Cellule stromali mesenchimali di derivazione adiposa co-coltivate con glia mista primaria per ridurre l'infiammazione indotta da prioni

Riepilogo

Le cellule stromali mesenchimali di derivazione adiposa (AdMSC) hanno potenti proprietà immunomodulatorie utili per il trattamento delle malattie associate all'infiammazione. Dimostriamo come isolare e coltivare le AdMSC murine e la glia mista primaria, stimolare le AdMSC a sovraregolare i geni antinfiammatori e i fattori di crescita, valutare la migrazione delle AdMSC e co-coltivare le AdMSC con glia primaria mista infettata da prioni.

Abstract

Le cellule stromali mesenchimali (MSC) sono potenti regolatori dell'infiammazione attraverso la produzione di citochine antinfiammatorie, chemochine e fattori di crescita. Queste cellule mostrano la capacità di regolare la neuroinfiammazione nel contesto di malattie neurodegenerative come la malattia da prioni e altri disturbi del misfolding proteico. Le malattie da prioni possono essere sporadiche, acquisite o genetiche; Possono derivare dal ripiegamento errato e dall'aggregazione della proteina prionica nel cervello. Queste malattie sono invariabilmente fatali, senza trattamenti disponibili.

Uno dei primi segni di malattia è l'attivazione degli astrociti e della microglia e l'infiammazione associata, che si verifica prima dell'aggregazione prionica rilevabile e della perdita neuronale; pertanto, le proprietà antinfiammatorie e regolatorie delle MSC possono essere sfruttate per trattare l'astrogliosi nella malattia da prioni. Recentemente, abbiamo dimostrato che le MSC di derivazione adiposa (AdMSCs) co-coltivate con cellule BV2 o glia mista primaria riducono l'infiammazione indotta dai prioni attraverso la segnalazione paracrina. Questo articolo descrive un trattamento affidabile che utilizza AdMSC stimolate per ridurre l'infiammazione indotta dai prioni.

Una popolazione eterozigote di AdMSC può essere facilmente isolata dal tessuto adiposo murino ed espansa in coltura. La stimolazione di queste cellule con citochine infiammatorie migliora la loro capacità sia di migrare verso l'omogenato cerebrale infetto da prioni che di produrre modulatori antinfiammatori in risposta. Insieme, queste tecniche possono essere utilizzate per studiare il potenziale terapeutico delle MSC sull'infezione da prioni e possono essere adattate per altre malattie neuroinfiammatorie e di misfolding proteico.

Introduzione

L'infiammazione gliale svolge un ruolo chiave in una varietà di malattie neurodegenerative, tra cui il Parkinson, l'Alzheimer e la malattia da prioni. Sebbene l'aggregazione proteica anomala sia attribuita a gran parte della patogenesi della malattia e della neurodegenerazione, anche le cellule gliali svolgono un ruolo nell'esacerbare questo ^1,2,3. Pertanto, mirare all'infiammazione indotta dalla glia è un approccio terapeutico promettente. Nella malattia da prioni, la proteina prionica cellulare (PrP^C) si ripiega erroneamente nella proteina prionica associata alla malattia (PrP^Sc), che forma oligomeri e aggregati e interrompe l'omeostasi nel cervello ^4,5,6.

Uno dei primi segni di malattia da prioni è una risposta infiammatoria da parte degli astrociti e della microglia. Gli studi che sopprimono questa risposta, sia attraverso la rimozione della microglia che la modifica degli astrociti, non hanno generalmente mostrato alcun miglioramento o peggioramento della patogenesi della malattia nei modelli animali ^7,8,9. Modulare l'infiammazione gliale senza eliminarla è un'alternativa terapeutica intrigante.

Le cellule stromali mesenchimali (MSC) sono diventate un trattamento per una varietà di malattie infiammatorie, grazie alla loro capacità di modulare l'infiammazione in modo paracrino ^10,11. Hanno dimostrato la capacità di migrare verso i siti di infiammazione e rispondere alle molecole di segnalazione in questi ambienti secernendo molecole antinfiammatorie, fattori di crescita, microRNA e altro ancora 10,12,13. Abbiamo precedentemente dimostrato che le MSC derivate dal tessuto adiposo (denotate AdMSCs) sono in grado di migrare verso l'omogenato cerebrale infettato da prioni e rispondono a questo omogenato cerebrale sovraregolando l'espressione genica per citochine antinfiammatorie e fattori di crescita.

