Células estromales mesenquimales derivadas del tejido adiposo cocultivadas con glía mixta primaria para reducir la inflamación inducida por priones

Resumen

Las células estromales mesenquimales derivadas del tejido adiposo (AdMSC) tienen potentes propiedades inmunomoduladoras útiles para tratar enfermedades asociadas con la inflamación. Demostramos cómo aislar y cultivar AdMSCs murinas y glía mixta primaria, estimular AdMSCs para que regulen al alza los genes antiinflamatorios y los factores de crecimiento, evaluar la migración de AdMSCs y co-cultivar AdMSCs con glia primaria infectada con priones mixtos.

Resumen

Las células estromales mesenquimales (MSC) son potentes reguladores de la inflamación a través de la producción de citocinas antiinflamatorias, quimiocinas y factores de crecimiento. Estas células muestran la capacidad de regular la neuroinflamación en el contexto de enfermedades neurodegenerativas como la enfermedad priónica y otros trastornos del plegamiento incorrecto de proteínas. Las enfermedades priónicas pueden ser esporádicas, adquiridas o genéticas; Pueden ser el resultado del mal plegamiento y la agregación de la proteína priónica en el cerebro. Estas enfermedades son invariablemente mortales, sin tratamientos disponibles.

Uno de los primeros signos de la enfermedad es la activación de los astrocitos y la microglía y la inflamación asociada, que se produce antes de la agregación de priones detectable y la pérdida neuronal; por lo tanto, las propiedades antiinflamatorias y reguladoras de las MSC se pueden aprovechar para tratar la astrogliosis en la enfermedad priónica. Recientemente, demostramos que las MSC derivadas del tejido adiposo (AdMSC) cocultivadas con células BV2 o glía mixta primaria reducen la inflamación inducida por priones a través de la señalización paracrina. En este artículo se describe un tratamiento fiable que utiliza AdMSCs estimuladas para disminuir la inflamación inducida por priones.

Una población heterocigota de AdMSCs puede aislarse fácilmente del tejido adiposo murino y expandirse en cultivo. La estimulación de estas células con citoquinas inflamatorias mejora su capacidad para migrar hacia el homogeneizado del cerebro infectado por priones y producir moduladores antiinflamatorios en respuesta. Juntas, estas técnicas se pueden utilizar para investigar el potencial terapéutico de las MSC en la infección por priones y se pueden adaptar para otras enfermedades neuroinflamatorias y de plegamiento incorrecto de proteínas.

Introducción

La inflamación glial desempeña un papel clave en una variedad de enfermedades neurodegenerativas, como el Parkinson, el Alzheimer y la enfermedad priónica. Aunque la agregación anormal de proteínas se atribuye a gran parte de la patogénesis de la enfermedad y la neurodegeneración, las células gliales también desempeñan un papel en la exacerbación de esta ^1,2,3. Por lo tanto, dirigirse a la inflamación inducida por la glía es un enfoque terapéutico prometedor. En la enfermedad priónica, la proteína priónica celular (PrP^C) se pliega mal a la proteína priónica asociada a la enfermedad (PrP^Sc), que forma oligómeros y agregados e interrumpe la homeostasis en el cerebro ^4,5,6.

Uno de los primeros signos de la enfermedad priónica es una respuesta inflamatoria de los astrocitos y la microglía. Los estudios que suprimen esta respuesta, ya sea por eliminación de la microglía o modificación de los astrocitos, generalmente no han mostrado mejoría o empeoramiento de la patogénesis de la enfermedad en modelos animales ^7,8,9. Modular la inflamación glial sin eliminarla es una alternativa intrigante como terapéutica.

Las células estromales mesenquimales (MSC) han tomado la delantera como tratamiento para una variedad de enfermedades inflamatorias, debido a su capacidad para modular la inflamación de manera paracrina ^10,11. Han demostrado la capacidad de migrar a los sitios de inflamación y responder a las moléculas de señalización en estos entornos mediante la secreción de moléculas antiinflamatorias, factores de crecimiento, microARN y más 10,12,13. Hemos demostrado previamente que las MSC derivadas del tejido adiposo (denominadas AdMSCs) son capaces de migrar hacia el homogeneizado cerebral infectado por priones y responder a este homogeneizado cerebral mediante la regulación positiva de la expresión génica para citocinas antiinflamatorias y factores de crecimiento.

