脂肪来源的间充质基质细胞与原代混合胶质细胞共培养，以减少朊病毒诱导的炎症

摘要

脂肪来源的间充质基质细胞 （AdMSC） 具有有效的免疫调节特性，可用于治疗与炎症相关的疾病。我们演示了如何分离和培养小鼠 AdMSCs 和原代混合胶质细胞，刺激 AdMSCs 上调抗炎基因和生长因子，评估 AdMSCs 的迁移，以及将 AdMSCs 与原代混合朊病毒感染的神经胶质细胞共培养。

摘要

间充质基质细胞 （MSC） 是通过产生抗炎细胞因子、趋化因子和生长因子来有效调节炎症的。这些细胞在神经退行性疾病（如朊病毒病和其他蛋白质错误折叠疾病）的背景下显示出调节神经炎症的能力。朊病毒病可以是散发的、获得性的或遗传性的;它们可能是由于朊病毒蛋白在大脑中的错误折叠和聚集造成的。这些疾病总是致命的，没有可用的治疗方法。

疾病的最早迹象之一是星形胶质细胞和小胶质细胞的激活以及相关的炎症，这发生在可检测到的朊病毒聚集和神经元丢失之前;因此，MSCs的抗炎和调节特性可用于治疗朊病毒病中的星形胶质细胞增生。最近，我们发现脂肪来源的间充质干细胞（AdMSCs）与BV2细胞或原代混合胶质细胞共培养，通过旁分泌信号传导减少朊病毒诱导的炎症。本文描述了一种使用刺激的AdMSCs来减少朊病毒诱导的炎症的可靠治疗方法。

AdMSCs的杂合子群体可以很容易地从小鼠脂肪组织中分离出来，并在培养物中扩增。用炎性细胞因子刺激这些细胞可增强它们向朊病毒感染的大脑匀浆迁移并产生抗炎调节剂作为反应的能力。总之，这些技术可用于研究间充质干细胞对朊病毒感染的治疗潜力，并可用于其他蛋白质错误折叠和神经炎症性疾病。

引言

神经胶质炎症在多种神经退行性疾病中起着关键作用，包括帕金森氏症、阿尔茨海默氏症和朊病毒病。尽管异常蛋白质聚集归因于大部分疾病发病机制和神经退行性变，但神经胶质细胞也在加剧这种 ^1,2,3 中起作用。因此，靶向神经胶质诱导的炎症是一种很有前途的治疗方法。在朊病毒病中，细胞朊病毒蛋白 （PrP^C） 与疾病相关的朊病毒蛋白 （PrP^Sc） 错误折叠，后者形成寡聚体和聚集体并破坏大脑中的稳态 ^4,5,6。

朊病毒病的最早迹象之一是星形胶质细胞和小胶质细胞的炎症反应。通过去除小胶质细胞或修饰星形胶质细胞来抑制这种反应的研究通常显示，在动物模型中，疾病发病机制没有改善或恶化 ^7,8,9。在不消除胶质炎症的情况下调节神经胶质炎症是一种有趣的治疗方法。

间充质基质细胞 （MSCs） 因其能够以旁分泌方式调节炎症而成为治疗多种炎症性疾病的舞台 ^10,11。它们已经显示出迁移到炎症部位的能力，并通过分泌抗炎分子、生长因子、microRNA 等来对这些环境中的信号分子做出反应 10,12,13。我们之前已经证明，源自脂肪组织的间充质干细胞（表示为 AdMSCs）能够迁移到朊病毒感染的脑匀浆体，并通过上调抗炎细胞因子和生长因子的基因表达来对这种脑匀浆做出反应。

此外，AdMSCs 可以降低 BV2 小胶质细胞和原代混合胶质细胞 ¹⁴ 中与核因子-κB （NF-κB）、含 3 的 Nod 样受体家族 pyrin 结构域 （NLRP3） 炎症小体信号传导和神经胶质细胞激活相关的基因表达。在这里，我们提供了如何从小鼠中分离AdMSCs和原代混合胶质细胞，刺激AdMSCs上调调节基因，评估AdMSCs迁移以及将AdMSCs与朊病毒感染的胶质细胞共培养的方案。我们希望这些程序可以为进一步研究MSCs在调节神经退行性疾病和其他疾病中神经胶质诱导的炎症中的作用提供基础。

研究方案

小鼠在科罗拉多州立大学的实验室动物资源中心繁殖和维护，该资源公司由实验室动物护理国际评估和认证协会认证，符合协议#1138，由科罗拉多州立大学机构动物护理和使用委员会批准。

