후보 유전자 6,7,8과 육종하여 표적 유전자를 삭제하는데 일반적으로 사용되었다. 예를 들어, 전사인자 포크헤드 박스 J1(FoxJ1)은 태아기 마우스 뇌(prenatal mouse brain)의 ChP 상피(ChP epithelium)에서만 독점적으로 발현된다(7). 따라서, FoxJ1-Cre 라인은 종종 ChP 6,9에 위치한 유전자를 삭제하는데 사용되었다. 그러나 이 전략의 성공은 프로모터의 특수성에 크게 의존합니다. FoxJ1은 뇌와 말초계의 다른 부분에 있는 섬모 상피 세포에도 존재하기 때문에 FoxJ1 발현 패턴이 충분히 뚜렷하지 않다는 것이 점차 발견되었다7. 이러한 한계를 극복하기 위해, Cre 재조합효소의 뇌뇌내 (ICV) 주사를 수행하여 플록스된 형질전환 라인의 심실로 재조합효소를 전달하였다. 이 전략은 ChP 조직10,11에서만 tdTomato 형광의 존재에 의해 입증 된 바와 같이 높은 특이성을 보여주었습니다. 그러나, 이 방법은 여전히 플록스된 형질전환 마우스 라인의 가용성에 의해 제한된다. 이 문제를 해결하기 위해 연구자들은 아데노 관련 바이러스(AAV)의 ICV 주입을 사용하여 ChP 특이적 녹다운 또는 표적 유전자12,13의 과발현을 달성했습니다. ChP 감염에 대한 다양한 AAV 혈청형을 종합적으로 평가한 결과, AAV2/5 및 AAV2/8은 ChP에서 강력한 감염 능력을 나타내면서 다른 뇌 영역은 감염시키지 않는 것으로 나타났습니다. 그러나 AAV2/8은 뇌실 주위의 뇌실막을 감염시키는 것으로 밝혀진 반면, AAV2/5 그룹은 감염을 나타내지 않았다14. 이 방법은 플록스드 형질전환 동물을 획득하는 한계를 극복할 수 있는 장점이 있다.

이 글에서는 아데노신 A 2A 수용체(A 2A R)의 shRNA를 운반하는 AAV2/5의 ICV와 A2A R의 ChP 특이적 knockdown을 달성하기 위해 TAT서열(CRE-TAT) 재조합효소로 구성된 Cre 재조합효소 단백질의 두 가지 방법을 사용하여 ChP에서 유전자 knockdown을 위한 단계별 프로토콜을 설명합니다. 연구 결과에 따르면 ChP에서 A2AR을 녹다운하면 실험적 자가면역 뇌척수염(EAE)을 완화할 수 있습니다. 이 상세한 프로토콜은 ChP 기능 연구 및 ChP 유전자의 특정 knockdown에 유용한 지침을 제공합니다.

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프로토콜

이 연구에 설명된 모든 동물 절차는 NIH Guide for the Care and Use of Laboratory Animals에 요약된 지침에 따라 수행되었으며 Wenzhou Medical University의 Institutional Animal Care and Use Committee에서 승인했습니다.

1. 동물

  1. 8-12주 되고 체중이 20-22g인 수컷 C57BL/6 마우스를 구입하십시오.
  2. 형질전환 Rosa-LSL(Lox-StoP-Lox)-tdTomato(Ai9) 마우스 라인 및 수컷 A2AR 플록스/플록스 마우스를 얻습니다.
  3. 생쥐를 무작위로 두 그룹에 할당하고 1주일 동안 표준 12시간 조명/12시간 어둡기 주기 하에서 케이지당 최대 5마리의 생쥐를 케이지에 넣습니다.
  4. 생쥐에게 충분한 먹이와 물을 제공하고 25°C의 일정한 온도로 유지합니다.

