Células estromais mesenquimais derivadas de tecido adiposo co-cultivadas com glia mista primária para reduzir a inflamação induzida por príons

Resumo

As células estromais mesenquimais derivadas do tecido adiposo (AdMSCs) têm propriedades imunomoduladoras potentes, úteis para o tratamento de doenças associadas à inflamação. Demonstramos como isolar e cultivar AdMSCs murinas e glia mista primária, estimular AdMSCs para regular positivamente genes anti-inflamatórios e fatores de crescimento, avaliar a migração de AdMSCs e co-cultivar AdMSCs com glia primária mista infectada por príons.

Resumo

As células estromais mesenquimais (MSCs) são potentes reguladores da inflamação por meio da produção de citocinas anti-inflamatórias, quimiocinas e fatores de crescimento. Essas células mostram uma capacidade de regular a neuroinflamação no contexto de doenças neurodegenerativas, como a doença do príon e outros distúrbios de desdobramento de proteínas. As doenças priônicas podem ser esporádicas, adquiridas ou genéticas; Eles podem resultar do desdobramento e agregação da proteína príon no cérebro. Essas doenças são invariavelmente fatais, sem tratamentos disponíveis.

Um dos primeiros sinais da doença é a ativação de astrócitos e microglia e inflamação associada, que ocorre antes da agregação de príons detectável e perda neuronal; assim, as propriedades anti-inflamatórias e regulatórias das MSCs podem ser colhidas para tratar a astrogliose na doença do príon. Recentemente, mostramos que as MSCs derivadas do tecido adiposo (AdMSCs) co-cultivadas com células BV2 ou glia mista primária reduzem a inflamação induzida por príons por meio da sinalização parácrina. Este artigo descreve um tratamento confiável usando AdMSCs estimuladas para diminuir a inflamação induzida por príons.

Uma população heterozigótica de AdMSCs pode ser facilmente isolada do tecido adiposo murino e expandida em cultura. Estimular essas células com citocinas inflamatórias aumenta sua capacidade de migrar para o homogeneizado cerebral infectado por príons e produzir moduladores anti-inflamatórios em resposta. Juntas, essas técnicas podem ser usadas para investigar o potencial terapêutico das MSCs na infecção por príons e podem ser adaptadas para outras doenças neuroinflamatórias e de desdobramento de proteínas.

Introdução

A inflamação glial desempenha um papel fundamental em uma variedade de doenças neurodegenerativas, incluindo Parkinson, Alzheimer e doença do príon. Embora a agregação anormal de proteínas seja atribuída a grande parte da patogênese da doença e da neurodegeneração, as células gliais também desempenham um papel na exacerbação disso ^1,2,3. Portanto, direcionar a inflamação induzida pela glia é uma abordagem terapêutica promissora. Na doença do príon, a proteína príon celular (PrP^C) se dobra incorretamente para a proteína príon associada à doença (PrP^Sc), que forma oligômeros e agregados e interrompe a homeostase no cérebro ^4,5,6.

Um dos primeiros sinais da doença do príon é uma resposta inflamatória de astrócitos e micróglia. Estudos que suprimem essa resposta, seja pela remoção da microglia ou modificação dos astrócitos, geralmente não mostraram melhora ou piora da patogênese da doença em modelos animais ^7,8,9. Modular a inflamação glial sem eliminá-la é uma alternativa intrigante como terapêutica.

As células estromais mesenquimais (CTMs) têm entrado em cena como tratamento para uma variedade de doenças inflamatórias, devido à sua capacidade de modular a inflamação de forma parácrina ^10,11. Eles mostraram a capacidade de migrar para locais de inflamação e responder a moléculas de sinalização nesses ambientes, secretando moléculas anti-inflamatórias, fatores de crescimento, microRNAs e muito mais 10,12,13. Demonstramos anteriormente que as MSCs derivadas do tecido adiposo (denotadas AdMSCs) são capazes de migrar para o homogeneizado cerebral infectado por príons e responder a esse homogeneizado cerebral regulando positivamente a expressão gênica de citocinas anti-inflamatórias e fatores de crescimento.

