Мезенхимальные стромальные клетки, полученные из жировой ткани, совместно культивируемые с первичной смешанной глией для уменьшения прион-индуцированного воспаления

Резюме

Мезенхимальные стромальные клетки (AdMSCs), полученные из жировой ткани, обладают мощными иммуномодулирующими свойствами, полезными для лечения заболеваний, связанных с воспалением. Мы демонстрируем, как выделять и культивировать мышиные AdMSCs и первичную смешанную глию, стимулировать AdMSCs для повышения регуляции противовоспалительных генов и факторов роста, оценивать миграцию AdMSC и совместно культивировать AdMSCs с первичной смешанной глией, инфицированной прионами.

Аннотация

Мезенхимальные стромальные клетки (МСК) являются мощными регуляторами воспаления за счет выработки противовоспалительных цитокинов, хемокинов и факторов роста. Эти клетки демонстрируют способность регулировать нейровоспаление в контексте нейродегенеративных заболеваний, таких как прионная болезнь и другие нарушения неправильного сворачивания белка. Прионные заболевания могут быть спорадическими, приобретенными или генетическими; Они могут быть результатом неправильного сворачивания и агрегации прионного белка в мозге. Эти заболевания неизменно приводят к летальному исходу, и нет доступных методов лечения.

Одним из самых ранних признаков заболевания является активация астроцитов и микроглии и связанное с этим воспаление, которое происходит до обнаруживаемой агрегации прионов и потери нейронов; таким образом, противовоспалительные и регуляторные свойства МСК могут быть использованы для лечения астроглиоза при прионной болезни. Недавно мы показали, что МСК, полученные из жировой ткани (AdMSCs), культивируемые совместно с клетками BV2 или первичной смешанной глией, уменьшают прион-индуцированное воспаление посредством паракринной сигнализации. В этой статье описывается надежное лечение с использованием стимулированных AdMSC для уменьшения воспаления, вызванного прионами.

Гетерозиготная популяция AdMSC может быть легко выделена из жировой ткани мышей и расширена в культуре. Стимуляция этих клеток воспалительными цитокинами усиливает их способность как мигрировать в гомогенат мозга, инфицированный прионами, так и производить противовоспалительные модуляторы в ответ. Вместе эти методы могут быть использованы для исследования терапевтического потенциала МСК в отношении прионной инфекции и могут быть адаптированы для других нарушений сворачивания белка и нейровоспалительных заболеваний.

Введение

Глиальное воспаление играет ключевую роль в развитии различных нейродегенеративных заболеваний, включая болезнь Паркинсона, Альцгеймера и прионную болезнь. Несмотря на то, что аномальная агрегация белков в значительной степени связана с патогенезом заболевания и нейродегенерацией, глиальные клетки также играют роль в усугублении ^{этого 1,2,3}. Таким образом, нацеливание на глиально-индуцированное воспаление является многообещающим терапевтическим подходом. При прионной болезни клеточный прионный белок (PrP^C) неправильно сворачивается на ассоциированный с заболеванием прионный белок (PrP^Sc), который образует олигомеры, агрегирует и нарушает гомеостаз в мозге ^4,5,6.

Одним из самых ранних признаков прионной болезни является воспалительная реакция астроцитов и микроглии. Исследования, подавляющие этот ответ путем удаления микроглии или модификации астроцитов, в целом не показали улучшения патогенеза заболевания на животных моделях ^7,8,9. Модуляция глиального воспаления без его устранения является интригующей альтернативой в качестве терапевтического средства.

Мезенхимальные стромальные клетки (МСК) стали использоваться в качестве средства для лечения различных воспалительных заболеваний благодаря своей способности модулировать воспаление паракринным образом ^10,11. Они показали способность мигрировать к местам воспаления и реагировать на сигнальные молекулы в этих средах, выделяя противовоспалительные молекулы, факторы роста, микроРНК ^{и многое другое.} Ранее мы продемонстрировали, что МСК, полученные из жировой ткани (обозначенные AdMSCs), способны мигрировать в гомогенат мозга, инфицированный прионами, и реагировать на этот гомогенат мозга путем повышения экспрессии генов противовоспалительных цитокинов и факторов роста.