Además, las AdMSC pueden disminuir la expresión de genes asociados con el factor nuclear-kappa B (NF-κB), la señalización del inflamasoma que contiene el dominio de pirina de la familia de receptores tipo Nod 3 (NLRP3) y la activación glial, tanto en la microglía BV2 como en la glía mixta primaria ¹⁴. Aquí, proporcionamos protocolos sobre cómo aislar tanto las AdMSC como la glía mixta primaria de ratones, estimular las AdMSC para que regulen al alza los genes moduladores, evaluar la migración de AdMSC y cocultivar AdMSC con glía infectada con priones. Esperamos que estos procedimientos puedan proporcionar una base para una mayor investigación del papel de las MSC en la regulación de la inflamación inducida por la glía en enfermedades neurodegenerativas y otras enfermedades.

Protocolo

Los ratones fueron criados y mantenidos en el Laboratorio de Recursos Animales del Estado de Colorado, acreditado por la Asociación para la Evaluación y Acreditación de Lab Animal Care International, de acuerdo con el protocolo # 1138, aprobado por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad Estatal de Colorado.

1. Aislar e infectar glía cortical primaria mixta con priones

1. Para aislar glía mixta primaria que contiene astrocitos y microglía, obtenga crías de ratón C57Bl/6 de cero a dos días de edad.
   NOTA: Este protocolo es una adaptación de los protocolos anteriores ^15,16.
2. Eutanasia a los cachorros uno a la vez por decapitación y extraer su cerebro, separando y desechando el cerebelo y el tronco encefálico.
   1. Coloque el cerebro en una placa de Petri de 3 cm que contenga MEM/EBSS fría con 2x penicilina/estreptomicina/neomicina (PSN). Bajo un endoscopio de disección, separe los hemisferios cerebrales y extraiga y deseche el mesencéfalo. Retire y deseche el hipocampo y las meninges de la corteza.
   2. Coloque ambos hemisferios corticales en un tubo cónico de 50 mL que contenga 5 mL de MEM/EBSS + 2x PSN y colóquelo en hielo.
3. En una campana de cultivo de tejidos, retire el medio del tubo cónico de 50 ml aspirando suavemente con una pipeta, dejando los trozos de tejido cortical en el fondo del tubo. Con una pipeta de vidrio recubierta, agregue 10 mL de medio de disociación precalentado y triture el tejido con la pipeta de vidrio 10-20x.
4. Transfiera la suspensión a un vaso de precipitados de 50 ml que contenga una pequeña barra de agitación y colóquela en una placa de agitación en la posición más baja, aproximadamente 30 rpm, durante 10 minutos. Retire el vaso de precipitados de la placa de agitación y colóquelo en un ángulo de 30° durante 3 minutos para permitir que el pañuelo se asiente en el fondo. Retire la suspensión celular (sobrenadante) y transfiérala a un nuevo tubo cónico de 50 mL con hielo.
5. Agregue DNasa-I (4,000 U/mL) a 10 mL de medio de disociación y resuspenda el tejido y revuelva durante 10 minutos más. Repita agregando medios de disociación nuevos (sin DNasa-I) de 2 a 4 veces adicionales (una vez por cada dos crías de ratón utilizadas) y transfiriendo la suspensión celular al tubo cónico de 50 ml en hielo, hasta que solo quede tejido fibroso en el fondo del vaso de precipitados.
6. Centrifugar la suspensión celular en el tubo cónico durante 10 min a 1.000 × g a 4 °C. Aspire el sobrenadante y reemplácelo con medio de crecimiento glial. Cuente las células con un hemocitómetro y coloque las células en placas a una densidad de 10⁶ en placas tratadas con cultivo celular de 10 cm. Colocar en una incubadora a 37 °C con 5% de CO₂.
7. Después de 24 h, retire el medio y reemplácelo con medio glial nuevo. Deje que las células alcancen el 100% de confluencia en 2 semanas; Luego, divídelos y empláchalos para experimentar.
8. Para la infección priónica in vitro , placa la glía a 100.000 células por pocillo en placas de 6 pocillos y permite alcanzar una confluencia del 80%-100%. Exponga homogeneizados cerebrales, tanto priones como normales, diluidos al 20% en PBS a la luz ultravioleta durante 30 minutos antes de agregarlos al cultivo celular. Aspirar el medio de la glía que se va a infectar y, a cada pocillo, añadir 1,5-2 mL de medio de crecimiento glial que contenga un volumen final de 0,1% de homogeneizado de cerebro normal o priónico.