Além disso, as AdMSCs podem diminuir a expressão de genes associados ao Fator Nuclear-kappa B (NF-κB), o domínio de pirina da família Nod-Like Receptor contendo sinalização de inflamassoma 3 (NLRP3) e ativação glial, tanto na microglia BV2 quanto na glia mista primária ¹⁴. Aqui, fornecemos protocolos sobre como isolar AdMSCs e glia mista primária de camundongos, estimular AdMSCs para regular positivamente genes moduladores, avaliar a migração de AdMSC e co-cultivar AdMSCs com glia infectada por príons. Esperamos que esses procedimentos possam fornecer uma base para uma investigação mais aprofundada do papel das MSCs na regulação da inflamação induzida pela glia em doenças neurodegenerativas e outras.

Protocolo

Os camundongos foram criados e mantidos no Lab Animal Resources do Colorado State, credenciado pela Association for Assessment and Accreditation of Lab Animal Care International, de acordo com o protocolo # 1138, aprovado pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da Colorado State University.

1. Isolar e infectar glia mista cortical primária com príons

1. Para isolar a glia mista primária contendo astrócitos e microglia, obtenha filhotes de camundongos C57Bl / 6 com idade entre zero e dois dias de idade.
   NOTA: Este protocolo é adaptado de protocolos anteriores ^15,16.
2. Eutanasiar os filhotes, um de cada vez, por decapitação e extrair seu cérebro, separando e descartando o cerebelo e o tronco cerebral.
   1. Coloque o cérebro em uma placa de Petri de 3 cm contendo MEM/EBSS frio com 2x Penicilina/estreptomicina/neomicina (PSN). Sob um escopo de dissecação, separe os hemisférios cerebrais e remova e descarte o mesencéfalo. Remova e descarte o hipocampo e as meninges do córtex.
   2. Coloque ambos os hemisférios corticais em um tubo cônico de 50 mL contendo 5 mL de MEM/EBSS + 2x PSN e coloque no gelo.
3. Em uma capa de cultura de tecidos, remova o meio do tubo cônico de 50 mL aspirando suavemente com uma pipeta, deixando os pedaços de tecido cortical no fundo do tubo. Com uma pipeta de vidro revestida, adicione 10 mL de meio de dissociação pré-aquecido e triture o tecido com a pipeta de vidro 10-20x.
4. Transferir a suspensão para um copo de 50 ml contendo um pequeno barra de agitação e colocar numa placa de agitação na posição mais baixa, cerca de 30 rpm, durante 10 min. Retire o copo da placa de agitação e coloque-o num ângulo de 30° durante 3 minutos para permitir que o tecido assente no fundo. Remova a suspensão celular (sobrenadante) e transfira para um novo tubo cônico de 50 mL no gelo.
5. Adicione DNase-I (4.000 U / mL) a 10 mL de meio de dissociação e ressuspenda o tecido e mexa por mais 10 minutos. Repita adicionando novos meios de dissociação (sem DNase-I) 2-4 vezes adicionais (uma vez para cada dois filhotes de camundongo usados) e transferindo a suspensão celular para o tubo cônico de 50 mL no gelo, até que apenas o tecido fibroso permaneça no fundo do béquer.
6. Centrifugar a suspensão celular no tubo cónico durante 10 min a 1.000 × g a 4 °C. Aspirar o sobrenadante e substituí-lo por meio de crescimento glial. Conte as células com um hemocitômetro e coloque as células em placas com uma densidade de 10⁶ em placas tratadas com cultura de células de 10 cm. Colocar numa incubadora a 37 °C com 5% de CO₂.
7. Após 24 h, remova a mídia e substitua-a por uma nova mídia glial. Deixe as células atingirem 100% de confluência em 2 semanas; Em seguida, divida e coloque em placas para experimentação.
8. Para infecção por príon in vitro , placa glia a 100.000 células por poço em placas de 6 poços e deixe atingir 80% -100% de confluência. Exponha homogeneizados cerebrais, tanto príon quanto normais, diluídos a 20% em PBS à luz UV por 30 minutos antes de adicionar à cultura de células. Aspire o meio da glia a ser infectada e, a cada poço, adicione 1,5-2 mL de meio de crescimento glial contendo um volume final de 0,1% de homogeneizado cerebral normal ou príon.
