Фенотипическое профилирование дофаминергических нейронов среднего мозга человека, полученных из стволовых клеток человека

Резюме

Этот протокол описывает культивирование клеток дофаминергических нейронов среднего мозга человека с последующим иммунологическим окрашиванием и генерацией нейрональных фенотипических профилей из полученных микроскопических изображений с высоким содержанием, позволяющих идентифицировать фенотипические вариации, обусловленные генетическими или химическими модуляциями.

Аннотация

Болезнь Паркинсона (БП) связана с рядом клеточных биологических процессов, которые вызывают потерю дофаминергических нейронов среднего мозга (мДА). Многие современные клеточные модели БП in vitro недостаточно сложны и не учитывают множественные фенотипы. Фенотипическое профилирование нейронов мДА, полученных из индуцированных плюрипотентных стволовых клеток человека (iPSC), может устранить эти недостатки путем одновременного измерения ряда фенотипов нейронов в PD-релевантном типе клеток. В данной статье мы опишем протокол получения и анализа фенотипических профилей коммерчески доступных нейронов мДА человека. Нейрон-специфическая флуоресцентная окрашивающая панель используется для визуализации фенотипов, связанных с ядерным α-синуклеином, тирозингидроксилазой (ТГ) и микротрубочками-ассоциированным белком 2 (MAP2). Описанный протокол фенотипического профилирования является масштабируемым, так как в нем используются 384-луночные планшеты, автоматическая работа с жидкостями и высокопроизводительная микроскопия. Полезность протокола проиллюстрирована на примере здоровых донорских нейронов mDA и нейронов mDA, несущих PD-сцепленную мутацию G2019S в гене лейцин-богатой повторной киназы 2 (LRRK2). Обе клеточные линии обрабатывали ингибитором киназы LRRK2 PFE-360 и измеряли фенотипические изменения. Кроме того, мы демонстрируем, как многомерные фенотипические профили могут быть проанализированы с помощью кластеризации или методов классификации с учителем на основе машинного обучения. Описанный протокол будет особенно интересен исследователям, работающим над моделированием заболеваний нейронов или изучающими эффекты химических соединений в нейронах человека.

Введение

При болезни Паркинсона (БП) нарушаются различные клеточные биологические процессы. Например, митохондриальная дисфункция, окислительный стресс, дефекты деградации белков, нарушение везикулярного транспорта и эндолизосомальной функции, связанные с потерей дофаминергических нейронов среднего мозга (мДА), обычно наблюдаются при БП¹. Таким образом, болезнь Паркинсона, по-видимому, включает в себя несколько механизмов заболевания, которые могут взаимодействовать друг с другом и ухудшать друг друга. Одним из полезных способов исследования этого механистического взаимодействия является создание комплексного фенотипического отпечатка пальца или профиля....

протокол

1. Подготовка среды и планшетов для посева нейронов (День 1)

1. Чтобы подготовить планшеты к посеву нейронов в День-1, подогрейте ламинин до комнатной температуры (RT) непосредственно перед использованием. Приготовьте раствор ламинина, разбавив исходный раствор ламинина (0,1 мг/мл) 1/10 в холодном PBS+/+ (с Ca 2+ и Mg²⁺).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Все реагенты перечислены в таблице материалов. Составы растворов и буферов описаны в таблицах 1-4.
2. Затем добавьте 25 мкл раствора ламинина в каждую лунку 384-луночного планшета с полимер-D-лизином (PDL) и инкубируйте в течение ночи при 4 °C. Плас....

Результаты

Фенотипическое профилирование нейронов мДА является эффективным способом количественной оценки различных аспектов клеточной биологии и их изменений во время экспериментальной модуляции. Чтобы проиллюстрировать эту методологию, в этом исследовании использовались криоконсервирова.......

Обсуждение

Фенотипическое профилирование — это метод измерения большого числа фенотипов в клетках с помощью флуоресцентного окрашивания, микроскопии и анализа изображений³. Фенотипические профили могут быть получены и сравнены между клеточными линиями или другими эксперименталь?.......

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Anti- chicken – Alexa 647	Jackson ImmunoRearch	703-605-155	Immunofluorescence
Anaconda		https://www.anaconda.com/download
Anti-Map2	Novus	NB300-213	Immunofluorescence
Anti-mouse - Alexa 488	Thermo Fisher	A11001	Immunofluorescence
Anti-rabbit - Alexa 555	Thermo Fisher	A21429	Immunofluorescence
Anti-Tyrosine Hydroxylase	Merck	T2928	Immunofluorescence
Anti-α-synuclein	Abcam	138501	Immunofluorescence
Bravo Automated Liquid Handling Platform with 384ST head	Agilent		If no liquid handler is available, the use of an electronic multichannel pipette is recommended.
Confocal microscope	Yokogawa	CV7000	The use of an automated confocal fluorescence microscope is recommended to ensure image quality consistency.
Countess Automated cell counter	Invitrogen		Cell counting before seeding. Can also be done using a manual counting chamber.
DPBS +/+	Gibco	14040-133	Buffer for washing
EL406 Washer Dispenser	BioTek (Agilent)		If no liquid handler is available, the use of an electronic multichannel pipette is recommended.
Formaldehyde Solution (PFA 16 %)	Euromedex	EM-15710-S	Fixation before staining
Hoechst 33342	Invitrogen	H3570	Nuclear staining
iCell Base Medium 1	Fujifilm	M1010	Base medium for neurons
iCell DPN, Donor#01279, Phenotype AHN, lot#106339, 1M	Fujifilm	C1087	Apparently healthy donor
iCell DPN, Donor#11299, Phenotype LRRK2 G2019S, phenotype PD lot#106139	Fujifilm	C1149	Donor carrying LRRK2 G2019S mutation
iCell Nervous System Supplement	Fujifilm	M1031	Supplement for base medium
iCell Neural Supplement B	Fujifilm	M1029	Supplement for base medium
Jupyter Python Notebook	In-house development	https://github.com/Ksilink/Notebooks/tree/main/Neuro/DopaNeuronProfiling	Notebook to perform phenotypic profile visualization and classification from raw data.
Laminin	Biolamina	LN521	Plate coating
PFE-360	MedChemExpress	HY-120085	LRRK2 kinase inhibitor
PhenoLink	In-house development	https://github.com/Ksilink/PhenoLink	Software for image analysis
PhenoPlate 384w, PDL coated	Perkin Elmer	6057500	Pre-coated plate for cell culture and imaging. This plate allows imaging of all wells using all objectives of the Yokogawa CV7000 microscope.
Storage plates Abgene 120 µL	Thermo Scientific	AB-0781	Necessary for compound dispensing using the Vprep pipetting system. If not available, the use of an electronic multichannel pipette is recommended.
Triton	Sigma	T9284	Permeabilization before lysis
Trypan Blue	Sigma	T8154-20ML	Determination of living cells
Vprep Pipetting System	Agilent		Medium change and compound dispensing. Alternatively, an electronic multichannel pipette can be used.