פרופיל פנוטיפי של נוירונים דופמינרגיים שמקורם בתאי גזע אנושיים במוח התיכון

Summary

פרוטוקול זה מתאר את תרבית התאים של נוירונים דופמינרגיים במוח התיכון האנושי, ולאחר מכן צביעה אימונולוגית ויצירת פרופילים פנוטיפיים עצביים מתמונות מיקרוסקופיות שנרכשו בתוכן גבוה ומאפשרים זיהוי של וריאציות פנוטיפיות עקב מודולציות גנטיות או כימיות.

Abstract

מחלת פרקינסון (PD) קשורה למגוון תהליכים ביולוגיים של התא הגורמים לאובדן נוירונים דופמינרגיים במוח התיכון (MDA). מודלים תאיים רבים של PD במבחנה חסרים מורכבות ואינם לוקחים בחשבון פנוטיפים מרובים. פרופיל פנוטיפי בתאי עצב mDA שמקורם בתאי גזע פלוריפוטנטיים המושרים על ידי בני אדם (iPSC) יכול לטפל בחסרונות אלה על ידי מדידה בו זמנית של מגוון פנוטיפים עצביים בסוג תא רלוונטי למחלת פרקינסון במקביל. במאמר זה אנו מתארים פרוטוקול להשגה וניתוח של פרופילים פנוטיפיים מנוירוני mDA אנושיים הזמינים באופן מסחרי. פאנל צביעה פלואורסצנטי ספציפי לנוירון משמש להמחשת הפנוטיפים הקשורים לגרעין, α-סינוקלאין, טירוזין הידרוקסילאז (TH) וחלבון הקשור למיקרוטובול 2 (MAP2). פרוטוקול הפרופיל הפנוטיפי המתואר ניתן להרחבה מכיוון שהוא משתמש בלוחות 384 בארות, טיפול אוטומטי בנוזלים ומיקרוסקופ בתפוקה גבוהה. התועלת של הפרוטוקול מודגמת באמצעות נוירונים mDA מתורם בריא ונוירוני mDA הנושאים את מוטציית G2019S המקושרת ל- PD בגן קינאז חוזר עשיר בלאוצין 2 (LRRK2). שני קווי התאים טופלו במעכב קינאז LRRK2 PFE-360 ונמדדו שינויים פנוטיפיים. בנוסף, אנו מדגימים כיצד ניתן לנתח פרופילים פנוטיפיים רב-ממדיים באמצעות אשכולות או שיטות סיווג מונחות למידת מכונה. הפרוטוקול המתואר יעניין במיוחד חוקרים העובדים על מודלים של מחלות עצביות או חוקרים השפעות כימיות של תרכובות בתאי עצב אנושיים.

Introduction

מגוון תהליכים ביולוגיים של התא מופרעים במחלת פרקינסון (PD). לדוגמה, תפקוד לקוי של המיטוכונדריה, עקה חמצונית, פגמים בפירוק חלבונים, הפרעה בסחר שלפוחית השתן ותפקוד אנדוליזוזומלי נקשרו לאובדן נוירונים דופמינרגיים במוח התיכון (mDA), נצפו בדרך כלל במחלת פרקינסון¹. לכן, נראה כי פרקינסון מערבת מנגנוני מחלה מרובים שיכולים לתקשר זה עם זה ולהחמיר זה את זה. דרך שימושית אחת לחקור את יחסי הגומלין המכניסטיים האלה היא יצירת טביעת אצבע פנוטיפית מקיפה או פרופיל של נוירונים דופמינרגיים במוח התיכון (mDA).

פרופיל פנוטיפי הוא גישה הכוללת יצירת פרופיל של מדגם המבוסס על אוסף של מאפיינים מדידים, ושנית, היא כוללת ביצוע תחזיות לגבי מדגם המבוסס על פרופיל זה ^2,3. מטרת יצירת הפרופילים היא ללכוד מגוון רחב של תכונות, שחלקן אולי לא היו קשורות בעבר למחלה או לטיפול³. כתוצאה מכך, פרופיל יכול לחשוף תהליכים ביולוגיים בלתי צפויים. פרופיל פנוטיפי מסתמך בדרך כלל על תאים מוכתמים פלואורסצנטית, ובדיקות סטנדרטיות, כגון צביעת תאים, פותחו ליצירת פרופילים פנוטיפיים⁴. לאחרונה, פרופיל פנוטיפי יושם, למשל, עבור אפיון של מולקולות קטנות או חיזוי מדויק של תת-סוגים של PD אך ורק על סמך פיברובלסטים^שמקורם במטופל ^5,6. למרות התקדמות זו, פרופיל פנוטיפי כמעט ולא יושם על תאים ממוינים פוסט-מיטוטיים, כגון תאי גזע פלוריפוטנטיים המושרים על ידי בני אדם (iPSC) שמקורם בתאי עצב mDA המבטאים מוטציות הקשורות לפרקינסון כגון LRRK2 G2019S. אתגרים משמעותיים של מודלים שמקורם ב-iPSC כוללים את נוכחותם של מאפיינים פתולוגיים עדינים או משתנים על פני קבוצות התמיינות או גנוטיפים, והעובדה שפנוטיפים מבודדים של פרקינסון אינם לוכדים את מלוא המורכבות של המחלה. יתר על כן, בעוד מודלים עצביים iPSC רלוונטיים מבחינה פיזיולוגית, הם משמשים לעתים רחוקות בתהליכי גילוי תרופות PD בשל חששות לגבי מורכבות טכנית ^7,8.