Кроме того, AdMSCs могут снижать экспрессию генов, ассоциированных с ядерным фактором-каппа B (NF-κB), пириновым доменом семейства Nod-подобных рецепторов, содержащим передачу сигналов инфламмасом 3 (NLRP3), и глиальной активацией как в микроглии BV2, так и в первичной смешанной глии ¹⁴. В этой статье мы предоставляем протоколы о том, как изолировать AdMSCs и первичную смешанную глию от мышей, стимулировать AdMSCs к активации модулирующих генов, оценить миграцию AdMSC и совместно культивировать AdMSCs с глией, инфицированной прионами. Мы надеемся, что эти процедуры могут стать основой для дальнейших исследований роли МСК в регуляции глиально-индуцированного воспаления при нейродегенеративных и других заболеваниях.

протокол

Мыши разводились и содержались в Lab Animal Resources штата Колорадо, аккредитованном Ассоциацией по оценке и аккредитации Lab Animal Care International, в соответствии с протоколом #1138, утвержденным Комитетом по институциональному уходу за животными и их использованию в Университете штата Колорадо.

1. Выделение и инфицирование первичной кортикальной смешанной глии с прионами

1. Чтобы выделить первичную смешанную глию, содержащую как астроциты, так и микроглию, получают детенышей мышей C57Bl/6 в возрасте от нуля до двух дней.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Этот протокол адаптирован из предыдущих протоколов ^15,16.
2. Усыпляйте детенышей по одному, обезглавливая и извлекая их мозг, отделяя и отбрасывая мозжечок и ствол мозга.
   1. Поместите мозг в 3-сантиметровую чашку Петри, содержащую холодный MEM/EBSS с 2x пенициллином/стрептомицином/неомицином (PSN). Под препарирующим эндоскопом отделите полушария мозга и удалите и отбросьте средний мозг. Удалите и выбросьте гиппокамп и мозговые оболочки из коры головного мозга.
   2. Поместите оба корковых полушария в коническую пробирку объемом 50 мл, содержащую 5 мл MEM/EBSS + 2x PSN, и положите на лед.
3. В вытяжке для культуры тканей удалите среду из конической пробирки объемом 50 мл путем осторожной аспирации с помощью пипетки, оставив кусочки кортикальной ткани на дне пробирки. С помощью стеклянной пипетки с покрытием добавьте 10 мл предварительно подогретой диссоциационной среды и растирайте ткань стеклянной пипеткой в 10-20 раз.
4. Переложите суспензию в стакан объемом 50 мл с небольшой полосой для перемешивания и положите на тарелку для перемешивания при самой низкой настройке, примерно 30 оборотов в минуту, на 10 минут. Снимите стакан с пластины для перемешивания и установите его под углом 30° на 3 минуты, чтобы салфетка осела на дне. Снимите клеточную суспензию (надосадочную жидкость) и переложите в новую коническую трубку объемом 50 мл на льду.
5. Добавьте DNase-I (4000 Ед/мл) в 10 мл диссоциативной среды и ресуспендируйте ткань и перемешайте еще 10 минут. Повторите, добавив свежую диссоциативную среду (без DNase-I) еще 2-4 раза (по одному разу на каждые два использованных детеныша мыши) и перенесите клеточную суспензию в коническую трубку объемом 50 мл на льду, пока на дне стакана не останется только волокнистая ткань.
6. Центрифугируйте клеточную суспензию в конической пробирке в течение 10 мин при 1000 × g при 4 °C. Отсадите надосадочную жидкость и замените глиальной средой роста. Подсчитайте клетки с помощью гемоцитометра и обеспечьте обработку клеток с плотностью 10⁶ на 10 см в обработанной клеточной культуре чашкой. Поместите в инкубатор при температуре 37 °C с 5% CO₂.
7. Через 24 ч удалите среду и замените ее свежей глиальной средой. Дайте клеткам достичь 100% слияния в течение 2 недель; Затем разделите их и наложите на тарелки для эксперимента.
8. При прионной инфекции in vitro пластинчатая глия в 100 000 клеток на лунку в 6-луночных планшетах и позволяет достичь 80%-100% конфлюенции. Подвергайте гомогенаты мозга, как прионные, так и нормальные, разбавленные до 20% в PBS, воздействию ультрафиолетового света в течение 30 минут перед добавлением в культуру клеток. Асасируйте среду из инфицируемой глии и в каждую лунку добавьте 1,5-2 мл глиальной питательной среды, содержащей в конечном объеме 0,1% нормального или прионного гомогената мозга.
