Prion Kaynaklı Enflamasyonu Azaltmak için Primer Karışık Glia ile Ko-Kültürlenmiş Adipoz Kaynaklı Mezenkimal Stromal Hücreler

Özet

Adipoz kaynaklı mezenkimal stromal hücreler (AdMSC'ler), inflamasyonla ilişkili hastalıkların tedavisinde yararlı olan güçlü immünomodülatör özelliklere sahiptir. Murin AdMSC'lerin ve primer karışık gliaların nasıl izole edileceğini ve kültürleneceğini, AdMSC'lerin anti-inflamatuar genleri ve büyüme faktörlerini yukarı regüle etmek için nasıl uyarılacağını, AdMSC'lerin göçünün nasıl değerlendirileceğini ve AdMSC'lerin primer karışık prion ile enfekte glia ile nasıl ko-kültür yapılacağını gösteriyoruz.

Özet

Mezenkimal stromal hücreler (MSC'ler), anti-inflamatuar sitokinler, kemokinler ve büyüme faktörlerinin üretimi yoluyla inflamasyonun güçlü düzenleyicileridir. Bu hücreler, prion hastalığı ve diğer protein yanlış katlanma bozuklukları gibi nörodejeneratif hastalıklar bağlamında nöroinflamasyonu düzenleme yeteneği gösterir. Prion hastalıkları sporadik, edinsel veya genetik olabilir; Beyindeki prion proteininin yanlış katlanması ve toplanmasından kaynaklanabilirler. Bu hastalıklar her zaman ölümcüldür ve mevcut bir tedavisi yoktur.

Hastalığın en erken belirtilerinden biri, astrositlerin ve mikrogliaların aktivasyonu ve saptanabilir prion agregasyonu ve nöronal kayıptan önce ortaya çıkan ilişkili inflamasyondur; bu nedenle, MSC'lerin anti-enflamatuar ve düzenleyici özellikleri, prion hastalığında astrogliozu tedavi etmek için hasat edilebilir. Son zamanlarda, BV2 hücreleri veya primer karışık glia ile birlikte kültürlenen adipoz kaynaklı MSC'lerin (AdMSC'ler) parakrin sinyalleme yoluyla prion kaynaklı inflamasyonu azalttığını gösterdik. Bu makale, prion kaynaklı inflamasyonu azaltmak için uyarılmış AdMSC'leri kullanan güvenilir bir tedaviyi açıklamaktadır.

Heterozigot bir AdMSC popülasyonu, murin yağ dokusundan kolayca izole edilebilir ve kültürde genişletilebilir. Bu hücrelerin inflamatuar sitokinlerle uyarılması, hem prion ile enfekte beyin homojenatına doğru göç etme hem de yanıt olarak anti-inflamatuar modülatörler üretme yeteneklerini arttırır. Birlikte, bu teknikler MSC'lerin prion enfeksiyonu üzerindeki terapötik potansiyelini araştırmak için kullanılabilir ve diğer protein yanlış katlanması ve nöroinflamatuar hastalıklar için uyarlanabilir.

Giriş

Glial inflamasyon, Parkinson, Alzheimer ve prion hastalığı dahil olmak üzere çeşitli nörodejeneratif hastalıklarda önemli bir rol oynar. Anormal protein agregasyonu, hastalık patogenezi ve nörodejenerasyonun çoğuna atfedilse de, glial hücreler de bu 1,2,3'ün şiddetlenmesinde rol oynar. Bu nedenle, glial kaynaklı inflamasyonu hedeflemek umut verici bir terapötik yaklaşımdır. Prion hastalığında, hücresel prion proteini (PrP^C), oligomerleri oluşturan ve beyinde agregat oluşturan ve homeostazı bozan hastalıkla ilişkili prion proteinine (PrP^Sc) yanlış katlan....