1.用朊病毒分离和感染原代皮质混合胶质细胞

1. 为了分离含有星形胶质细胞和小胶质细胞的初级混合胶质细胞，获得0至2天大的C57Bl / 6小鼠幼崽。
   注意:该协议改编自以前的协议 ^15,16。
2. 通过斩首一次对一只幼崽实施安乐死，并提取它们的大脑，分离并丢弃小脑和脑干。
   1. 将大脑放入含有冷 MEM/EBSS 和 2x 青霉素/链霉素/新霉素 （PSN） 的 3 cm 培养皿中。在解剖镜下，分离大脑半球，切除并丢弃中脑。从皮层中取出并丢弃海马体和脑膜。
   2. 将两个皮质半球放入含有 5 mL MEM/EBSS + 2x PSN 的 50 mL 锥形管中，然后置于冰上。
3. 在组织培养罩中，用移液管轻轻吸出 50 mL 锥形管，将培养基留在管底部，从 50 mL 锥形管中取出培养基。使用涂层玻璃移液管，加入 10 mL 预热的解离培养基，并用玻璃移液管研磨组织 10-20x。
4. 将悬浮液转移到含有小搅拌棒的 50 mL 烧杯中，并以最低设置（约 30 rpm）置于搅拌板上 10 分钟。从搅拌板中取出烧杯，将其以30°角放置3分钟，使组织沉淀在底部。取出细胞悬液（上清液）并转移到冰上的新 50 mL 锥形管中。
5. 将 DNase-I （4,000 U/mL） 加入 10 mL 解离培养基中，重悬组织并再搅拌 10 分钟。重复上述步骤，再加入新鲜解离培养基（不含DNase-I）2-4次（每使用两只小鼠幼崽一次），并将细胞悬浮液转移到冰上的50mL锥形管中，直到烧杯底部仅保留纤维组织。
6. 将锥形管中的细胞悬浮液在4°C下以1,000× g 离心10分钟。 吸出上清液并用神经胶质生长培养基替换。用血细胞计数器计数细胞，并在10cm细胞培养处理的培养皿中以10⁶ 的密度铺板细胞。置于37°C的培养箱中，含5%CO₂。
7. 24小时后，取出培养基并用新鲜的神经胶质培养基替换。让细胞在 2 周内达到 100% 汇合;然后，将它们分开并铺板进行实验。
8. 对于 体外朊 病毒感染，在 6 孔板中以每孔 100,000 个细胞铺板胶质细胞，并允许达到 80%-100% 汇合度。在添加到细胞培养物中之前，将脑匀浆（包括朊病毒和正常物）在 PBS 中稀释至 20% 暴露于紫外线下 30 分钟。从要感染的胶质细胞中吸出培养基，并向每个孔中加入 1.5-2 mL 神经胶质生长培养基，其最终体积为 0.1% 正常或朊病毒脑匀浆。
9. 72小时后，吸出培养基并用PBS洗涤细胞以除去任何残留的脑匀浆。用新鲜的神经胶质生长培养基（不含脑匀浆）代替。
10. 要分离 AdMSCs 细胞，请使用血清学移液管并轻轻吸出脂肪组织以及 ~1 mL HBSS/胰蛋白酶溶液。转移到含有 2 mL DMEM/F12 培养基的 4 cm 培养皿中，该培养基含有 200 U/mL DNase-I 和 400 U/mL 胶原酶/分散酶混合物。用小剪刀将脂肪组织块切成小块（大小小于5mm），并在37°C下孵育1.5小时。
11. 用血清移液管将培养皿的内容物转移到 50 mL 锥形管中，并用移液管研磨混合物 ~10 次。确保组织容易分裂并形成相对均匀的混合物。将混合物在4°C下以1,000× g 离心5分钟，以沉淀基质血管部分，其将显示为红色。
12. 小心吸出上清液，用5mL预热的无菌PBS洗涤沉淀，并在4°C下以1,000× g 离心3分钟。吸出上清液并将沉淀重悬于 1 mL AdMSC 培养基（含有 L-谷氨酰胺的低葡萄糖 DMEM，并补充有 15% 热灭活胎牛血清 （hiFBS）、1% 氨基酸、1% 非必需氨基酸和 1% PSN）中。
13. 将 40 μm 细胞过滤器放在新鲜无菌 50 mL 锥形管的顶部，并通过过滤器吸取细胞悬液以去除任何未解离的组织。将 9 mL AdMSC 培养基加入 10 cm 细胞培养处理的培养皿中，并将过滤的细胞悬浮液移入培养皿中。置于37°C的培养箱中，含5%CO₂。
14. 第二天取出并更换为新的 AdMSC 培养基。等待细胞达到80-90%汇合，当它们准备好在72小时和96小时之间传代时。
15. 如上所述分离 AdMSC 并传代两次以获得一致的均一群体 ¹⁴。用无菌 PBS 洗涤细胞两次，并将 2 mL 预热的胰蛋白酶 （0.25%） 移液到每个板上。将细胞在37°C下孵育5分钟或直到它们完全从板中脱落。向每个板中加入8mL预热的AdMSC培养基，移液以混合细胞悬浮液，转移到锥形管中，并在4°C下以1,000× g 离心以沉淀。
16. 将 AdMSC 重悬于 3-10 mL 培养基中（取决于使用的板数），并使用血细胞计数器对细胞进行计数。将 100,000 个细胞/孔板铺在含有 AdMSC 培养基的 6 孔板中。置于37°C的培养箱中，加入5%CO₂ 过夜。