9. Después de 72 h, aspire el medio y lave las células con PBS para eliminar cualquier homogeneizado cerebral residual. Reemplácelo con medios de crecimiento glial frescos (que no contengan homogeneizados cerebrales).
10. Para aislar las células AdMSCs, use una pipeta serológica y aspire suavemente el tejido adiposo junto con ~ 1 mL de solución de HBSS / Tripsina. Transfiera a una placa de Petri de 4 cm que contenga 2 mL de medio DMEM/F12 con una mezcla de 200 U/mL de DNasa-I y 400 U/mL de colagenasa/dispasa. Con unas tijeras pequeñas, corte los trozos de tejido adiposo en trozos pequeños (de menos de 5 mm de tamaño) e incube a 37 °C durante 1,5 h.
11. Transfiera el contenido de la placa de Petri a un tubo cónico de 50 mL con una pipeta serológica y triture la mezcla ~ 10x con la pipeta. Asegúrate de que el tejido se rompa fácilmente y forme una mezcla relativamente homogénea. Centrifugar la mezcla a 4 °C durante 5 min a 1.000 × g para granular la fracción vascular estromal, que aparecerá de color rojo.
12. Aspirar el sobrenadante con cuidado y lavar el pellet con 5 mL de PBS estéril precalentado y centrifugar a 4 °C a 1.000 × g durante 3 min. Aspire el sobrenadante y vuelva a suspender el pellet en 1 mL de medio AdMSC (DMEM de baja glucosa que contiene L-glutamina y suplementado con 15% de suero fetal bovino inactivado por calor (hiFBS), 1% de aminoácidos, 1% de aminoácidos no esenciales y 1% de PSN).
13. Coloque un colador de células de 40 μm encima de un tubo cónico estéril de 50 ml y pipetee la suspensión de células a través del filtro para eliminar cualquier tejido no disociado. Añada 9 mL de AdMSC a una placa tratada con cultivo celular de 10 cm y pipetee la suspensión celular colada en la placa. Colocar en una incubadora a 37 °C con 5% de CO₂.
14. Retire y reemplace con un nuevo medio AdMSC al día siguiente. Espere a que las celdas confluyan en un 80-90% cuando estarán listas para ser pasadas entre 72 h y 96 h.
15. Aísle las AdMSC como se ha descrito anteriormente y pasélas dos veces para obtener una población homogénea consistente ¹⁴. Lave las células dos veces con PBS estéril y pipetee 2 mL de tripsina precalentada (0,25%) en cada placa. Incubar las células a 37 °C durante 5 min o hasta que se desprendan completamente de la placa. Agregue 8 mL de medio AdMSC precalentado a cada placa, pipetea para mezclar la suspensión celular, transfiera al tubo cónico y centrifugue a 1,000 × g a 4 °C para pellet.
16. Vuelva a suspender las AdMSC en 3-10 ml de medio (dependiendo del número de placas utilizadas) y cuente las células con un hemocitómetro. Placa de 100.000 células/pocillo en placas de 6 pocillos que contienen medios AdMSC. Colocar en una incubadora a 37 °C con 5% de CO₂ durante la noche.
17. Al día siguiente, estimula las células con citoquinas u homogeneizado cerebral.
    1. En el caso de las células estimuladas por citocinas, elabore medios AdMSC que contengan 10 ng/mL de TNFα o 200 ng/mL de IFNγ. Utilice medios frescos para los pozos de control.
    2. Para los tratamientos de homogeneizado cerebral infectado por priones, obtenga un 20% de homogeneizado cerebral (en PBS) de ratones priónicos infectados terminalmente (cepas de 22L o RML). Homogeneizar el cerebro normal o infectado por PrMSC con una concentración final del 0,1% para los controles.
    3. Aspire los medios de los pocillos y pipetee 1,5 ml de medios que contengan citocinas u homogeneizados cerebrales en los pocillos correspondientes. Realizar por triplicado. Regrese las placas a la incubadora.
18. Retire el medio, lave las células 2 veces con PBS precalentado, aísle el ARN agregando 350 ml de tampón de lisis que contenga 1% de βME a cada pocillo y use un elevador de células para eliminar los lisados celulares. Realice el aislamiento de ARN siguiendo el protocolo del fabricante del mini kit, incluido un paso de digestión de DNasa. Para RT-qPCR, transcriba 25 ng de ARN por muestra y amplifique el ADNc con SYBR Green y cebadores para cada gen a 10 mM. Analice la expresión de ARNm utilizando el método ^2-ΔΔCT y normalice a la expresión del gen de referencia β-actina ¹⁷.