Inoltre, le AdMSCs possono ridurre l'espressione di geni associati al Nuclear Factor-kappa B (NF-κB), il dominio pirinico della famiglia dei recettori Nod-Like contenente 3 (NLRP3) e l'attivazione gliale, sia nella microglia BV2 che nella glia mista primaria ¹⁴. Qui, forniamo protocolli su come isolare sia le AdMSC che la glia mista primaria dai topi, stimolare le AdMSC a sovraregolare i geni modulatori, valutare la migrazione delle AdMSC e co-coltivare le AdMSC con glia infetta da prioni. Speriamo che queste procedure possano fornire una base per ulteriori indagini sul ruolo delle MSC nella regolazione dell'infiammazione indotta dalla glia nelle malattie neurodegenerative e in altre malattie.

Protocollo

I topi sono stati allevati e mantenuti presso il Colorado State's Lab Animal Resources, accreditato dall'Associazione per la valutazione e l'accreditamento di Lab Animal Care International, in conformità con il protocollo #1138, approvato dal Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali presso la Colorado State University.

1. Isolare e infettare la glia mista corticale primaria con i prioni

1. Per isolare la glia mista primaria contenente sia astrociti che microglia, ottenere cuccioli di topo C57Bl/6 di età compresa tra zero e due giorni.
   NOTA: Questo protocollo è adattato dai precedenti protocolli ^15,16.
2. Eutanasia i cuccioli uno alla volta mediante decapitazione ed estrazione del loro cervello, separando e scartando il cervelletto e il tronco encefalico.
   1. Mettere il cervello in una capsula di Petri di 3 cm contenente MEM/EBSS fredda con 2x penicillina/streptomicina/neomicina (PSN). In un cannocchiale da dissezione, separare gli emisferi cerebrali e rimuovere e scartare il mesencefalo. Rimuovere e scartare l'ippocampo e le meningi dalla corteccia.
   2. Porre entrambi gli emisferi corticali in una provetta conica da 50 mL contenente 5 mL di MEM/EBSS + 2x PSN e metterli su ghiaccio.
3. In una cappa per coltura tissutale, rimuovere il terreno dalla provetta conica da 50 mL aspirando delicatamente con una pipetta, lasciando i pezzi di tessuto corticale sul fondo della provetta. Con una pipetta di vetro rivestita, aggiungere 10 mL di terreno di dissociazione preriscaldato e triturare il tessuto con la pipetta di vetro 10-20x.
4. Trasferire la sospensione in un becher da 50 ml contenente una piccola ancoretta e posizionarla su una piastra di agitazione alla massima velocità, circa 30 giri/min, per 10 minuti. Rimuovere il becher dalla piastra di agitazione e impostarlo a un angolo di 30° per 3 minuti per consentire al fazzoletto di depositarsi sul fondo. Rimuovere la sospensione cellulare (surnatante) e trasferirla in una nuova provetta conica da 50 mL su ghiaccio.
5. Aggiungere DNasi-I (4.000 U/mL) a 10 mL di terreno di dissociazione, risospendere il tessuto e agitare per altri 10 minuti. Ripetere aggiungendo nuovi mezzi di dissociazione (senza DNasi-I) altre 2-4 volte (una volta ogni due cuccioli di topo utilizzati) e trasferendo la sospensione cellulare nella provetta conica da 50 mL su ghiaccio, fino a quando rimane solo tessuto fibroso sul fondo del becher.
6. Centrifugare la sospensione cellulare nella provetta conica per 10 minuti a 1.000 × g a 4 °C. Aspirare il surnatante e sostituirlo con un terreno di coltura gliale. Contare le cellule con un emocitometro e piastrarle a una densità di 10 piastre trattate con colture cellulari^{da 6} in 10 cm. Porre in un'incubatrice a 37 °C con il 5% di CO₂.
7. Dopo 24 ore, rimuovere il terreno e sostituirlo con un terreno gliale nuovo. Lascia che le celle raggiungano il 100% di confluenza entro 2 settimane; Quindi, dividili e impiattali per sperimentarli.
8. Per l'infezione da prioni in vitro , la glia su piastra a 100.000 cellule per pozzetto in piastre a 6 pozzetti e consentire di raggiungere l'80%-100% di confluenza. Esporre gli omogeneizzati cerebrali, sia prionici che normali, diluiti al 20% in PBS alla luce UV per 30 minuti prima di aggiungerli alla coltura cellulare. Aspirare il terreno dalla glia da infettare e, a ciascun pozzetto, aggiungere 1,5-2 ml di terreno di crescita gliale contenente un volume finale dello 0,1% di normale o omogeneizzato cerebrale prionico.