בעבר פיתחנו מתודולוגיה חזקה למדידת פנוטיפים פתופיזיולוגיים מרובים הקשורים לפרקינסון בנוירוני mDA אנושיים הרגישים הן לשינויים פנוטיפיים גנטיים והן כימיים הנגרמים על ידי תרכובת⁹. מאמר זה מתאר בפירוט גרסה ממוטבת נוספת של המתודולוגיה הזו ליצירת פרופילים פנוטיפיים מתאי עצב mDA (איור 1). לפרוטוקול זה יש מספר יתרונות על פני גישות הפרופיל הפנוטיפיות שתוארו קודם לכן, כגון שימוש בנוירוני mDA באיכות גבוהה ויכולת שחזור טכנית. לראשונה, פרוטוקול זה מאפשר יצירת פרופיל פנוטיפי בנוירוני mDA פוסט-מיטוטיים רלוונטיים מבחינה פיזיולוגית לאחר הפרעות כימיות באופן מדרגי ביותר. נוירוני mDA ממוינים לחלוטין ושמורים בהקפאה זמינים מסחרית, ומפחיתים באופן משמעותי את שונות ההתמיינות בין אצווה לאצווה. שנית, ניתן לצמצם עוד יותר את השונות הטכנית על ידי שימוש בתכנון ניסויי מוגדר היטב (כלומר, משך תרבית או הימנעות מבארות קצה), טיפול אוטומטי בנוזלים ומיקרוסקופ אוטומטי. בנוסף, השלבים הראשונים של ניתוח פרופיל פנוטיפי באמצעות אשכולות לא מפוקחים או גישות סיווג מפוקחות מתוארים כאן, המציינים כיצד ניתן לנתח נתוני פרופיל פנוטיפי. פרוטוקול זה ישמש חוקרים המעוניינים בשינויים פנוטיפיים של נוירוני mDA הנגרמים על ידי הפרעות גנטיות או כימיות, במיוחד כאשר נדרש מערך מחקר מדרגי מאוד, למשל, במהלך מסעות סינון או כאשר יש לחקור את ההשפעות של מספר קטן יותר של תרכובות, למשל, כדי לקבוע השפעות רעילות. לסיכום, צפוי כי היישום של פרופיל פנוטיפי של נוירונים אנושיים הוא טכניקה רבת ערך לחקר פנוטיפים מורכבים הקשורים למחלות ולאפיין את ההשפעות התאיות של מועמדים לתרופות.

איור 1: תיאור סכמטי של פרוטוקול הניסוי ליצירת פרופילים פנוטיפיים מבוססי תמונה מתאי עצב mDA אנושיים שמקורם בתאי עצב שמקורם בתאי עצב iPSC. לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Protocol

1. הכנת מדיום וצלחות לזריעת נוירונים (יום 1)

1. כדי להכין את הצלחות לזריעת תאי עצב ביום הראשון, חממו את הלמינין לטמפרטורת החדר (RT) ממש לפני השימוש. הכינו את תמיסת הלמינין על ידי דילול תמיסת ציר למינין (0.1 מ"ג/מ"ל) 1/10 ב-PBS + / + קר (עם Ca 2+ ו-Mg²⁺).
   הערה: כל הריאגנטים מפורטים בטבלת החומרים. הרכבי התמיסות והמאגרים מתוארים בטבלאות 1-4.
2. לאחר מכן, הוסף 25 μL של תמיסת Laminin לכל באר של צלחת Poly-D-Lysine (PDL) מצופה מראש 384-well, ולדגור לילה ב 4 ° C. ניתן לאחסן את הצלחות המצופות ב -4 מעלות צלזיוס למשך עד שבוע.
   הערה: ניתן להשהות את הפרוטוקול כאן למשך עד שבוע. אטמו את הצלחות באמצעות סרט פלסטיק.
3. הכינו מדיית תחזוקה מלאה ואחסנו בטמפרטורה של 4°C למשך עד חודש (טבלה 1).