9. Через 72 ч отсадите от среды и промойте клетки PBS, чтобы удалить остаточный гомогенат мозга. Замените свежей глиальной питательной средой (не содержащей гомогенатов мозга).
10. Чтобы выделить клетки AdMSCs, используйте серологическую пипетку и осторожно аспирируйте жировую ткань вместе с ~1 мл раствора HBSS/Trypsin. Переложите в чашку Петри диаметром 4 см, содержащую 2 мл среды DMEM/F12 с 200 Ед/мл DNase-I и 400 Ед/мл коллагеназы/Диспазы. Маленькими ножницами разрежьте кусочки жировой ткани на небольшие кусочки (размером менее 5 мм) и выдержите при температуре 37 °C в течение 1,5 ч.
11. Переложите содержимое чашки Петри в коническую пробирку объемом 50 мл с помощью серологической пипетки и растирайте смесь с помощью пипетки ~10 раз. Убедитесь, что ткань легко разрывается и образует относительно однородную смесь. Центрифугируйте смесь при 4 °C в течение 5 минут при 1000 × г , чтобы удалить дромальную сосудистую фракцию, которая будет выглядеть красной.
12. Тщательно отасканируйте надосадочную жидкость и промойте гранулу 5 мл предварительно подогретого стерильного PBS и центрифугируйте при 4 °C при 1000 × г в течение 3 минут. Аспирируйте надосадочную жидкость и ресуспендируйте гранулу в 1 мл среды AdMSC (DMEM с низким содержанием глюкозы, содержащий L-глютамин и дополненный 15% инактивированной тепловой фетальной сывороткой крупного рогатого скота (hiFBS), 1% аминокислотами, 1% заменимыми аминокислотами и 1% PSN).
13. Поместите клеточное ситечко размером 40 мкм поверх свежей стерильной конической пробирки объемом 50 мл и проведите клеточную суспензию через ситечко, чтобы удалить любую недиссоциированную ткань. Добавьте 9 мл среды AdMSC в чашку, обработанную клеточной культурой диаметром 10 см, и пипетируйте процеженную клеточную суспензию в чашку. Поместите в инкубатор при температуре 37 °C с 5% CO₂.
14. Удалите и замените новый носитель AdMSC на следующий день. Подождите, пока клетки станут слившимися на 80-90%, когда они будут готовы к прохождению между 72 ч и 96 ч.
15. Изолируйте AdMSCs, как описано выше, и дважды пройдите для получения согласованной однородной популяции ¹⁴. Дважды промойте клетки стерильным PBS и нанесите 2 мл предварительно подогретого трипсина (0,25%) на каждую тарелку. Инкубируйте клетки при 37 °C в течение 5 минут или до тех пор, пока они полностью не выйдут из планшета. Добавьте 8 мл предварительно подогретой среды AdMSC на каждую пластину, перемешайте клеточную суспензию с помощью пипетки, переложите в коническую пробирку и центрифугируйте при 1000 × г при 4 °C до гранул.
16. Ресуспендируйте АдМСК в 3-10 мл среды (в зависимости от количества используемых планшетов) и подсчитайте клетки с помощью гемоцитометра. Планшет 100 000 клеток/лунка в 6-луночных планшетах, содержащих среду AdMSC. Поместите в инкубатор при температуре 37 °C с 5%_CO2 на ночь.
17. На следующий день стимулируйте клетки цитокинами или гомогенатом мозга.
    1. Для цитокин-стимулированных клеток используйте среду AdMSC, содержащую либо 10 нг/мл TNFα, либо 200 нг/мл IFNγ. Используйте свежие среды для контрольных скважин.
    2. Для лечения гомогенатом мозга, инфицированным прионами, следует получить 20% гомогената мозга (в PBS) от неизлечимо инфицированных прионных мышей (штаммы 22L или RML). Для контроля приготовьте среду AdMSC с конечной концентрацией 0,1% прион-инфицированного или нормального гомогената мозга.
    3. Отсаживайте среды из лунок и пипетируйте 1,5 мл цитокин- или гомогенатсодержащих сред мозга в соответствующие лунки. Выполнять в трех экземплярах. Верните тарелки в инкубатор.
18. Удалите среду, промойте клетки 2 раза предварительно подогретым PBS, изолируйте РНК, добавив 350 мл буфера для лизиса, содержащего 1% βME, в каждую лунку, и используйте клеточный лифтер для удаления клеточных лизатов. Выполните выделение РНК в соответствии с протоколом производителя мини-набора, включая этап расщепления ДНКазы. Для ОТ-кПЦР проводят обратную транскрибацию 25 нг РНК на образец и амплифицируют кДНК с помощью SYBR Green и праймеров для каждого гена в дозе 10 мМ. Проанализировать экспрессию мРНК с помощью метода ^2-ΔΔCT и нормализовать до экспрессии референсного гена β-актина ¹⁷.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Все ОТ-ПЦР были проведены в соответствии с рекомендациями MIQE.