    NOTA: Todas las RT-PCR se realizaron siguiendo las pautas de MIQE.
19. Microglía de placa BV2 a 50.000 células por pocillo, o glía mixta primaria a 100.000 células por pocillo en una placa de 6 pocillos. Trate las células BV2 al día siguiente con medios que contengan un 0,1% de homogeneizado cerebral normal o infectado por priones. En el caso de la glía mixta, espere hasta que las células tengan un 80-90% de confluencia para infectar con homogeneizado cerebral.
20. Incubar las células en medios que contengan homogeneizado cerebral durante 72 h. Lave las células 2 veces con PBS para eliminar el homogeneizado cerebral restante y agregue medios frescos y devuélvalos a la incubadora.
21. Utilice AdMSC en el pasaje 3 para el co-cultivo. Si estimula las AdMSCs, utilice medios que contengan 10 ng/mL de TNFα y trate durante 24 horas antes de co-cultivar con BV2 o glía mixta. Lave las AdMSC estimuladas 3 veces con PBS para eliminar cualquier resto de TNFα.
22. Tripsinice las AdMSC como se describe en el paso 1.15 y vuelva a suspender en los medios AdMSC.
23. Centrifugar la suspensión de AdMSC a 1.000 × g a 4 °C durante 5 min. Durante este tiempo, reemplace los medios en las células BV2 o la glía mixta con 2 mL por pocillo de medio AdMSC y coloque insertos para placas de 6 pocillos con un tamaño de poro de 0,4 micrómetros en la mitad de los pocillos. Agregue 2 mL de medio AdMSC a cada inserto y 2 mL adicionales de medio a los pocillos que no reciben insertos.
24. Cuando termine de peletizar AdMSC, vuelva a suspender el pellet en el medio AdMSC. Cuente las AdMSC con un hemocitómetro y agregue de 50.000 a 100.000 células a cada inserto.
25. En el caso de las células BV2, incubar los cocultivos durante 24 h. En el caso de la glía mixta, incube durante tan solo 24 h y hasta 7 días.
26. Después de la incubación con AdMSC durante el tiempo deseado, retire los insertos y deséchelos, o colóquelos en una nueva placa de 6 pocillos, lave los insertos 2 veces con PBS, agregue el tampón proporcionado por el kit de aislamiento de ARN a las células de glía mixta o BV2 y raspe los insertos para analizar el ARN de AdMSC.
27. Tratar las AdMSC en el pasaje 2 con medios que contengan 10 ng/mL de TNFα. Al día siguiente, lavar las células con PBS estéril precalentado 3x e incubar en medios AdMSC sin suero durante 4 h.
28. Para realizar el ensayo de células migratorias, agregue 25.000 AdMSC por inserto e incube las células durante 24 h a 37 °C. Durante este tiempo, las células migratorias se moverán desde la cámara superior del inserto y se adherirán a la parte inferior del inserto. Aspire cuidadosamente el contenido tanto del pocillo como de los insertos y lave 2 veces con PBS, dejando 1 ml de PBS en cada pocillo para asegurarse de que los insertos permanezcan húmedos en cada lado.
29. Una a la vez, con pinzas, retire los insertos y limpie suave pero minuciosamente la cámara superior con un hisopo de algodón para eliminar las células que no hayan migrado. Aspire el PBS restante y pipetee 500 μL de solución de violeta cristalina tanto en el pocillo como en la cámara superior del inserto, asegurándose de que la membrana del inserto esté completamente sumergida.
30. Incubar los insertos durante 1 h en una solución de violeta cristalina a temperatura ambiente. Para retener mejor el color, realice los siguientes pasos rápidamente, con solo un inserto a la vez.
    1. Aspire la solución de violeta cristalina del pocillo y de la cámara superior del inserto y lávela 3 veces con PBS. Vuelva a limpiar la cámara superior con un bastoncillo de algodón.
    2. Coloque el inserto en un pocillo en una nueva placa de 24 pocillos que contenga 1 mL de PBS. Coloque la placa sobre un microscopio invertido con una cámara conectada. Con el objetivo 10x, tome imágenes de cuatro áreas aleatorias hacia el centro de la plaquita, enfocándose solo en la parte inferior de la plaquita.
31. Después de realizar esto con cada pocillo, cargue las imágenes en el software de procesamiento de imágenes de su elección y ajuste el fondo para mejorar el contraste con las celdas teñidas de púrpura. Cuente las celdas manualmente con un contador de celdas.

