Profilage phénotypique des neurones dopaminergiques du mésencéphale dérivés de cellules souches humaines

Résumé

Ce protocole décrit la culture cellulaire de neurones dopaminergiques du mésencéphale humain, suivie d’une coloration immunologique et de la génération de profils phénotypiques neuronaux à partir d’images microscopiques acquises à haut contenu permettant l’identification de variations phénotypiques dues à des modulations génétiques ou chimiques.

Résumé

La maladie de Parkinson (MP) est liée à une série de processus biologiques cellulaires qui provoquent la perte de neurones dopaminergiques du mésencéphale (mDA). De nombreux modèles cellulaires de MP in vitro actuels manquent de complexité et ne prennent pas en compte plusieurs phénotypes. Le profilage phénotypique dans les neurones mDA dérivés de cellules souches pluripotentes induites humaines (iPSC) peut remédier à ces lacunes en mesurant simultanément une gamme de phénotypes neuronaux dans un type de cellule pertinent pour la maladie de Parkinson en parallèle. Nous décrivons ici un protocole permettant d’obtenir et d’analyser des profils phénotypiques à partir de neurones mDA humains disponibles dans le commerce. Un panel de coloration fluorescente spécifique aux neurones est utilisé pour visualiser les phénotypes nucléaires, liés à la α-synucléine, à la tyrosine hydroxylase (TH) et à la protéine associée aux microtubules 2 (MAP2). Le protocole de profilage phénotypique décrit est évolutif car il utilise des plaques à 384 puits, une manipulation automatique des liquides et une microscopie à haut débit. L’utilité du protocole est illustrée par l’utilisation de neurones mDA donneurs sains et de neurones mDA porteurs de la mutation G2019S liée à la maladie de Parkinson dans le gène LRRK2 (Leucine-rich repeat kinase 2). Les deux lignées cellulaires ont été traitées avec l’inhibiteur de la kinase LRRK2 PFE-360 et les changements phénotypiques ont été mesurés. De plus, nous démontrons comment les profils phénotypiques multidimensionnels peuvent être analysés à l’aide de méthodes de classification supervisée basées sur le clustering ou l’apprentissage automatique. Le protocole décrit intéressera particulièrement les chercheurs travaillant sur la modélisation des maladies neuronales ou l’étude des effets des composés chimiques dans les neurones humains.

Introduction

Divers processus biologiques cellulaires sont perturbés dans la maladie de Parkinson (MP). Par exemple, un dysfonctionnement mitochondrial, un stress oxydatif, des défauts de dégradation des protéines, une perturbation du trafic vésiculaire et de la fonction endolysosomale ont été associés à une perte de neurones dopaminergiques du mésencéphale (mDA) sont couramment observés dans la MP¹. Par conséquent, la maladie de Parkinson semble impliquer de multiples mécanismes pathologiques qui peuvent interagir et s’aggraver mutuellement. Un moyen utile d’étudier cette interaction mécanistique est la création d’une empreinte phénotypique complète ou d’u....

Protocole

1. Préparation du milieu et des plaques pour l’ensemencement des neurones (Jour 1)

1. Pour préparer les plaques pour l’ensemencement des neurones au jour 1, réchauffez la laminine à température ambiante (RT) juste avant l’utilisation. Préparer la solution de laminine en diluant la solution mère de laminine (0,1 mg/mL) 1/10 dans du PBS+/+ froid (avec Ca 2⁺ et Mg²⁺).
   REMARQUE : Tous les réactifs sont répertoriés dans le tableau des matériaux. Les compositions des solutions et des tampons sont décrites dans les tableaux 1 à 4.
2. Ensuite, ajoutez 25 μL de la solution de laminine dan....

Discussion

Le profilage phénotypique est une technique permettant de mesurer un grand nombre de phénotypes dans les cellules en appliquant des colorations fluorescentes, la microscopie et l’analyse d’images³. Des profils phénotypiques peuvent être obtenus et comparés entre des lignées cellulaires ou d’autres conditions expérimentales pour comprendre des changements complexes dans la biologie cellulaire qui pourraient passer inaperçus lors de l’utilisation d’une seule lecture. Nous décrivon.......

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Anti- chicken – Alexa 647	Jackson ImmunoRearch	703-605-155	Immunofluorescence
Anaconda		https://www.anaconda.com/download
Anti-Map2	Novus	NB300-213	Immunofluorescence
Anti-mouse - Alexa 488	Thermo Fisher	A11001	Immunofluorescence
Anti-rabbit - Alexa 555	Thermo Fisher	A21429	Immunofluorescence
Anti-Tyrosine Hydroxylase	Merck	T2928	Immunofluorescence
Anti-α-synuclein	Abcam	138501	Immunofluorescence
Bravo Automated Liquid Handling Platform with 384ST head	Agilent		If no liquid handler is available, the use of an electronic multichannel pipette is recommended.
Confocal microscope	Yokogawa	CV7000	The use of an automated confocal fluorescence microscope is recommended to ensure image quality consistency.
Countess Automated cell counter	Invitrogen		Cell counting before seeding. Can also be done using a manual counting chamber.
DPBS +/+	Gibco	14040-133	Buffer for washing
EL406 Washer Dispenser	BioTek (Agilent)		If no liquid handler is available, the use of an electronic multichannel pipette is recommended.
Formaldehyde Solution (PFA 16 %)	Euromedex	EM-15710-S	Fixation before staining
Hoechst 33342	Invitrogen	H3570	Nuclear staining
iCell Base Medium 1	Fujifilm	M1010	Base medium for neurons
iCell DPN, Donor#01279, Phenotype AHN, lot#106339, 1M	Fujifilm	C1087	Apparently healthy donor
iCell DPN, Donor#11299, Phenotype LRRK2 G2019S, phenotype PD lot#106139	Fujifilm	C1149	Donor carrying LRRK2 G2019S mutation
iCell Nervous System Supplement	Fujifilm	M1031	Supplement for base medium
iCell Neural Supplement B	Fujifilm	M1029	Supplement for base medium
Jupyter Python Notebook	In-house development	https://github.com/Ksilink/Notebooks/tree/main/Neuro/DopaNeuronProfiling	Notebook to perform phenotypic profile visualization and classification from raw data.
Laminin	Biolamina	LN521	Plate coating
PFE-360	MedChemExpress	HY-120085	LRRK2 kinase inhibitor
PhenoLink	In-house development	https://github.com/Ksilink/PhenoLink	Software for image analysis
PhenoPlate 384w, PDL coated	Perkin Elmer	6057500	Pre-coated plate for cell culture and imaging. This plate allows imaging of all wells using all objectives of the Yokogawa CV7000 microscope.
Storage plates Abgene 120 µL	Thermo Scientific	AB-0781	Necessary for compound dispensing using the Vprep pipetting system. If not available, the use of an electronic multichannel pipette is recommended.
Triton	Sigma	T9284	Permeabilization before lysis
Trypan Blue	Sigma	T8154-20ML	Determination of living cells
Vprep Pipetting System	Agilent		Medium change and compound dispensing. Alternatively, an electronic multichannel pipette can be used.