19. Микроглия BV2 в дозе 50 000 клеток на лунку или первичная смешанная глия в дозе 100 000 клеток на лунку в 6-луночном планшете. Обрабатывайте клетки BV2 на следующий день средой, содержащей 0,1% инфицированного прионом или нормального гомогената мозга. При смешанной глии подождите, пока клетки не слились на 80-90%, чтобы инфицировать гомогенат мозга.
20. Инкубировать клетки в средах, содержащих гомогенат мозга, в течение 72 ч. Промойте клетки 2 раза PBS, чтобы удалить остатки гомогената мозга, добавьте свежую среду и верните в инкубатор.
21. Используйте AdMSC в отрывке 3 для совместной культуры. При стимуляции AdMSC используйте среды, содержащие 10 нг/мл TNFα, и обрабатывайте в течение 24 ч перед совместным культивированием с BV2 или смешанной глией. Промойте стимулированные AdMSC 3 раза с PBS для удаления остатков TNFα.
22. Выполните трипсинизацию AdMSC, как описано в шаге 1.15, и повторно приостановите работу в среде AdMSC.
23. Отжим суспензию AdMSC при 1 000 × g при 4 °C в течение 5 мин. За это время замените среды на ячейках BV2 или смешанной глии на 2 мл на лунку среды AdMSC и поместите вкладыши для 6-луночных планшетов с размером пор 0,4 мкм в половину лунок. Добавьте 2 мл среды AdMSC в каждую вставку, а еще 2 мл среды в лунки, которые не принимают вставки.
24. По окончании гранулирования AdMSC повторно суспендировать гранулу в среде AdMSC. Подсчитайте AdMSCs с помощью гемоцитометра и добавьте 50 000-100 000 клеток к каждой вставке.
25. Для клеток BV2 инкубируйте сокультуры в течение 24 ч. Для смешанной глии инкубируйте от 24 до 7 дней.
26. После инкубации с AdMSCs в течение желаемого времени извлеките вкладыши и выбросьте их или поместите их в новую 6-луночную пластину, промойте вкладыши 2 раза PBS, добавьте буфер, предоставленный набором для выделения РНК, к смешанным клеткам глии или BV2 и соскребите вкладыши для анализа РНК AdMSC.
27. Обрабатывайте AdMSCs в пассаже 2 средой, содержащей 10 нг/мл TNFα. На следующий день промойте клетки предварительно подогретым стерильным PBS 3x и инкубируйте в бессывороточных средах AdMSC в течение 4 ч.
28. Чтобы провести анализ мигрирующих клеток, добавьте 25 000 AdMSCs на вкладыш и инкубируйте клетки в течение 24 ч при 37 °C. В течение этого времени мигрирующие клетки будут перемещаться из верхней камеры вкладыша и прилипать к нижней стороне вкладыша. Тщательно отасуньте содержимое лунки и вкладышей и промойте PBS 2 раза, оставив 1 мл PBS в каждой лунке, чтобы вкладыши оставались влажными с каждой стороны.
29. По одному, используя щипцы, извлекайте вставки и аккуратно, но тщательно протирайте верхнюю камеру ватным тампоном, чтобы удалить все клетки, которые не мигрировали. Отасуньте оставшийся PBS и пипетируйте 500 мкл кристаллического фиолетового раствора как в лунку, так и в верхнюю камеру вставки, убедившись, что мембрана вставки полностью погружена в воду.
30. Инкубировать вкладки в течение 1 ч в кристаллическом фиолетовом растворе при комнатной температуре. Чтобы наилучшим образом сохранить цвет, выполняйте следующие шаги быстро, используя только одну вставку за раз.
    1. Отсадите кристаллический фиолетовый раствор из лунки и верхней камеры вкладыша и промойте 3x с PBS. Снова протрите верхнюю камеру ватной палочкой.
    2. Поместите вкладыш в лунку в новую 24-луночную пластину, содержащую 1 мл PBS. Поместите пластину над перевернутым микроскопом с прикрепленной камерой. Используя объектив с 10-кратным увеличением, сделайте снимки четырех случайных областей ближе к центру вставки, сосредоточившись только на нижней стороне вставки.
31. Выполнив это с каждым лункой, загрузите изображения в выбранное программное обеспечение для обработки изображений и отрегулируйте фон, чтобы усилить контраст с окрашенными в фиолетовый цвет ячейками. Подсчитайте ячейки вручную с помощью счетчика ячеек.