17. 第二天，用细胞因子或脑匀浆刺激细胞。
    1. 对于细胞因子刺激的细胞，制备含有 10 ng/mL TNFα 或 200 ng/mL IFNγ 的 AdMSC 培养基。使用新鲜培养基进行控制孔。
    2. 对于朊病毒感染的脑匀浆处理，从终末感染的朊病毒小鼠（22L或RML菌株）中获得20%的脑匀浆（在PBS中）。制备终浓度为 0.1% 朊病毒感染或正常脑匀浆的 AdMSC 培养基用于对照。
    3. 从孔中吸出培养基，然后吸取 1.5 mL 含细胞因子或脑匀浆的培养基到相应的孔中。一式三份执行。将板放回培养箱。
18. 取出培养基，用预热的 PBS 洗涤细胞 2 次，通过向每个孔中加入 350 mL 含有 1% βME 的裂解缓冲液来分离 RNA，并使用细胞提升器去除细胞裂解物。按照小型试剂盒制造商的方案进行 RNA 分离，包括 DNase 酶解步骤。对于 RT-qPCR，每个样品逆转录 25 ng RNA，并使用 SYBR Green 和每个基因的引物以 10 mM 扩增 cDNA。使用 ^2-ΔΔCT 方法分析 mRNA 表达，并归一化为参考基因 β-肌动蛋白 ¹⁷ 的表达。
    注意:所有RT-PCR均按照MIQE指南进行。
19. 在 6 孔板中以每孔 50,000 个细胞的速度铺板 BV2 小胶质细胞，或以每孔 100,000 个细胞的速度铺板原代混合胶质细胞。第二天用含有0.1%朊病毒感染或正常脑匀浆的培养基处理BV2细胞。对于混合胶质细胞，等到细胞达到 80-90% 汇合以感染脑匀浆。
20. 将细胞在含有脑匀浆的培养基中孵育 72 小时。用 PBS 洗涤细胞 2 次以去除剩余的脑匀浆，加入新鲜培养基并返回培养箱。
21. 在第 3 次传代使用 AdMSCs 进行共培养。如果刺激 AdMSCs，使用含有 10 ng/mL TNFα 的培养基并在与 BV2 或混合胶质细胞共培养之前处理 24 小时。用 PBS 洗涤刺激的 AdMSCs 3 次，以去除任何残留的 TNFα。
22. 如步骤1.15中所述，胰蛋白酶消化AdMSCs，并重悬于AdMSC培养基中。
23. 将AdMSC悬浮液在4°C下以1,000× g 旋转5分钟。在此期间，用每孔 2 mL 的 AdMSC 培养基替换 BV2 细胞或混合胶质细胞上的培养基，并将孔径为 0.4 微米的 6 孔板插入物放入一半的孔中。向每个插入片段中加入 2 mL AdMSC 培养基，向不接收插入片段的孔中加入另外 2 mL 培养基。
24. 完成 AdMSC 沉淀后，将沉淀重悬于 AdMSC 培养基中。用血细胞计数器计数 AdMSCs，并向每个插入片段中加入 50,000-100,000 个细胞。
25. 对于 BV2 细胞，将共培养物孵育 24 小时。对于混合胶质细胞，孵育最短 24 小时，最多孵育 7 天。
26. 与 AdMSC 孵育所需时间后，取出插入片段并丢弃，或将它们放入新的 6 孔板中，用 PBS 洗涤插入物 2 次，将 RNA 分离试剂盒提供的缓冲液添加到混合胶质细胞或 BV2 细胞中，并刮取插入片段以分析 AdMSC RNA。
27. 在第 2 代用含有 10 ng/mL TNFα 的培养基处理 AdMSCs。第二天，用预热的无菌 PBS 洗涤细胞 3x，并在无血清 AdMSC 培养基中孵育 4 小时。
28. 为了进行迁移细胞测定，每个插入片段添加25,000个AdMSCs，并在37°C下孵育细胞24小时。 在此期间，迁移细胞将从插入物的顶部腔室移动并粘附在插入物的底部。小心地吸出孔和插入物的内容物，并用 PBS 洗涤 2 次，在每个孔中留下 1 mL PBS，以确保插入物每侧保持湿气。
29. 一次一个，使用镊子，取出插入物，然后用棉签轻轻但彻底地擦拭顶部腔室，以去除任何尚未迁移的细胞。吸出剩余的 PBS 并将 500 μL 结晶紫溶液移液到插入物的孔室和顶部室，确保插入物膜完全浸没。
30. 在室温下将插入物在结晶紫溶液中孵育1小时。为了最好地保留颜色，请快速执行后续步骤，一次只插入一个。
    1. 从插入物的孔和顶部室中吸出结晶紫溶液，并用PBS洗涤3次。再次用棉签擦拭顶部腔室。
    2. 将插入物放入含有 1 mL PBS 的新 24 孔板的孔中。将板放在装有摄像头的倒置显微镜上方。使用 10 倍物镜，拍摄朝向插入物中心的四个随机区域的图像，仅聚焦在插入物的底部。
31. 对每个孔执行此操作后，将图像上传到所选的图像处理软件，并调整背景以增强与紫色染色细胞的对比度。使用细胞计数器手动计数细胞。