2. AAV2/5-shRNA를 이용한 A 2A Rs의 ChP 특이적 knockdown

  1. 각 마우스의 무게를 측정하고 값을 기록해 둡니다.
  2. 60-80mg/kg 펜토바르비탈에 해당하는 6-8mL/kg의 용량으로 1% 펜토바르비탈 나트륨으로 마우스를 복강내 마취하고 마우스를 가열 패드에 올려 따뜻하게 유지합니다.
    참고: 성공적인 수술을 위해서는 마우스의 체중에 따라 정확한 용량의 펜토바르비탈 나트륨을 투여하는 것이 중요합니다. 마취는 사망을 초래할 수 있으므로 너무 깊어서는 안 되지만 시술 중에 쥐가 깨어나 바이러스 주입의 효과에 잠재적으로 영향을 미칠 수 있으므로 너무 얕아서는 안 됩니다. 발가락을 꼬집어 적절한 마취량을 확인하고 쥐가 반응하지 않는지 확인하십시오.
  3. 특수 마우스 면도기를 사용하여 마취된 쥐의 윗털을 다듬습니다.
  4. 양쪽 눈에 안연고를 발라 건조를 방지하고, 쥐를 입체장치에 고정시켜 뇌를 고정시킨다. 멸균 드레이프로 동물을 덮으십시오.
  5. 수술 후 감염을 줄이기 위해 요오드포 소독제와 75% 알코올로 쥐의 머리와 목 피부를 3회 소독합니다. 그런 다음 1% 리도카인을 쥐의 두피에 국소적으로 바르고 현미경으로 두개골이 완전히 노출되도록 작게 절개합니다.
    알림: 절차 전반에 걸쳐 멸균 기구를 사용하십시오.
  6. 10μL 주사기 2개를 준비합니다: 하나는 AAV2/5-A 2A R-shRNA(역가: 6.27 × 10 9 vg/μL)를 구입하고 다른 하나는 AAV2/5-Scramble(역가:6.21× 109 vg/μL)을 구입합니다.
    알림: 주사기를 사용할 때 프런트 엔드를 유리 모세관에 연결해야 하며 유리 모세관의 길이를 제어하여 10μL의 범위를 얻을 수 있습니다.
  7. 현미경을 사용하여 브레그마와 람다를 찾고 좌표점(AP: -0.58; ML: ±1.10; DL: -2.20)을 10μL 주사기에 표시합니다(그림 1). 좌표점은 마우스 뇌 입체 아틀라스(15)를 기반으로 한다.
  8. 조정된 좌표 지점에서 두개골에 작은 구멍을 뚫습니다.
    알림: 현미경에서 드릴링은 두개골 표면에 대해 멸균 마이크로 드릴을 사용하여 수행됩니다. 시추 후 뇌를 덮고 있는 뇌수막을 제거하고 뇌 실질(parenchyma)을 노출시킴으로써 혈관 손상을 예방할 수 있습니다. 이 단계는 유리 모세관의 끝이 수막에 의해 부러지는 것을 방지합니다. 뚫린 구멍의 직경은 바늘 끝이 뇌 조직에 들어갈 수 있을 만큼 충분해야 합니다.
  9. AAV2/5-A 2A R-shRNA 바이러스2μL를 100nL/min의 일정한 속도로 측면 주입 을 통해 뇌실에 투여합니다. 빼기 전에 바늘을 10분 동안 제자리에 두십시오. 바이러스는 일방적인 주사로 투여되었습니다.
  10. 의료용 바이오피브린 접착제를 사용하여 손상된 피부를 즉시 밀봉하여 바이러스 손실을 방지하고, 접착제를 빨리 바르지 않으면 바늘을 제거한 후 CSF로 헹굴 수 있습니다. 또한 면봉으로 뇌척수액을 닦으면 바이러스가 손실될 수 있으므로 사용하지 마십시오.
  11. 회복을 촉진하려면 마우스를 온열 패드에 올려 체온을 37.0 ± 0.5 °C로 유지하고 1% 리도카인을 쥐의 두피에 국소적으로 바릅니다. 이 기간은 AAV2/5-A 2A R-shRNA 바이러스 발현 및 후속 A2AR knockdown에 필요하므로 EAE 모델을 유도하기 전에마우스를 2주 동안 회복시킵니다.

