맥락총(Choroid Plexus)에서 유전자의 표적 녹다운(Targeted knockdown of Genes in the Choroid Plexus)

요약

여기에서는 맥락총의 유전자 발현을 선택적으로 변경하면서 다른 뇌 영역에는 영향을 주지 않는 방법을 설명합니다.

초록

맥락총(ChP)은 생리학적 및 병리학적 조건 모두에서 면역 세포가 중추신경계(CNS)로 침투하는 중요한 관문 역할을 합니다. 최근 연구에 따르면 ChP 활동을 조절하면 중추신경계 장애를 예방할 수 있습니다. 그러나 다른 뇌 영역에 영향을 주지 않고 ChP의 생물학적 기능을 연구하는 것은 섬세한 구조로 인해 어렵습니다. 이 연구는 아데노 관련 바이러스(AAV) 또는 TAT 서열(CRE-TAT)로 구성된 고리화 재조합 효소(Cre) 재조합 효소 단백질을 사용하여 ChP 조직에서 유전자 녹다운을 위한 새로운 방법을 제시합니다. 결과는 AAV 또는 CRE-TAT를 측심실에 주입한 후 형광이 ChP에만 집중되었음을 보여줍니다. 이 접근법을 사용하여 RNA 간섭(RNAi) 또는 X-overP1의 Cre/locus(Cre/LoxP) 시스템을 사용하여 ChP의 아데노신 A 2A 수용체(A_2A R)를 성공적으로 녹다운하고 이 녹다운이 실험적 자가면역 뇌척수염(EAE)의 병리를 완화할 수 있음을 보여주었습니다. 이 기술은 중추신경계 장애에서 ChP의 역할에 대한 향후 연구에 중요한 영향을 미칠 수 있습니다.

서문

맥락총(ChP)은 뇌척수액(CSF)과 뇌 유래 신경영양인자(BDNF^)를 분비하여 뇌 기능적 항상성을 유지하는 데 도움이 되는 것으로 여겨지곤 합니다^1,2. 지난 30년 동안 진행된 연구에서 ChP가 면역 세포가 중추신경계(CNS)로 침투하는 뚜렷한 경로를 나타낸다는 사실이 밝혀졌습니다.

단층 ChP 상피로 구성된 ChP의 단단한 연접(TJ)은 거대분자와 면역세포가 뇌로 들어가는 것을 막아 면역학적 항상성을 유지한다³. 그러나 특정 병리학적 조건에서 ChP 조직은 뇌척수액과 혈액의 위험 관련 분자 패턴(DAMP)을 감지하고 반응하여 비정상적인 면역 침윤 및 뇌 기능 장애를 유발합니다 ^4,5. 중요한 역할에도 불구하고 ChP의 작은 크기와 뇌의 독특한 위치로 인해 다른 뇌 영역에 영향을 미치지 않고 기능을 연구하기가 어렵습니다. 따라서 ChP에서 유전자 발현을 특이적으로 조작하는 것은 그 기능을 이해하는 데 이상적인 접근 방식입니다.

초기에, Ch....

프로토콜

이 연구에 설명된 모든 동물 절차는 NIH Guide for the Care and Use of Laboratory Animals에 요약된 지침에 따라 수행되었으며 Wenzhou Medical University의 Institutional Animal Care and Use Committee에서 승인했습니다.

1. 동물

1. 8-12주 되고 체중이 20-22g인 수컷 C57BL/6 마우스를 구입하십시오.
2. 형질전환 Rosa-LSL(Lox-StoP-Lox)-tdTomato(Ai9) 마우스 라인 및 수컷 A_2AR 플록^{스/플록스} 마우스를 얻습니다.
3. 생쥐를 무작위로 두 그룹에 할당하고 1주일 동안 표준 12시간 조명/12시간 어둡기 주기 하에서 케이지당 최대 5마리의 생쥐를 케이지에 넣습니다.
4. 생쥐에게 충분한 먹이와 물을 제공하고 25°C의 일정한 온도로 유지합니다.

2. AAV2/5-shRNA를 이용한 A 2A Rs의 ChP 특이적 knockdown<....

토론

이 연구는 ChP 유전자의 표적 녹다운에 대한 두 가지 뚜렷한 접근 방식을 제시했습니다. 첫 번째 접근법은 Cre 재조합 효소를 함유한 CRE-TAT를 A_2AR 플록^{스/플록스} 마우스에 ICV로 주입하는 것이었습니다. 두 번째 접근법은 A_2AR의 shRNA를 운반하는 AAV2/5의 ICV 주입을 수반했습니다. 이 두 가지 전략을 활용함으로써 ChP 내에서 A 2A R의 선택적 녹다운을 달성하고 EAE 병리학에 대한 ChP?.......

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
A2ARflox/flox mice	State Key Laboratory of Ophthalmology, Optometry and Visual Science, Wenzhou Medical University
AAV2/5-A2AR-ShRNA virus	Shanghai Heyuan Biotechnology Co. LTD	pt-4828
antifade mounting medium	Beyotime Biotechnology	0100-01
borosilicate glass capillary	Beijing Meiyaxian Technology Co. Ltd	B100-50-10
brain stereotaxic apparatus	RWD, Shenzhen	69100
C57BL/6 mice	Beijing Vital Charles River Laboratory Animal Technology Company
CRE-TAT recombinase	Millipore	SCR508
DAPI	Absin	B25A031
frozen slicing machine	Leica	CM1950
H37Ra	Becton Dickinson and company	231141
Hamilton syringe	Hamilton, American	P/N: 86259
Incomplete Freunds adjuvant	Sigma	F5506
Laser confocal microscope	Zeiss	LSM900
MOG35-55	Suzhou Qiangyao Biotechnology Co., LTD	4010006243
OCT glue	Epredia	6502p
paraformaldehyde	Chengdu Kelong Chemical Reagent Company	30525-89-4
pentobarbital sodium	Boyun Biotech	PC13003
Pipette gun	Eppendorf	N45014F
PrimeScript 1st Strand cDNA Synthesis Kit	Takara	6110A
Real- Time PCR System	BioRad	CFX96
Rosa-LSL (Lox-StoP-Lox)-tdTomato mice	Jackson Laboratory
sucrose	Sangon Biotech	A502792-0500
super high speed homogenizer	IKA	3737025
Trizol	Invitrogen	15596026
xylene solution	Chengdu Kelong Chemical Reagent Company	1330-20-7