9. Dopo 72 ore, aspirare il terreno e lavare le cellule con PBS per rimuovere l'eventuale omogeneizzato cerebrale residuo. Sostituire con terreni di crescita gliali freschi (non contenenti omogeneizzati cerebrali).
10. Per isolare le cellule AdMSCs, utilizzare una pipetta sierologica e aspirare delicatamente il tessuto adiposo insieme a ~1 mL di soluzione di HBSS/tripsina. Trasferire in una piastra di Petri da 4 cm contenente 2 mL di terreno DMEM/F12 con 200 U/mL di DNasi-I e 400 U/mL di miscela di collagenasi/Dispasi. Con piccole forbici, tagliare i pezzi di tessuto adiposo in piccoli pezzi (di dimensioni inferiori a 5 mm) e incubare a 37 °C per 1,5 ore.
11. Trasferire il contenuto della capsula di Petri in una provetta conica da 50 ml con una pipetta sierologica e triturare la miscela ~10x con la pipetta. Assicurati che il tessuto si rompa facilmente e formi una miscela relativamente omogenea. Centrifugare la miscela a 4 °C per 5 minuti a 1.000 × g per pellettare la frazione vascolare stromale, che apparirà rossa.
12. Aspirare accuratamente il surnatante e lavare il pellet con 5 mL di PBS sterile preriscaldato e centrifugare a 4 °C a 1.000 × g per 3 min. Aspirare il surnatante e risospendere il pellet in 1 mL di terreno AdMSC (DMEM a basso contenuto di glucosio contenente L-glutammina e integrato con il 15% di siero fetale bovino inattivato termicamente (hiFBS), l'1% di aminoacidi, l'1% di aminoacidi non essenziali e l'1% di PSN).
13. Posizionare un colino cellulare da 40 μm sopra una provetta conica sterile fresca da 50 ml e pipettare la sospensione cellulare attraverso il colino per rimuovere qualsiasi tessuto non dissociato. Aggiungere 9 mL di terreno AdMSC a una piastra da 10 cm trattata con coltura cellulare e pipettare la sospensione cellulare filtrata nella piastra. Porre in un'incubatrice a 37 °C con il 5% di CO₂.
14. Rimuoverlo e sostituirlo con nuovi supporti AdMSC il giorno successivo. Attendere che le celle diventino confluenti all'80-90% quando saranno pronte per essere fatte passare tra 72 h e 96 h.
15. Isolare le AdMSC come descritto sopra e passarle due volte per ottenere una popolazione omogenea coerente ¹⁴. Lavare le cellule due volte con PBS sterile e pipettare 2 mL di tripsina preriscaldata (0,25%) su ciascuna piastra. Incubare le cellule a 37 °C per 5 minuti o fino a quando non si sono completamente staccate dalla piastra. Aggiungere 8 mL di terreno AdMSC preriscaldato a ciascuna piastra, pipettare per miscelare la sospensione cellulare, trasferire nella provetta conica e centrifugare a 1.000 × g a 4 °C per pellettare.
16. Risospendere le AdMSC in 3-10 mL di terreno (a seconda del numero di piastre utilizzate) e contare le cellule utilizzando un emocitometro. Piastra 100.000 cellule/pozzetto in piastre a 6 pozzetti contenenti terreni AdMSC. Porre in un'incubatrice a 37 °C con il 5% di CO₂ per una notte.
17. Il giorno seguente, stimolare le cellule con citochine o omogenato cerebrale.
    1. Per le cellule stimolate da citochine, creare terreni AdMSC contenenti 10 ng/mL di TNFα o 200 ng/mL di IFNγ. Utilizzare terreni freschi per i pozzetti di controllo.
    2. Per i trattamenti con omogeneizzati cerebrali infetti da prioni, ottenere il 20% di omogeneizzato cerebrale (in PBS) da topi prionici infetti terminali (ceppi 22L o RML). Produrre AdMSC mediacon una concentrazione finale dello 0,1% di infetto da prioni o di omogenato cerebrale normale per i controlli.
    3. Aspirare i terreni dai pozzetti e pipettare 1,5 mL di terreni contenenti citochine o omogeneizzati cerebrali nei pozzetti corrispondenti. Eseguire in triplice copia. Rimettere le piastre nell'incubatrice.
18. Rimuovere il terreno, lavare le cellule 2 volte con PBS preriscaldato, isolare l'RNA aggiungendo 350 ml di tampone di lisi contenente l'1% di βME a ciascun pozzetto e utilizzare un sollevatore cellulare per rimuovere i lisati cellulari. Eseguire l'isolamento dell'RNA seguendo il protocollo del produttore del mini kit, inclusa una fase di digestione della DNasi. Per la RT-qPCR, trascrivere inversamente 25 ng di RNA per campione e amplificare il cDNA con SYBR Green e primer per ciascun gene a 10 mM. Analizzare l'espressione dell'mRNA utilizzando il metodo ^2-ΔΔCT e normalizzare l'espressione del gene di riferimento β-actina ¹⁷.