3. X-overP1(Cre/LoxP) 시스템의 Cre/locus를 사용한 A 2A R의 ChP 특이적 녹다운

참고: 다음 절차는 앞에서 설명한 방법을 사용하여 수행할 수 있습니다. 자세한 주입 방법은 2.1-2.11단계를 참조하십시오.

  1. 실험군으로 Rosa-LSL(Lox-StoP-Lox)-tdTomato 마우스의 각 외측심실에 2μL의 CRE-TAT 재조합효소를 주입하고 대조군으로 2μL의 멸균 인산염 완충 식염수(PBS)를 주입합니다. 위와 동일한 프로토콜(섹션 2)을 사용하여 2μL의 CRE-TAT 재조합효소를 대조군으로 2μL의 멸균 PBS와 함께A 2AR 플록스/플록스 마우스의 각 외측 심실에 주입합니다.
  2. 냉동 조직 절편을 준비하고 CRE-TAT 재조합효소 주입 후 2주 후에 핵 염색을 수행합니다. 자세한 내용은 4.1-4.3단계를 참조하십시오.

4. 생쥐의 심 경관류

  1. 60-80mg/kg의 펜토바르비탈 나트륨을 투여하여 생쥐를 깊이 마취시킵니다. 발가락 꼬집음으로 마취면을 확인하고 멸균 PBS 용액 40mL와 4% 파라포름알데히드(PFA) 20mL를 사용하여 심 경관류를 수행합니다.
    알림: 성공적인 관류는 간에서 흰색으로 표시되며 관류 중 폐가 커지거나 입에서 PBS 유출이 발생하면 절차가 실패했음을 나타냅니다.
  2. 쥐의 뇌를 빠르게 추출하여 단백질 분해를 최소화합니다.
  3. 고정 후 마우스 뇌를 4% PFA/PBS에 하룻밤 동안 담근 다음 30% 자당 PB 용액으로 72시간 동안 교체합니다.
    참고: 뇌 조직의 과도한 탈수를 피하는 것이 중요하므로 뇌를 자당 PB 용액에 너무 오래 방치해서는 안 됩니다.

5. 냉동 조직 절편 및 염색

  1. 이전에 탈수된 쥐의 뇌를 최적의 절단 온도(OCT) 접착제에 삽입하고, 내장된 뇌를 동결하고, 슬라이딩 마이크로톰을 사용하여 20μm 두께의 관상 절편을 절단합니다.
  2. 유리 슬라이드에 뇌 부분을 놓습니다. 뇌 절편이 건조되면 후속 실험을 위해 -20°C 냉장고에 보관합니다.
  3. 각 유리 슬라이드를 프레임 케이스에 넣고 PBS로 채워진 용기에 프레임을 담가 슬라이드를 완전히 헹굽니다. PBS 용액으로 뇌 슬라이드를 10분 동안 세 번 부드럽게 헹굽니다.
    알림: 뇌 부분이 유리 슬라이드에서 떨어지지 않도록 주의해야 합니다.
  4. 4′,6-diamidino-2-phenylindole(DAPI) 용액으로 10분 동안 뇌 슬라이드를 염색합니다.
  5. PBS 용액으로 5분 동안 브레인 슬라이드를 헹굽니다.
  6. 안티페이드 마운팅 배지 한 방울을 뇌 부위에 바릅니다.
  7. 뇌 절편에 커버슬립을 씌우고, 매니큐어로 커버슬립을 밀봉한 다음, 기존의 형광 현미경을 사용하여 절편을 분석합니다.

6. EAE 감응작용

NOTE: shRNA 또는 CRE-TAT 재조합효소 주입 2주 후 EAE 유도를 수행합니다11.