Результаты

Стимуляция АдМСК с помощью TNFα или интерферона-гамма (ИФНγ) в течение 24 ч вызывает изменения в экспрессии противовоспалительных молекул и факторов роста. Лечение AdMSC TNFα или интерфероном-гамма (IFNγ) увеличивает мРНК TNF-стимулированного гена 6 (TSG-6), тогда как TNFα, но не IFNγ, вызывает увел?...

Обсуждение

В данной работе мы демонстрируем надежный и относительно недорогой протокол для оценки эффектов мезенхимальных стромальных клеток (МСК), полученных из жировой ткани, в уменьшении прион-индуцированного воспаления в модели глиальных клеток. AdMSC могут быть легко выделены и расширены в ку...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.25% Trypsin	Cytiva	SH30042.01
5 mL serological pipets	Celltreat	229005B
6-well tissue culture plates	Celltreat	229106
10 cm cell culture dishes	Peak Serum	PS-4002
10 ml serological pipets	Celltreat	229210
15 mL conical tubes	Celltreat	667015B
50 mL conical tubes	Celltreat	667050B
BV2 microglia cell line	AcceGen Biotech	ABC-TC212S
Cell lifter	Biologix Research Company	70-2180
Crystal violet	Electron Microscopy Sciences	12785
Dispase	Thermo Scientific	17105041
DMEM/F12	Caisson Labs	DFL14-500ML
DNase-I	Sigma Aldrich	11284932001
Essential amino acids	Thermo Scientific	11130051
Ethanol (100%)	EMD Millipore	EX0276-1
Fetal bovine serum (heat inactivated)	Peak Serum	PS-FB4	Can be purchased as heat inactivated or inactivated in the laboratory
Formaldehyde	EMD Millipore	1.04003.1000
Glass 10 mL serological pipet	Corning	7077-10N
Hank’s Balances Salt Solution	Sigma Aldrich	H8264-500ML
Hemocytometer/Neubauer Chamber	Daigger	HU-3100
High Glucose DMEM	Cytiva	SH30022.01
low glucose DMEM containing L-glutamine	Cytiva	SH30021.01
MEM/EBSS	Cytiva	SH30024.FS
non-essential amino acids	Sigma-Aldrich	M7145-100M
Paraformaldehyde (16%)	MP Biomedicals	219998320
Penicillin/streptomycin/neomycin	Sigma-Aldrich	P4083-100ML
Phosphate buffered saline	Cytiva	SH30256.01
Recombinant Mouse IFN-gamma Protein	R&D Systems	485-MI
Recombinant Mouse TNF-alpha (aa 80-235) Protein, CF	R&D Systems	410-MT
RNeasy mini kit	Qiagen	74104
Sigmacote	Sigma Aldrich	SL2-100ML	Coat inside of glass pipets by aspirating up and down twice in Sigmacote and allowing to dry thoroughly. Wrap in aluminum foil and autoclave pipets 24 h later.
Stemxyme	Worthington Biochemical Corporation	LS004106	Collagenase/Dispase mixture
Sterile, individually wrapped cotton swab	Puritan Medical	25-8061WC
Thincert Tissue Culture Inserts, 24 well, Pore Size=8 µm	Greiner Bio-One	662638
Thincert Tissue Culture Inserts, 6 well, Pore Size=0.4 µm	Greiner Bio-One	657641