人类干细胞来源的中脑多巴胺能神经元的表型分析

摘要

该方案描述了人中脑多巴胺能神经元的细胞培养，然后进行免疫染色和从获得的微观高内涵图像生成神经元表型图谱，从而可以识别由于遗传或化学调节引起的表型变异。

摘要

帕金森病 （PD） 与一系列导致中脑多巴胺能 （mDA） 神经元丢失的细胞生物学过程有关。许多目前的 体外 PD细胞模型缺乏复杂性，没有考虑多种表型。人诱导多能干细胞 （iPSC） 衍生的 mDA 神经元的表型分析可以通过同时测量 PD 相关细胞类型中的一系列神经元表型来解决这些缺点。在这里，我们描述了一种从市售的人类mDA神经元中获取和分析表型谱的协议。神经元特异性荧光染色面板用于可视化细胞核、α-突触核蛋白、酪氨酸羟化酶 （TH） 和微管相关蛋白 2 （MAP2） 相关表型。所描述的表型分析方案具有可扩展性，因为它使用 384 孔板、自动液体处理和高通量显微镜。使用健康供体 mDA 神经元和携带富含亮氨酸的重复激酶 2 （LRRK2） 基因中 PD 连接的 G2019S 突变的 mDA 神经元来举例说明该协议的效用。两种细胞系均用LRRK2激酶抑制剂PFE-360处理，并测量表型变化。此外，我们还演示了如何使用聚类或机器学习驱动的监督分类方法分析多维表型图谱。所描述的协议将特别引起从事神经元疾病建模或研究人类神经元中化合物效应的研究人员的兴趣。

引言

帕金森病 （PD） 中的多种细胞生物过程受到干扰。例如，线粒体功能障碍、氧化应激、蛋白质降解缺陷、囊泡运输和内溶酶体功能的破坏与中脑多巴胺能 （mDA） 神经元丢失有关，常见于 PD¹。因此，帕金森病似乎涉及多种疾病机制，这些机制可以相互作用并相互恶化。研究这种机制相互作用的一种有用方法是创建中脑多巴胺能 （mDA） 神经元的综合表型指纹或图谱。

表型分析是一种方法，涉及根据一组可测量的特征创建样本的图谱，其次，它涉及根据该图谱对样本进行预测 ^2,3。分析的目标是捕获各种特征，其中一些特征以前可能与疾病或治疗无关³.因此，分析可以揭示意想不到的生物过程。表型分析通常依赖于荧光染色的细胞，并且已经开发了标准化检测方法，例如细胞绘画，以创建表型图^{谱 4}。例如，最近，表型分析已被应用于小分子的表征或仅基于患者来源的成纤维细胞 ^5,6 的 PD 亚型的准确预测。尽管取得了这些进展，但表型分析很少应用于有丝分裂后分化细胞，例如表达PD相关突变（如LRRK2 G2019S）的人诱导多能干细胞（iPSC）衍生的mDA....

研究方案

1. 准备用于神经元接种的培养基和培养板（第 1 天）

1. 为了在第 1 天准备用于神经元接种的板，请在使用前将层粘连蛋白加热至室温 （RT）。通过将层粘连蛋白储备溶液（0.1mg / mL）稀释在冷PBS + / +（含Ca²⁺ 和Mg^{2 +}）中1/10来制备层粘连蛋白溶液。
   注：所有试剂均列在 材料表中。溶液和缓冲液的组成见 表1-4。
2. 然后，向聚-D-赖氨酸（PDL）预涂384孔板的每个孔中加入25μL层粘连蛋白溶液，并在4°C下孵育过夜。 包被的板可以在4°C下储存长达一周。
   注意：该协议可以在此处暂停长达一周。使用塑料薄膜密封板。
3. 准备完整的维持培养基并在4°C下储存长达一个月（表1）。

2. 神经元解冻（第 0 天）

1. 为了在第0天解冻神经元，将水浴预热至37°C，并将完全维持培养基平衡至RT，避光。
2. 将装有商业获得的冷冻神经元（见 材料表）的小瓶从液氮罐中取出，并将其放在干冰上。然后将小瓶放入水浴中2分钟。液体完全解冻后，用70%乙醇对小瓶进行消毒。
3. 用P1000移液管（约370μL....

讨论

表型分析是一种通过应用荧光染色、显微镜和图像分析来测量细胞中大量表型的技术³。可以跨细胞系或其他实验条件获得和比较表型图谱，以了解细胞生物学中的复杂变化，这些变化在使用单次读数时可能会被忽视。在这里^，我们描述了表型分析在人类 iPSC 衍生的 mDA 神经元中的应用，这是一种经常用于模拟 PD 细胞生物学的细胞类型^17,18,19。

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Anti- chicken – Alexa 647	Jackson ImmunoRearch	703-605-155	Immunofluorescence
Anaconda		https://www.anaconda.com/download
Anti-Map2	Novus	NB300-213	Immunofluorescence
Anti-mouse - Alexa 488	Thermo Fisher	A11001	Immunofluorescence
Anti-rabbit - Alexa 555	Thermo Fisher	A21429	Immunofluorescence
Anti-Tyrosine Hydroxylase	Merck	T2928	Immunofluorescence
Anti-α-synuclein	Abcam	138501	Immunofluorescence
Bravo Automated Liquid Handling Platform with 384ST head	Agilent		If no liquid handler is available, the use of an electronic multichannel pipette is recommended.
Confocal microscope	Yokogawa	CV7000	The use of an automated confocal fluorescence microscope is recommended to ensure image quality consistency.
Countess Automated cell counter	Invitrogen		Cell counting before seeding. Can also be done using a manual counting chamber.
DPBS +/+	Gibco	14040-133	Buffer for washing
EL406 Washer Dispenser	BioTek (Agilent)		If no liquid handler is available, the use of an electronic multichannel pipette is recommended.
Formaldehyde Solution (PFA 16 %)	Euromedex	EM-15710-S	Fixation before staining
Hoechst 33342	Invitrogen	H3570	Nuclear staining
iCell Base Medium 1	Fujifilm	M1010	Base medium for neurons
iCell DPN, Donor#01279, Phenotype AHN, lot#106339, 1M	Fujifilm	C1087	Apparently healthy donor
iCell DPN, Donor#11299, Phenotype LRRK2 G2019S, phenotype PD lot#106139	Fujifilm	C1149	Donor carrying LRRK2 G2019S mutation
iCell Nervous System Supplement	Fujifilm	M1031	Supplement for base medium
iCell Neural Supplement B	Fujifilm	M1029	Supplement for base medium
Jupyter Python Notebook	In-house development	https://github.com/Ksilink/Notebooks/tree/main/Neuro/DopaNeuronProfiling	Notebook to perform phenotypic profile visualization and classification from raw data.
Laminin	Biolamina	LN521	Plate coating
PFE-360	MedChemExpress	HY-120085	LRRK2 kinase inhibitor
PhenoLink	In-house development	https://github.com/Ksilink/PhenoLink	Software for image analysis
PhenoPlate 384w, PDL coated	Perkin Elmer	6057500	Pre-coated plate for cell culture and imaging. This plate allows imaging of all wells using all objectives of the Yokogawa CV7000 microscope.
Storage plates Abgene 120 µL	Thermo Scientific	AB-0781	Necessary for compound dispensing using the Vprep pipetting system. If not available, the use of an electronic multichannel pipette is recommended.
Triton	Sigma	T9284	Permeabilization before lysis
Trypan Blue	Sigma	T8154-20ML	Determination of living cells
Vprep Pipetting System	Agilent		Medium change and compound dispensing. Alternatively, an electronic multichannel pipette can be used.