  1. 2.5mg의 미엘린 희소돌기아교세포 당단백질(MOG35-55)과 2mL의 PBS를 혼합하여 수용액을 만듭니다. M. tuberculosis (H37Ra)와 불완전 Freunds 보조제(IFA)를 혼합하여 완전한 Freunds adjuvant(CFA) 오일 용액을 준비합니다.
  2. 수용액과 오일 용액을 1:1 비율로 혼합합니다. 티 파이프를 사용하여 혼합물을 수중 오일 상태로 휘젓습니다.
    알림: 티 파이프는 3방향 파이프라고도 합니다. MOG35-55 와 CFA를 완전히 혼합하기 위해 용액의 흐르는 방향을 제어할 수 있는 플라스틱 튜브입니다.
  3. 고속 균질화기를 사용하여 얼음 수조 조건에서 EAE 모델용 MOG 항원 에멀젼을 만듭니다.
  4. 60-80mg/kg 펜토바르비탈에 해당하는 6-8mL/kg의 용량으로 1% 펜토바르비탈 나트륨으로 마우스를 복강내로 마취합니다.
  5. MOG 항원 에멀젼을 4개의 다른 지점(목, 등, 좌우 엉덩이)에 10mL/kg의 부피로 피하 주사하여 각각 총 4회 주사합니다.
    참고: 주사 부위를 신중하게 선택하는 것이 중요합니다., 다른 부위가 쥐의 이환율과 사망률에 다양한 영향을 미칠 수 있기 때문에. 또한 MOG 주사를 반복하면 면역 내성이 생길 수 있으므로 연구팀은 이러한 잠재적인 문제를 방지하기 위해 단일 주사 방법을 선택했습니다.
  6. MOG 주입 후 즉시 5mg/kg의 용량으로 500ng/mL의 백일해 독소(PT)를 복강내로 주사합니다.
    참고: PT는 혈액뇌장벽(BBB)의 투과성을 증가시키고 T 세포가 뇌로 침투하는 것을 촉진합니다.
  7. 48시간 후 PT 용액을 동일한 부피로 복강내 주사합니다.

7. 신경학적 결손 점수

  1. 다음과 같은 신경학적 결함에 따라 EAE의 발생률과 중증도를 평가하기 위해 0에서 15까지의 평가 척도16 을 사용하여 매일 마우스를 평가하고 등급을 매깁니다.
    꼬리: 0은 징후가 없음을 나타내고, 1은 반쯤 마비된 꼬리를 나타내고, 2는 완전히 마비된 꼬리를 나타냅니다.
    팔다리: 0은 징후가 없음을 나타내고, 1은 약하거나 변화된 걸음걸이를 나타내고, 2는 마비를 나타내고, 3은 완전히 마비된 팔다리를 나타냅니다.
  2. 완전 마비가 있는 사지 마비 동물에게 12점을 할당하고 사망률에 15점을 할당합니다.

8. 헤마톡실린-에오신(H&E) 염색

  1. 탈수된 쥐의 뇌를 녹인 파라핀에 집어넣는다. 나중에 사용할 수 있도록 파라핀 블록을 식히고 응고시키십시오.
    알림: 파라핀 블록은 조직 손상을 방지하기 위해 완전히 건조되고 차갑어야 합니다.
  2. 생쥐 뇌 파라핀 블록을 5μm 두께의 슬라이드로 자릅니다. 파라핀 마우스 뇌 절편을 유리 슬라이드에 놓고 60°C 오븐에서 3시간 동안 건조시킵니다.
  3. 슬라이드를 크실렌 용액 I에 10분, 크실렌 용액 II에 10분, 100% 알코올 I에 3분, 100% 알코올 II에 3분, 95% 알코올에 3분, 90% 알코올에 3분, 80% 알코올에 3분, 70% 알코올에 3분, 증류수에 순차적으로 담그십시오.