Protokol

Fareler, Colorado Eyalet Üniversitesi'ndeki Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi tarafından onaylanan protokol #1138'e uygun olarak, Lab Animal Care International Değerlendirme ve Akreditasyon Derneği tarafından akredite edilmiş Colorado Eyaleti'nin Laboratuvar Hayvan Kaynakları'nda yetiştirildi ve bakımı yapıldı.

1. Primer kortikal karışık glia'nın prionlarla izole edilmesi ve enfekte edilmesi

1. Hem astrositleri hem de mikrogliaları içeren birincil karışık gliaları izole etmek için, sıfır ila iki günlük C57Bl / 6 fare yavruları elde edin.
   NOT: Bu protokol önceki protokollerden ^{uyarlanmı....}

Tartışmalar

Burada, bir glial hücre modelinde prion kaynaklı inflamasyonu azaltmada adipoz kaynaklı mezenkimal stromal hücrelerin (AdMSC'ler) etkilerini değerlendirmek için güvenilir ve nispeten ucuz bir protokol gösteriyoruz. AdMSC'ler, 1 hafta gibi kısa bir sürede kullanım için kültürde kolayca izole edilebilir ve genişletilebilir. Bu protokol tutarlı bir şekilde, immünofloresan ve akış sitometrisi ile mezenkimal stromal hücrelerinkiyle tutarlı belirteçleri eksprese eden ve sitokinlere veya prion ile enfekte.......

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.25% Trypsin	Cytiva	SH30042.01
5 mL serological pipets	Celltreat	229005B
6-well tissue culture plates	Celltreat	229106
10 cm cell culture dishes	Peak Serum	PS-4002
10 ml serological pipets	Celltreat	229210
15 mL conical tubes	Celltreat	667015B
50 mL conical tubes	Celltreat	667050B
BV2 microglia cell line	AcceGen Biotech	ABC-TC212S
Cell lifter	Biologix Research Company	70-2180
Crystal violet	Electron Microscopy Sciences	12785
Dispase	Thermo Scientific	17105041
DMEM/F12	Caisson Labs	DFL14-500ML
DNase-I	Sigma Aldrich	11284932001
Essential amino acids	Thermo Scientific	11130051
Ethanol (100%)	EMD Millipore	EX0276-1
Fetal bovine serum (heat inactivated)	Peak Serum	PS-FB4	Can be purchased as heat inactivated or inactivated in the laboratory
Formaldehyde	EMD Millipore	1.04003.1000
Glass 10 mL serological pipet	Corning	7077-10N
Hank’s Balances Salt Solution	Sigma Aldrich	H8264-500ML
Hemocytometer/Neubauer Chamber	Daigger	HU-3100
High Glucose DMEM	Cytiva	SH30022.01
low glucose DMEM containing L-glutamine	Cytiva	SH30021.01
MEM/EBSS	Cytiva	SH30024.FS
non-essential amino acids	Sigma-Aldrich	M7145-100M
Paraformaldehyde (16%)	MP Biomedicals	219998320
Penicillin/streptomycin/neomycin	Sigma-Aldrich	P4083-100ML
Phosphate buffered saline	Cytiva	SH30256.01
Recombinant Mouse IFN-gamma Protein	R&D Systems	485-MI
Recombinant Mouse TNF-alpha (aa 80-235) Protein, CF	R&D Systems	410-MT
RNeasy mini kit	Qiagen	74104
Sigmacote	Sigma Aldrich	SL2-100ML	Coat inside of glass pipets by aspirating up and down twice in Sigmacote and allowing to dry thoroughly. Wrap in aluminum foil and autoclave pipets 24 h later.
Stemxyme	Worthington Biochemical Corporation	LS004106	Collagenase/Dispase mixture
Sterile, individually wrapped cotton swab	Puritan Medical	25-8061WC
Thincert Tissue Culture Inserts, 24 well, Pore Size=8 µm	Greiner Bio-One	662638
Thincert Tissue Culture Inserts, 6 well, Pore Size=0.4 µm	Greiner Bio-One	657641