结果

用TNFα或干扰素-γ（IFNγ）刺激AdMSCs24小时诱导抗炎分子和生长因子表达的变化。用 TNFα 或干扰素-γ （IFNγ） 处理 AdMSCs 会增加 TNF 刺激的基因 6 （TSG-6） mRNA，而 TNFα 而不是 IFNγ 会导致转化生长因子 β-1 （TGFβ-1） mRNA 的增加。用TNFα或IFNγ刺激可诱导血管内皮生长因子（VEGF）mRNA增加，但成纤维细胞生长因子（FGF）mRNA的表达没有变化（图1A）。这些数据表明，AdM...

讨论

在这里，我们展示了一种可靠且相对便宜的方案，用于评估脂肪来源的间充质基质细胞（AdMSCs）在神经胶质细胞模型中减少朊病毒诱导的炎症的影响。AdMSCs可以很容易地在培养物中分离和扩增，可在短短1周内使用。该方案一致地产生异源细胞群，这些细胞群通过免疫荧光和流式细胞术表达与间充质基质细胞一致的标记物，并且在引入细胞因子或朊病毒感染的脑匀浆时保持免疫功能^14<...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.25% Trypsin	Cytiva	SH30042.01
5 mL serological pipets	Celltreat	229005B
6-well tissue culture plates	Celltreat	229106
10 cm cell culture dishes	Peak Serum	PS-4002
10 ml serological pipets	Celltreat	229210
15 mL conical tubes	Celltreat	667015B
50 mL conical tubes	Celltreat	667050B
BV2 microglia cell line	AcceGen Biotech	ABC-TC212S
Cell lifter	Biologix Research Company	70-2180
Crystal violet	Electron Microscopy Sciences	12785
Dispase	Thermo Scientific	17105041
DMEM/F12	Caisson Labs	DFL14-500ML
DNase-I	Sigma Aldrich	11284932001
Essential amino acids	Thermo Scientific	11130051
Ethanol (100%)	EMD Millipore	EX0276-1
Fetal bovine serum (heat inactivated)	Peak Serum	PS-FB4	Can be purchased as heat inactivated or inactivated in the laboratory
Formaldehyde	EMD Millipore	1.04003.1000
Glass 10 mL serological pipet	Corning	7077-10N
Hank’s Balances Salt Solution	Sigma Aldrich	H8264-500ML
Hemocytometer/Neubauer Chamber	Daigger	HU-3100
High Glucose DMEM	Cytiva	SH30022.01
low glucose DMEM containing L-glutamine	Cytiva	SH30021.01
MEM/EBSS	Cytiva	SH30024.FS
non-essential amino acids	Sigma-Aldrich	M7145-100M
Paraformaldehyde (16%)	MP Biomedicals	219998320
Penicillin/streptomycin/neomycin	Sigma-Aldrich	P4083-100ML
Phosphate buffered saline	Cytiva	SH30256.01
Recombinant Mouse IFN-gamma Protein	R&D Systems	485-MI
Recombinant Mouse TNF-alpha (aa 80-235) Protein, CF	R&D Systems	410-MT
RNeasy mini kit	Qiagen	74104
Sigmacote	Sigma Aldrich	SL2-100ML	Coat inside of glass pipets by aspirating up and down twice in Sigmacote and allowing to dry thoroughly. Wrap in aluminum foil and autoclave pipets 24 h later.
Stemxyme	Worthington Biochemical Corporation	LS004106	Collagenase/Dispase mixture
Sterile, individually wrapped cotton swab	Puritan Medical	25-8061WC
Thincert Tissue Culture Inserts, 24 well, Pore Size=8 µm	Greiner Bio-One	662638
Thincert Tissue Culture Inserts, 6 well, Pore Size=0.4 µm	Greiner Bio-One	657641