9. 정량적 중합효소연쇄반응(qPCR) 분석

  1. PBS로 마우스를 관류한 후 심실에서 ChP를 제거하고 Trizol로 RNA를 추출합니다. 첫 번째 Strand cDNA Synthesis Kit를 사용하여 cDNA를 합성합니다.
  2. Ex Taq SYBR-green 프리믹스 및 Real-Time PCR 시스템을 사용하여 qPCR 분석을 수행합니다. 다음 A2AR 프라이머를 사용하십시오 : 앞으로 - GCCATCCCATTCGCCATCA; 역 - GCAATAGCCAAGAGGCTGAAGA.

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결과

AAV2/5-shRNA 또는 CRE-TAT의 ICV 주입에 의한 ChP 특이적A 2AR knockdown
EAE 발병기전에서 신경 정보의 강력한 조절자로서 ChP에서A 2AR의 역할은 불분명합니다. ChP 특이적 A 2A R 발현을 녹다운하면 EAE 및 기타 신경계 염증의 중추 면역 체계에 대한 A2AR 조절 효과를 밝힐 수 있습니다. 이 연구는 CRE-TAT의 ICV 주입을 사용하여 A 2A R 플록스/플록스 마우스의 ChP?...

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토론

이 연구는 ChP 유전자의 표적 녹다운에 대한 두 가지 뚜렷한 접근 방식을 제시했습니다. 첫 번째 접근법은 Cre 재조합 효소를 함유한 CRE-TAT를 A2AR 플록스/플록스 마우스에 ICV로 주입하는 것이었습니다. 두 번째 접근법은 A2AR의 shRNA를 운반하는 AAV2/5의 ICV 주입을 수반했습니다. 이 두 가지 전략을 활용함으로써 ChP 내에서 A 2A R의 선택적 녹다운을 달성하고 EAE 병리학에 대한 ChP?...

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공개

저자는 경쟁하는 재정적 이익이나 선언할 기타 공개가 없다고 말합니다.

감사의 말

우리는 이 작업에 대한 중국 국립 자연 과학 재단(보조금 번호 31800903, W. Zheng에게 수여)과 Wenzhou Science and Technology Project(No. Y2020426, Y. Y. Weng에게 수여)의 지원에 감사드립니다.

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자료

NameCompanyCatalog NumberComments
A2ARflox/flox miceState Key Laboratory of Ophthalmology, Optometry and Visual Science, Wenzhou Medical University
AAV2/5-A2AR-ShRNA virusShanghai Heyuan Biotechnology Co. LTDpt-4828
antifade mounting mediumBeyotime Biotechnology0100-01
borosilicate glass capillaryBeijing Meiyaxian Technology Co. LtdB100-50-10
brain stereotaxic apparatusRWD, Shenzhen69100
C57BL/6 miceBeijing Vital Charles River Laboratory Animal Technology Company
CRE-TAT recombinaseMilliporeSCR508
DAPIAbsinB25A031
frozen slicing machineLeicaCM1950
H37RaBecton Dickinson and company231141
Hamilton syringeHamilton, AmericanP/N: 86259
Incomplete Freunds adjuvantSigmaF5506
Laser confocal microscopeZeissLSM900
MOG35-55Suzhou Qiangyao Biotechnology Co., LTD4010006243
OCT glueEpredia6502p
paraformaldehydeChengdu Kelong Chemical Reagent Company30525-89-4
pentobarbital sodiumBoyun BiotechPC13003
Pipette gunEppendorfN45014F
PrimeScript 1st Strand cDNA Synthesis KitTakara 6110A
Real- Time PCR SystemBioRadCFX96
Rosa-LSL (Lox-StoP-Lox)-tdTomato miceJackson Laboratory
sucroseSangon BiotechA502792-0500
super high speed homogenizerIKA3737025
TrizolInvitrogen15596026
xylene solutionChengdu Kelong Chemical Reagent Company1330-20-7

참고문헌

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