9. Após 72 h, aspirar o meio e lavar as células com PBS para remover qualquer homogeneizado cerebral residual. Substitua por meios de crescimento glial frescos (sem homogeneizados cerebrais).
10. Para isolar as células AdMSCs, use uma pipeta sorológica e aspire suavemente o tecido adiposo junto com ~ 1 mL de solução de HBSS / tripsina. Transferir para uma placa de Petri de 4 cm contendo 2 ml de meio DMEM/F12 com 200 U/ml de mistura de DNase-I e 400 U/ml de colagenase/Dispase. Com uma tesoura pequena, corte os pedaços de tecido adiposo em pedaços pequenos (menos de 5 mm de tamanho) e incube a 37 ° C por 1,5 h.
11. Transfira o conteúdo da placa de Petri para um tubo cônico de 50 mL com uma pipeta sorológica e triture a mistura ~ 10x com a pipeta. Certifique-se de que o tecido se rompa facilmente e forme uma mistura relativamente homogênea. Centrifugue a mistura a 4 °C por 5 min a 1.000 × g para granular a fração vascular estromal, que aparecerá em vermelho.
12. Aspirar cuidadosamente o sobrenadante e lavar o sedimento com 5 ml de PBS estéril pré-aquecido e centrifugar a 4 °C a 1.000 × g durante 3 min. Aspire o sobrenadante e ressuspenda o pellet em 1 mL de meio AdMSC (DMEM com baixo teor de glicose contendo L-glutamina e suplementado com 15% de soro fetal bovino inativado pelo calor (hiFBS), 1% de aminoácidos, 1% de aminoácidos não essenciais e 1% de PSN).
13. Coloque um filtro de células de 40 μm em cima de um tubo cônico estéril fresco de 50 mL e pipete a suspensão celular através do filtro para remover qualquer tecido não dissociado. Adicione 9 mL de meio AdMSC a um prato tratado com cultura de células de 10 cm e pipete a suspensão de células coadas no prato. Colocar numa incubadora a 37 °C com 5% de CO₂.
14. Remova e substitua por um novo meio AdMSC no dia seguinte. Espere que as células se tornem 80-90% confluentes quando estiverem prontas para serem passadas entre 72 h e 96 h.
15. Isole as AdMSCs conforme descrito acima e passe duas vezes para obter uma população homogênea consistente ¹⁴. Lave as células duas vezes com PBS estéril e pipete 2 mL de tripsina pré-aquecida (0,25%) em cada placa. Incubar as células a 37 °C durante 5 minutos ou até que se desloquem completamente da placa. Adicione 8 mL de meio AdMSC pré-aquecido a cada placa, pipete para misturar a suspensão celular, transfira para o tubo cônico e centrifugue a 1.000 × g a 4 ° C para pellet.
16. Ressuspenda as AdMSCs em 3-10 mL de meio (dependendo do número de placas usadas) e conte as células usando um hemocitômetro. Placa de 100.000 células/poço em placas de 6 poços contendo meios AdMSC. Colocar numa incubadora a 37 °C com 5% de CO₂ durante a noite.
17. No dia seguinte, estimule as células com citocinas ou homogeneizado cerebral.
    1. Para células estimuladas por citocinas, faça meios AdMSC contendo 10 ng/mL de TNFα ou 200 ng/mL de IFNγ. Use meios novos para poços de controle.
    2. Para tratamentos com homogeneizado cerebral infectado por príons, obtenha 20% de homogeneizado cerebral (em PBS) de camundongos príons infectados terminalmente (cepas 22L ou RML). Faça AdMSC com uma concentração final de 0,1% de homogeneizado cerebral infectado por príons ou normal para controles.
    3. Aspire o meio dos poços e pipete 1,5 mL de meio contendo citocinas ou homogeneizado cerebral para os poços correspondentes. Execute em triplicado. Devolva as placas para a incubadora.
18. Remova o meio, lave as células 2x com PBS pré-aquecido, isole o RNA adicionando 350 mL de tampão de lise contendo 1% de βME a cada poço e use um levantador de células para remover os lisados celulares. Realize o isolamento de RNA seguindo o protocolo do fabricante do mini kit, incluindo uma etapa de digestão DNase. Para RT-qPCR, transcreva reversamente 25 ng de RNA por amostra e amplifice o cDNA com SYBR Green e primers para cada gene a 10 mM. Analise a expressão de mRNA usando o método ^2-ΔΔCT e normalize para a expressão do gene de referência β-actina ¹⁷.
