脂肪来源的间充质基质细胞与原代混合胶质细胞共培养，以减少朊病毒诱导的炎症

摘要

脂肪来源的间充质基质细胞 （AdMSC） 具有有效的免疫调节特性，可用于治疗与炎症相关的疾病。我们演示了如何分离和培养小鼠 AdMSCs 和原代混合胶质细胞，刺激 AdMSCs 上调抗炎基因和生长因子，评估 AdMSCs 的迁移，以及将 AdMSCs 与原代混合朊病毒感染的神经胶质细胞共培养。

摘要

间充质基质细胞 （MSC） 是通过产生抗炎细胞因子、趋化因子和生长因子来有效调节炎症的。这些细胞在神经退行性疾病（如朊病毒病和其他蛋白质错误折叠疾病）的背景下显示出调节神经炎症的能力。朊病毒病可以是散发的、获得性的或遗传性的;它们可能是由于朊病毒蛋白在大脑中的错误折叠和聚集造成的。这些疾病总是致命的，没有可用的治疗方法。

疾病的最早迹象之一是星形胶质细胞和小胶质细胞的激活以及相关的炎症，这发生在可检测到的朊病毒聚集和神经元丢失之前;因此，MSCs的抗炎和调节特性可用于治疗朊病毒病中的星形胶质细胞增生。最近，我们发现脂肪来源的间充质干细胞（AdMSCs）与BV2细胞或原代混合胶质细胞共培养，通过旁分泌信号传导减少朊病毒诱导的炎症。本文描述了一种使用刺激的AdMSCs来减少朊病毒诱导的炎症的可靠治疗方法。

AdMSCs的杂合子群体可以很容易地从小鼠脂肪组织中分离出来，并在培养物中扩增。用炎性细胞因子刺激这些细胞可增强它们向朊病毒感染的大脑匀浆迁移并产生抗炎调节剂作为反应的能力。总之，这些技术可用于研究间充质干细胞对朊病毒感染的治疗潜力，并可用于其他蛋白质错误折叠和神经炎症性疾病。

引言

神经胶质炎症在多种神经退行性疾病中起着关键作用，包括帕金森氏症、阿尔茨海默氏症和朊病毒病。尽管异常蛋白质聚集归因于大部分疾病发病机制和神经退行性变，但神经胶质细胞也在加剧这种 ^1,2,3 中起作用。因此，靶向神经胶质诱导的炎症是一种很有前途的治疗方法。在朊病毒病中，细胞朊病毒蛋白 （PrP^C） 与疾病相关的朊病毒蛋白 （PrP^Sc） 错误折叠，后者形成寡聚体和聚集体并破坏大脑中的稳态 ^4,5,6。

朊病毒病的最早迹象之一是星形胶质细胞和小胶质细胞的炎症反应。通过去除小胶质细胞或修饰星形胶质细胞来抑制这种反应的研究通常显示，在动物模型中，疾病发病机制没有改善或恶化 ^7,8,9。在不消除胶质炎症的情况下调节神经胶质炎症是一种有趣的治疗方法。

研究方案

小鼠在科罗拉多州立大学的实验室动物资源中心繁殖和维护，该资源公司由实验室动物护理国际评估和认证协会认证，符合协议#1138，由科罗拉多州立大学机构动物护理和使用委员会批准。

1.用朊病毒分离和感染原代皮质混合胶质细胞

1. 为了分离含有星形胶质细胞和小胶质细胞的初级混合胶质细胞，获得0至2天大的C57Bl / 6小鼠幼崽。
   注意：该协议改编自以前的协议 ^15,16。
2. 通过斩首一次对一只幼崽实施安乐死，并提取它们的大脑，分离并丢弃小脑和脑干。
   1. 将大脑放入含有冷 MEM/EBSS 和 2x 青霉素/链霉素/新霉素 （PSN） 的 3 cm 培养皿中。在解剖镜下，分离大脑半球，切除并丢弃中脑。从皮层中取出并丢弃海马体和脑膜。
   2. 将两个皮质半球放入含有 5 mL MEM/EBSS + 2x PSN 的 50 mL 锥形管中，然后置于冰上。
3. 在组织培养罩中，用移液管轻轻吸出 50 mL 锥形管，将培养基留在管底部，从 50 mL 锥形管中取出培养基。使用涂层玻璃移液管，加入 10 mL 预热的解离培养基，并用玻璃移液管研磨组织 10-20x。
4. 将悬浮液转移到含有小搅拌棒的 50 mL 烧杯中，并以最低....

讨论

在这里，我们展示了一种可靠且相对便宜的方案，用于评估脂肪来源的间充质基质细胞（AdMSCs）在神经胶质细胞模型中减少朊病毒诱导的炎症的影响。AdMSCs可以很容易地在培养物中分离和扩增，可在短短1周内使用。该方案一致地产生异源细胞群，这些细胞群通过免疫荧光和流式细胞术表达与间充质基质细胞一致的标记物，并且在引入细胞因子或朊病毒感染的脑匀浆时保持免疫功能^14<.......

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.25% Trypsin	Cytiva	SH30042.01
5 mL serological pipets	Celltreat	229005B
6-well tissue culture plates	Celltreat	229106
10 cm cell culture dishes	Peak Serum	PS-4002
10 ml serological pipets	Celltreat	229210
15 mL conical tubes	Celltreat	667015B
50 mL conical tubes	Celltreat	667050B
BV2 microglia cell line	AcceGen Biotech	ABC-TC212S
Cell lifter	Biologix Research Company	70-2180
Crystal violet	Electron Microscopy Sciences	12785
Dispase	Thermo Scientific	17105041
DMEM/F12	Caisson Labs	DFL14-500ML
DNase-I	Sigma Aldrich	11284932001
Essential amino acids	Thermo Scientific	11130051
Ethanol (100%)	EMD Millipore	EX0276-1
Fetal bovine serum (heat inactivated)	Peak Serum	PS-FB4	Can be purchased as heat inactivated or inactivated in the laboratory
Formaldehyde	EMD Millipore	1.04003.1000
Glass 10 mL serological pipet	Corning	7077-10N
Hank’s Balances Salt Solution	Sigma Aldrich	H8264-500ML
Hemocytometer/Neubauer Chamber	Daigger	HU-3100
High Glucose DMEM	Cytiva	SH30022.01
low glucose DMEM containing L-glutamine	Cytiva	SH30021.01
MEM/EBSS	Cytiva	SH30024.FS
non-essential amino acids	Sigma-Aldrich	M7145-100M
Paraformaldehyde (16%)	MP Biomedicals	219998320
Penicillin/streptomycin/neomycin	Sigma-Aldrich	P4083-100ML
Phosphate buffered saline	Cytiva	SH30256.01
Recombinant Mouse IFN-gamma Protein	R&D Systems	485-MI
Recombinant Mouse TNF-alpha (aa 80-235) Protein, CF	R&D Systems	410-MT
RNeasy mini kit	Qiagen	74104
Sigmacote	Sigma Aldrich	SL2-100ML	Coat inside of glass pipets by aspirating up and down twice in Sigmacote and allowing to dry thoroughly. Wrap in aluminum foil and autoclave pipets 24 h later.
Stemxyme	Worthington Biochemical Corporation	LS004106	Collagenase/Dispase mixture
Sterile, individually wrapped cotton swab	Puritan Medical	25-8061WC
Thincert Tissue Culture Inserts, 24 well, Pore Size=8 µm	Greiner Bio-One	662638
Thincert Tissue Culture Inserts, 6 well, Pore Size=0.4 µm	Greiner Bio-One	657641