인간 줄기세포 유래 중뇌 도파민 뉴런의 표현형 프로파일링

요약

이 프로토콜은 인간 중뇌 도파민 뉴런의 세포 배양에 이어 면역학적 염색 및 획득된 현미경 high-content 이미지에서 신경 세포 표현형 프로파일 생성을 설명하여 유전적 또는 화학적 조절로 인한 표현형 변이를 식별할 수 있습니다.

초록

파킨슨병(PD)은 중뇌 도파민(mDA) 뉴런 손실을 유발하는 다양한 세포 생물학적 과정과 관련이 있습니다. 현재의 많은 in vitro PD 세포 모델은 복잡성이 부족하고 여러 표현형을 고려하지 않습니다. 인간 유도 만능 줄기 세포(iPSC) 유래 mDA 뉴런의 표현형 프로파일링은 PD 관련 세포 유형에서 다양한 뉴런 표현형을 동시에 측정하여 이러한 단점을 해결할 수 있습니다. 여기서는 상업적으로 이용 가능한 인간 mDA 뉴런에서 표현형 프로파일을 얻고 분석하기 위한 프로토콜을 설명합니다. 뉴런 특이적 형광 염색 패널은 핵, α-시누클레인, 티로신 하이드록실라제(TH) 및 미세소관 관련 단백질 2(MAP2) 관련 표현형을 시각화하는 데 사용됩니다. 설명된 표현형 프로파일링 프로토콜은 384웰 플레이트, 자동 액체 처리 및 고처리량 현미경을 사용하기 때문에 확장 가능합니다. 프로토콜의 유용성은 건강한 기증자 mDA 뉴런과 류신이 풍부한 반복 키나아제 2(LRRK2) 유전자에서 PD 결합 G2019S 돌연변이를 운반하는 mDA 뉴런을 사용하여 예시됩니다. 두 세포주 모두 LRRK2 키나아제 억제제 PFE-360으로 처리하고 표현형 변화를 측정했습니다. 또한 클러스터링 또는 기계 학습 기반 지도 분류 방법을 사용하여 다차원 표현형 프로파일을 분석하는 방법을 보여줍니다. 설명된 프로토콜은 신경 질환 모델링을 연구하거나 인간 신경 세포의 화합물 효과를 연구하는 연구자들에게 특히 흥미로울 것입니다.

서문

파킨슨병(PD)에서는 다양한 세포 생물학적 과정이 방해를 받습니다. 예를 들어, 미토콘드리아 기능 장애, 산화 스트레스, 단백질 분해 결함, 소포 이동 및 엔도리소좀 기능 장애는 중뇌 도파민(mDA) 뉴런 손실과 관련이 있으며, PD¹에서 일반적으로 관찰됩니다. 따라서 파킨슨병은 서로 상호작용하고 악화시킬 수 있는 여러 질병 기전을 포함하는 것으로 보입니다. 이 기계론적 상호 작용을 조사하는 한 가지 유용한 방법은 중뇌 도파민(mDA) 뉴런의 포괄적인 표현형 지문 또는 프로필을 생성하는 것입니다.

표현형 프로파일링은 측정 가능한 특성의 모음을 기반으로 샘플의 프로필을 생성하는 것과 관련된 접근 방식이며, 둘째, 이 프로필 ^2,3을 기반으로 샘플에 대한 예측을 수행하는 것을 포함합니다. 프로파일링의 목표는 다양한 특징을 포착하는 것이며, 그 중 일부는 이전에 질병이나 치료와 관련이 없었을 수 있다³. 결과적으로 프로파일링을 통해 예상치 못한 생물학적 과정을 밝힐 수 있습니다. 표현형 프로파일링은 일반적으로 형광 염색된 세포에 의존하며, 표현형 프로파일을 생....