    NOTA: Todos os RT-PCR foram feitos seguindo as diretrizes do MIQE.
19. Placa BV2 microglia a 50.000 células por poço, ou glia mista primária a 100.000 células por poço em uma placa de 6 poços. Trate as células BV2 no dia seguinte com meios contendo 0,1% de homogeneizado cerebral normal ou infectado por príons. Para glia mista, espere até que as células sejam 80-90% confluentes para infectar com o homogeneizado cerebral.
20. Incubar as células em meios contendo homogeneizado cerebral por 72 h. Lave as células 2x com PBS para remover o homogeneizado cerebral restante e adicione meios frescos e retorne à incubadora.
21. Use AdMSCs na passagem 3 para co-cultura. Se estimular AdMSCs, use meios contendo 10 ng/mL de TNFα e trate por 24 h antes da co-cultura com BV2 ou glia mista. Lave AdMSCs estimuladas 3x com PBS para remover qualquer TNFα restante.
22. Tripsinize AdMSCs conforme descrito na etapa 1.15 e ressuspenda no meio AdMSC.
23. Gire a suspensão AdMSC a 1.000 × g a 4 °C por 5 min. Durante esse período, substitua o meio nas células BV2 ou glia mista por 2 mL por poço de meio AdMSC e coloque inserções para placas de 6 poços com um tamanho de poro de 0,4 micrômetros na metade dos poços. Adicione 2 mL de mídia AdMSC a cada inserção e mais 2 mL de mídia aos poços que não recebem inserções.
24. Quando terminar de peletizar AdMSCs, ressuspenda o pellet no meio AdMSC. Conte as AdMSCs com um hemocitômetro e adicione 50.000-100.000 células a cada inserção.
25. Para células BV2, incubar coculturas por 24 h. Para glia mista, incubar por apenas 24 h e até 7 dias.
26. Após a incubação com AdMSCs pelo tempo desejado, remova as inserções e descarte-as ou coloque-as em uma nova placa de 6 poços, lave as inserções 2x com PBS, adicione tampão fornecido pelo kit de isolamento de RNA às células mistas da glia ou BV2 e raspe as inserções para analisar o RNA da AdMSC.
27. Trate as AdMSCs na passagem 2 com meios contendo 10 ng/mL de TNFα. No dia seguinte, lave as células com PBS estéril pré-aquecido 3x e incube em meio AdMSC sem soro por 4 h.
28. Para realizar o ensaio de células migratórias, adicione 25.000 AdMSCs por inserto e incube as células por 24 h a 37 ° C. Durante esse tempo, as células migratórias se moverão da câmara superior da inserção e aderirão à parte inferior da inserção. Aspire cuidadosamente o conteúdo do poço e das inserções e lave 2x com PBS, deixando 1 mL de PBS em cada poço para garantir que as inserções permaneçam úmidas de cada lado.
29. Um de cada vez, usando uma pinça, remova as inserções e limpe suavemente, mas completamente, a câmara superior com um cotonete para remover quaisquer células que não tenham migrado. Aspire o PBS restante e pipete 500 μL de solução de cristal violeta para o poço e a câmara superior do inserto, garantindo que a membrana do inserto esteja totalmente submersa.
30. Incubar as pastilhas por 1 h em solução de cristal violeta à temperatura ambiente. Para melhor reter a cor, execute as próximas etapas rapidamente, com apenas uma inserção por vez.
    1. Aspire a solução de cristal violeta do poço e da câmara superior do inserto e lave 3x com PBS. Limpe a câmara superior novamente com um cotonete.
    2. Coloque o inserto em um poço em uma nova placa de 24 poços contendo 1 mL de PBS. Coloque a placa acima de um microscópio invertido com uma câmera acoplada. Usando a objetiva de 10x, tire imagens de quatro áreas aleatórias em direção ao centro da inserção, focando apenas na parte inferior da inserção.
31. Depois de fazer isso com cada poço, faça upload de imagens para o software de processamento de imagem de sua escolha e ajuste o fundo para aumentar o contraste com as células manchadas de roxo. Conte as células manualmente com um contador de células.