Resultados

La estimulación de AdMSCs con TNFα o interferón-gamma (IFNγ) durante 24 h induce cambios en la expresión de moléculas antiinflamatorias y factores de crecimiento. El tratamiento de las AdMSC con TNFα o interferón-gamma (IFNγ) aumenta el ARNm del gen 6 (TSG-6) estimulado por TNF, mientras que el TNFα, pero no el IFNγ, provoca un aumento del ARNm del factor de crecimiento transformante beta-1 (TGFβ-1). La estimulación con TNFα o IFNγ induce un aumento en el ARNm del factor de crecimiento en...

Discusión

Aquí demostramos un protocolo fiable y relativamente barato para evaluar los efectos de las células estromales mesenquimales derivadas del tejido adiposo (AdMSCs) en la disminución de la inflamación inducida por priones en un modelo de células gliales. Las AdMSC se pueden aislar y expandir fácilmente en cultivo para su uso en tan solo 1 semana. Este protocolo produce consistentemente una población heteróloga de células que expresan marcadores consistentes con los de las células estromales mesenquimales por inmu...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.25% Trypsin	Cytiva	SH30042.01
5 mL serological pipets	Celltreat	229005B
6-well tissue culture plates	Celltreat	229106
10 cm cell culture dishes	Peak Serum	PS-4002
10 ml serological pipets	Celltreat	229210
15 mL conical tubes	Celltreat	667015B
50 mL conical tubes	Celltreat	667050B
BV2 microglia cell line	AcceGen Biotech	ABC-TC212S
Cell lifter	Biologix Research Company	70-2180
Crystal violet	Electron Microscopy Sciences	12785
Dispase	Thermo Scientific	17105041
DMEM/F12	Caisson Labs	DFL14-500ML
DNase-I	Sigma Aldrich	11284932001
Essential amino acids	Thermo Scientific	11130051
Ethanol (100%)	EMD Millipore	EX0276-1
Fetal bovine serum (heat inactivated)	Peak Serum	PS-FB4	Can be purchased as heat inactivated or inactivated in the laboratory
Formaldehyde	EMD Millipore	1.04003.1000
Glass 10 mL serological pipet	Corning	7077-10N
Hank’s Balances Salt Solution	Sigma Aldrich	H8264-500ML
Hemocytometer/Neubauer Chamber	Daigger	HU-3100
High Glucose DMEM	Cytiva	SH30022.01
low glucose DMEM containing L-glutamine	Cytiva	SH30021.01
MEM/EBSS	Cytiva	SH30024.FS
non-essential amino acids	Sigma-Aldrich	M7145-100M
Paraformaldehyde (16%)	MP Biomedicals	219998320
Penicillin/streptomycin/neomycin	Sigma-Aldrich	P4083-100ML
Phosphate buffered saline	Cytiva	SH30256.01
Recombinant Mouse IFN-gamma Protein	R&D Systems	485-MI
Recombinant Mouse TNF-alpha (aa 80-235) Protein, CF	R&D Systems	410-MT
RNeasy mini kit	Qiagen	74104
Sigmacote	Sigma Aldrich	SL2-100ML	Coat inside of glass pipets by aspirating up and down twice in Sigmacote and allowing to dry thoroughly. Wrap in aluminum foil and autoclave pipets 24 h later.
Stemxyme	Worthington Biochemical Corporation	LS004106	Collagenase/Dispase mixture
Sterile, individually wrapped cotton swab	Puritan Medical	25-8061WC
Thincert Tissue Culture Inserts, 24 well, Pore Size=8 µm	Greiner Bio-One	662638
Thincert Tissue Culture Inserts, 6 well, Pore Size=0.4 µm	Greiner Bio-One	657641