프로토콜

1. 뉴런 파종을 위한 배지 및 플레이트 준비(1일차)

1. Day-1에 뉴런 파종을 위해 플레이트를 준비하려면 사용 직전에 라미닌을 실온(RT)으로 데우십시오. 라미닌 원액(0.1mg/mL)을 차가운 PBS+/+(Ca 2+ 및 Mg²⁺ 포함)에 1/10로 희석하여 라미닌 용액을 준비합니다.
   알림: 모든 시약은 재료 표에 나열되어 있습니다. 용액 및 완충액의 조성은 표 1-4에 기재되어 있다.
2. 그런 다음 25μL의 라미닌 용액을 PDL(Poly-D-Lysine) 사전 코팅된 384웰 플레이트의 각 웰에 추가하고 4°C에서 밤새 배양합니다. 코팅된 플레이트는 4°C에서 최대 1주일 동안 보관할 수 있습니다.
   참고: 프로토콜은 여기에서 최대 1주일 동안 일시 중지할 수 있습니다. 플라스틱 필름을 사용하여 플레이트를 밀봉합니다.
3. 전체 유지보수 매체를 준비하고 4°C에서 최대 1개월 동안 보관합니다(표 1).

2. 뉴런의 해동(0일차)

1. 0일째에 뉴런을 해동하려면 수조를 37....

토론

표현형 프로파일링(Phenotypic profiling)은 형광 염색, 현미경 검사, 이미지 분석 등을 적용하여 세포에서 많은 수의 표현형을 측정하는 기술이다³. 표현형 프로파일을 얻고 세포주 또는 기타 실험 조건에서 비교하여 단일 판독값을 사용할 때 눈에 띄지 않을 수 있는 세포 생물학의 복잡한 변화를 이해할 수 있습니다. 여기서는 PD 세포 생물학^17,18,19

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Anti- chicken – Alexa 647	Jackson ImmunoRearch	703-605-155	Immunofluorescence
Anaconda		https://www.anaconda.com/download
Anti-Map2	Novus	NB300-213	Immunofluorescence
Anti-mouse - Alexa 488	Thermo Fisher	A11001	Immunofluorescence
Anti-rabbit - Alexa 555	Thermo Fisher	A21429	Immunofluorescence
Anti-Tyrosine Hydroxylase	Merck	T2928	Immunofluorescence
Anti-α-synuclein	Abcam	138501	Immunofluorescence
Bravo Automated Liquid Handling Platform with 384ST head	Agilent		If no liquid handler is available, the use of an electronic multichannel pipette is recommended.
Confocal microscope	Yokogawa	CV7000	The use of an automated confocal fluorescence microscope is recommended to ensure image quality consistency.
Countess Automated cell counter	Invitrogen		Cell counting before seeding. Can also be done using a manual counting chamber.
DPBS +/+	Gibco	14040-133	Buffer for washing
EL406 Washer Dispenser	BioTek (Agilent)		If no liquid handler is available, the use of an electronic multichannel pipette is recommended.
Formaldehyde Solution (PFA 16 %)	Euromedex	EM-15710-S	Fixation before staining
Hoechst 33342	Invitrogen	H3570	Nuclear staining
iCell Base Medium 1	Fujifilm	M1010	Base medium for neurons
iCell DPN, Donor#01279, Phenotype AHN, lot#106339, 1M	Fujifilm	C1087	Apparently healthy donor
iCell DPN, Donor#11299, Phenotype LRRK2 G2019S, phenotype PD lot#106139	Fujifilm	C1149	Donor carrying LRRK2 G2019S mutation
iCell Nervous System Supplement	Fujifilm	M1031	Supplement for base medium
iCell Neural Supplement B	Fujifilm	M1029	Supplement for base medium
Jupyter Python Notebook	In-house development	https://github.com/Ksilink/Notebooks/tree/main/Neuro/DopaNeuronProfiling	Notebook to perform phenotypic profile visualization and classification from raw data.
Laminin	Biolamina	LN521	Plate coating
PFE-360	MedChemExpress	HY-120085	LRRK2 kinase inhibitor
PhenoLink	In-house development	https://github.com/Ksilink/PhenoLink	Software for image analysis
PhenoPlate 384w, PDL coated	Perkin Elmer	6057500	Pre-coated plate for cell culture and imaging. This plate allows imaging of all wells using all objectives of the Yokogawa CV7000 microscope.
Storage plates Abgene 120 µL	Thermo Scientific	AB-0781	Necessary for compound dispensing using the Vprep pipetting system. If not available, the use of an electronic multichannel pipette is recommended.
Triton	Sigma	T9284	Permeabilization before lysis
Trypan Blue	Sigma	T8154-20ML	Determination of living cells
Vprep Pipetting System	Agilent		Medium change and compound dispensing. Alternatively, an electronic multichannel pipette can be used.