Resultados

A estimulação de AdMSCs com TNFα ou interferon-gama (IFNγ) por 24 h induz alterações na expressão de moléculas anti-inflamatórias e fatores de crescimento. O tratamento de AdMSCs com TNFα ou interferon-gama (IFNγ) aumenta o mRNA do gene 6 estimulado por TNF (TSG-6), enquanto o TNFα, mas não o IFNγ, causa um aumento no mRNA do fator de crescimento transformador beta-1 (TGFβ-1). A estimulação com TNFα ou IFNγ induz um aumento no mRNA do fator de crescimento endotelial vascular (VEGF), m...

Discussão

Aqui, demonstramos um protocolo confiável e relativamente barato para avaliar os efeitos das células estromais mesenquimais derivadas do tecido adiposo (AdMSCs) na diminuição da inflamação induzida por príons em um modelo de células gliais. As AdMSCs podem ser facilmente isoladas e expandidas em cultura para uso em menos de 1 semana. Este protocolo produz consistentemente uma população heteróloga de células que expressam marcadores consistentes com os das células estromais mesenquimais por imunofluorescênci...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.25% Trypsin	Cytiva	SH30042.01
5 mL serological pipets	Celltreat	229005B
6-well tissue culture plates	Celltreat	229106
10 cm cell culture dishes	Peak Serum	PS-4002
10 ml serological pipets	Celltreat	229210
15 mL conical tubes	Celltreat	667015B
50 mL conical tubes	Celltreat	667050B
BV2 microglia cell line	AcceGen Biotech	ABC-TC212S
Cell lifter	Biologix Research Company	70-2180
Crystal violet	Electron Microscopy Sciences	12785
Dispase	Thermo Scientific	17105041
DMEM/F12	Caisson Labs	DFL14-500ML
DNase-I	Sigma Aldrich	11284932001
Essential amino acids	Thermo Scientific	11130051
Ethanol (100%)	EMD Millipore	EX0276-1
Fetal bovine serum (heat inactivated)	Peak Serum	PS-FB4	Can be purchased as heat inactivated or inactivated in the laboratory
Formaldehyde	EMD Millipore	1.04003.1000
Glass 10 mL serological pipet	Corning	7077-10N
Hank’s Balances Salt Solution	Sigma Aldrich	H8264-500ML
Hemocytometer/Neubauer Chamber	Daigger	HU-3100
High Glucose DMEM	Cytiva	SH30022.01
low glucose DMEM containing L-glutamine	Cytiva	SH30021.01
MEM/EBSS	Cytiva	SH30024.FS
non-essential amino acids	Sigma-Aldrich	M7145-100M
Paraformaldehyde (16%)	MP Biomedicals	219998320
Penicillin/streptomycin/neomycin	Sigma-Aldrich	P4083-100ML
Phosphate buffered saline	Cytiva	SH30256.01
Recombinant Mouse IFN-gamma Protein	R&D Systems	485-MI
Recombinant Mouse TNF-alpha (aa 80-235) Protein, CF	R&D Systems	410-MT
RNeasy mini kit	Qiagen	74104
Sigmacote	Sigma Aldrich	SL2-100ML	Coat inside of glass pipets by aspirating up and down twice in Sigmacote and allowing to dry thoroughly. Wrap in aluminum foil and autoclave pipets 24 h later.
Stemxyme	Worthington Biochemical Corporation	LS004106	Collagenase/Dispase mixture
Sterile, individually wrapped cotton swab	Puritan Medical	25-8061WC
Thincert Tissue Culture Inserts, 24 well, Pore Size=8 µm	Greiner Bio-One	662638
Thincert Tissue Culture Inserts, 6 well, Pore Size=0.4 µm	Greiner Bio-One	657641