    NOTA: Tutta la RT-PCR è stata eseguita seguendo le linee guida MIQE.
19. Piastra BV2 microglia a 50.000 cellule per pozzetto o glia mista primaria a 100.000 cellule per pozzetto in una piastra a 6 pozzetti. Trattare le cellule BV2 il giorno successivo con terreni contenenti lo 0,1% di infetto da prioni o di normale omogeneizzato cerebrale. Per la glia mista, attendere che le cellule siano confluenti all'80-90% per infettare con l'omogenato cerebrale.
20. Incubare le cellule in un terreno contenente l'omogenato cerebrale per 72 ore. Lavare le cellule 2 volte con PBS per rimuovere l'omogeneizzato cerebrale rimanente e aggiungere nuovi terreni e rimetterli nell'incubatore.
21. Utilizzare le AdMSC al passaggio 3 per la co-cultura. Se si stimolano le AdMSC, utilizzare terreni contenenti 10 ng/mL di TNFα e trattare per 24 ore prima della co-coltura con BV2 o glia mista. Lavare le AdMSC stimolate 3 volte con PBS per rimuovere il TNFα residuo.
22. Tripsinizzare le AdMSC come descritto nel passaggio 1.15 e risospendere nei supporti AdMSC.
23. Centrifugare la sospensione di AdMSC a 1.000 × g a 4 °C per 5 min. Durante questo periodo, sostituire il terreno sulle cellule BV2 o sulla glia mista con 2 mL per pozzetto di terreno AdMSC e posizionare gli inserti per piastre a 6 pozzetti con una dimensione dei pori di 0,4 micrometri in metà dei pozzetti. Aggiungere 2 mL di terreno AdMSC a ciascun inserto e altri 2 mL di terreno ai pozzetti che non ricevono inserti.
24. Al termine della pellettatura delle AdMSC, risospendere la pallina in terreni AdMSC. Contare le AdMSC con un emocitometro e aggiungere 50.000-100.000 cellule a ciascun inserto.
25. Per le cellule BV2, incubare le co-colture per 24 ore. Per la glia mista, incubare per un minimo di 24 ore e fino a 7 giorni.
26. Dopo l'incubazione con AdMSC per il tempo desiderato, rimuovere gli inserti e scartarli, oppure metterli in una nuova piastra a 6 pozzetti, lavare gli inserti 2 volte con PBS, aggiungere il tampone fornito dal kit di isolamento dell'RNA alla glia mista o alle cellule BV2 e raschiare gli inserti per analizzare l'RNA di AdMSC.
27. Trattare le AdMSC al passaggio 2 con terreni contenenti 10 ng/mL di TNFα. Il giorno seguente, lavare le cellule con PBS 3x sterile preriscaldato e incubare in terreno AdMSC privo di siero per 4 ore.
28. Per eseguire il saggio delle cellule migratorie, aggiungere 25.000 AdMSC per inserto e incubare le cellule per 24 ore a 37 °C. Durante questo periodo, le cellule migratorie si sposteranno dalla camera superiore dell'inserto e aderiranno alla parte inferiore dell'inserto. Aspirare con cura il contenuto sia del pozzetto che degli inserti e lavare 2 volte con PBS, lasciando 1 mL di PBS in ciascun pozzetto per assicurarsi che gli inserti rimangano umidi su ciascun lato.
29. Uno alla volta, usando una pinza, rimuovere gli inserti e pulire delicatamente ma accuratamente la camera superiore con un batuffolo di cotone per rimuovere le cellule che non sono migrate. Aspirare il PBS rimanente e pipettare 500 μL di soluzione di cristallovioletto sia nel pozzetto che nella camera superiore dell'inserto, assicurandosi che la membrana dell'inserto sia completamente sommersa.
30. Incubare gli inserti per 1 ora in soluzione di cristallovioletto a temperatura ambiente. Per mantenere al meglio il colore, eseguire rapidamente i passaggi successivi, con un solo inserto alla volta.
    1. Aspirare la soluzione di cristallovioletto dal pozzetto e dalla camera superiore dell'inserto e lavare 3 volte con PBS. Pulisci nuovamente la camera superiore con un batuffolo di cotone.
    2. Posizionare l'inserto in un pozzetto in una nuova piastra a 24 pozzetti contenente 1 mL di PBS. Posizionare la piastra sopra un microscopio invertito con una fotocamera collegata. Utilizzando l'obiettivo 10x, scatta immagini di quattro aree casuali verso il centro dell'inserto, concentrandoti solo sul lato inferiore dell'inserto.
31. Dopo aver eseguito questa operazione con ogni pozzetto, carica le immagini sul software di elaborazione delle immagini preferito e regola lo sfondo per migliorare il contrasto con le celle colorate di viola. Conta le celle manualmente con un contatore di celle.

Risultati

La stimolazione delle AdMSC con TNFα o interferone-gamma (IFNγ) per 24 ore induce cambiamenti nell'espressione di molecole antinfiammatorie e fattori di crescita. Il trattamento delle AdMSC con TNFα o interferone-gamma (IFNγ) aumenta l'mRNA del gene 6 stimolato dal TNF (TSG-6), mentre il TNFα, ma non l'IFNγ, provoca un aumento dell'mRNA del fattore di crescita trasformante beta-1 (TGFβ-1). La stimolazione con TNFα o IFNγ induce un aumento dell'mRNA del fattore di crescita dell'endotelio vascola...

Discussione

Qui dimostriamo un protocollo affidabile e relativamente poco costoso per valutare gli effetti delle cellule stromali mesenchimali di derivazione adiposa (AdMSC) nel ridurre l'infiammazione indotta da prioni in un modello di cellule gliali. Le AdMSC possono essere facilmente isolate ed espanse in coltura per l'uso in appena 1 settimana. Questo protocollo produce costantemente una popolazione eterologa di cellule che esprimono marcatori coerenti con quelli delle cellule stromali mesenchimali mediante immunofluorescenza e ...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.25% Trypsin	Cytiva	SH30042.01
5 mL serological pipets	Celltreat	229005B
6-well tissue culture plates	Celltreat	229106
10 cm cell culture dishes	Peak Serum	PS-4002
10 ml serological pipets	Celltreat	229210
15 mL conical tubes	Celltreat	667015B
50 mL conical tubes	Celltreat	667050B
BV2 microglia cell line	AcceGen Biotech	ABC-TC212S
Cell lifter	Biologix Research Company	70-2180
Crystal violet	Electron Microscopy Sciences	12785
Dispase	Thermo Scientific	17105041
DMEM/F12	Caisson Labs	DFL14-500ML
DNase-I	Sigma Aldrich	11284932001
Essential amino acids	Thermo Scientific	11130051
Ethanol (100%)	EMD Millipore	EX0276-1
Fetal bovine serum (heat inactivated)	Peak Serum	PS-FB4	Can be purchased as heat inactivated or inactivated in the laboratory
Formaldehyde	EMD Millipore	1.04003.1000
Glass 10 mL serological pipet	Corning	7077-10N
Hank’s Balances Salt Solution	Sigma Aldrich	H8264-500ML
Hemocytometer/Neubauer Chamber	Daigger	HU-3100
High Glucose DMEM	Cytiva	SH30022.01
low glucose DMEM containing L-glutamine	Cytiva	SH30021.01
MEM/EBSS	Cytiva	SH30024.FS
non-essential amino acids	Sigma-Aldrich	M7145-100M
Paraformaldehyde (16%)	MP Biomedicals	219998320
Penicillin/streptomycin/neomycin	Sigma-Aldrich	P4083-100ML
Phosphate buffered saline	Cytiva	SH30256.01
Recombinant Mouse IFN-gamma Protein	R&D Systems	485-MI
Recombinant Mouse TNF-alpha (aa 80-235) Protein, CF	R&D Systems	410-MT
RNeasy mini kit	Qiagen	74104
Sigmacote	Sigma Aldrich	SL2-100ML	Coat inside of glass pipets by aspirating up and down twice in Sigmacote and allowing to dry thoroughly. Wrap in aluminum foil and autoclave pipets 24 h later.
Stemxyme	Worthington Biochemical Corporation	LS004106	Collagenase/Dispase mixture
Sterile, individually wrapped cotton swab	Puritan Medical	25-8061WC
Thincert Tissue Culture Inserts, 24 well, Pore Size=8 µm	Greiner Bio-One	662638
Thincert Tissue Culture Inserts, 6 well, Pore Size=0.4 µm	Greiner Bio-One	657641