2. הפשרת נוירונים (יום 0)

1. כדי להפשיר את תאי העצב ביום 0, חממו מראש אמבט מים ל -37 מעלות צלזיוס, ואזנו את מדיית התחזוקה המלאה ל- RT, המוגנת מפני אור.
2. הוציאו את הבקבוקון המכיל את תאי העצב הקפואים שהושגו באופן מסחרי (ראו טבלת חומרים) ממיכל החנקן הנוזלי והניחו אותו על קרח יבש. לאחר מכן מניחים את הבקבוקון באמבט המים למשך 2 דקות. לאחר הפשרת הנוזל לחלוטין, יש לחטא את הבקבוקון באתנול 70%.
3. שאפו את תאי העצב המופשרים עם פיפטה P1000 (בסביבות 370 מיקרוליטר) והעבירו אותם בצינור צנטריפוגה של 50 מ"ל ללא פיפטינג מעלה ומטה. לאחר מכן, שטפו את הבקבוקון עם 630 μL של אמצעי תחזוקה מלאה, ושחררו טיפה אחר טיפה (זווית של 45°) בצינור 50 מ"ל. יש להרגיז לאט תוך כדי ניפוק.
   הערה: קריטי לפזר את המדיום לאט, טיפה אחר טיפה, כדי למנוע קרע אוסמוטי של התאים. זווית של 45° ותסיסת אור ממזערות לחץ אוסמוטי מקומי גבוה במהלך פיפטינג.
4. באופן דומה, הוסף 1 מ"ל של אמצעי תחזוקה מלאה בצינור הצנטריפוגה 50 מ"ל עם פיפטה P1000. לאחר מכן, להוסיף לאט 2 מ"ל של אמצעי תחזוקה מלאה. יש להרגיז בזהירות בזמן הניפוק.
5. ספור את התאים. הכינו מיקרו-צינור עם 10 μL Trypan Blue ותרחיף תאים 10 μL והוסיפו לשקופית תא ספירה (10 μL). בצע ספירה באמצעות מונה תאים אוטומטי (ראה רשימת חומרים) או באופן ידני.
6. לאחר הספירה, צנטריפוגו את צינור 50 מ"ל המכיל את הנוירונים ב 400 x g במשך 5 דקות ב RT, ולהסיר את supernatant. בזהירות resuspend את הגלולה באמצעות פיפטה P1000 ו 1 מ"ל של אמצעי תחזוקה מלאה. לאחר מכן הוסף את הנפח הדרוש כדי להגיע לריכוז הרצוי (300,000 תאים / מ"ל, ראה גם השלב הבא).

3. זריעת נוירונים על צלחות מוכנות (יום 0)

1. כדי לזרוע תאי עצב על הצלחות המוכנות ביום 0, הוציאו את הצלחות המצופות מהמקרר, הניחו אותן מתחת למכסה המנוע של תרבית התאים ותנו להן להתאזן ל-RT למשך כ-30 דקות.
2. רגע לפני הזריעה, שאפו לתמיסת ציפוי 15 μL עם מטפל נוזלים אוטומטי או פיפטה 16 ערוצים. השאירו כ-10 מיקרוליטר לבאר כדי למנוע נזק לציפוי.
3. לאחר מכן, שחררו 50 מיקרוליטר של תמיסת התא המכילה 300,000 תאים/מ"ל (שהוכנו בשלב 2.6) לכל באר עם פיפטה בת 16 ערוצים, והתוצאה היא 15,000 נוירונים שנזרעו לכל באר ונפח סופי לכל באר של 60 מיקרוליטר.
4. בלוח של 384 בארות, הימנע משימוש בעמודות 1, 2, 23, 24 ובשורות A, B, O ו- P כדי למזער אפקטי קצה אפשריים שעלולים להשפיע על הפרופילים הפנוטיפיים. מלא את הבארות הריקות שאינן בשימוש עם 80 μL של PBS. לדגור על הצלחות ב 37 ° C ו 5% CO₂.

4. שינוי בינוני או טיפול מורכב (יום 3)

1. בהתאם למספר הבארות, יש לחמם מראש נפח מתאים של אמצעי תחזוקה מלא ב-RT. יש להגן מפני אור.
2. אם נדרש שינוי בינוני, המשך לשלב 4.4. אם רוצים טיפול בתרכובת, יש לוודא את ריכוז מלאי התרכובת ואת הממס המשומש (מים, DMSO, מתנול וכו').
3. הכינו תמיסת תרכובת מרוכזת פי 1.5 לכל הריכוזים הרצויים לבדיקה. הכינו את הדילולים המורכבים באמצעות Complete Maintenance Medium.
   הערה: כבקרה ניטרלית, השתמש בממס המתאים באותו ריכוז כמו התרכובת הנבדקת. אם משתמשים בתרכובות מרובות או לא ידועות בריכוזים שונים, מומלץ לבצע ניסוי מנה-תגובה נפרד כדי למדוד את השפעות הממס על הפרופיל הפנוטיפי.
4. אם נעשה שימוש במערכת צנרת אוטומטית, הוסף 60 μL של תמיסת התרכובת 1.5x לצלחת אחסון של 384 בארות. לחלופין, השתמשו בפיפט בן 16 ערוצים. אם נדרש שינוי בינוני, הוסף 60 μL של אמצעי תחזוקה מלאה במקום.
5. באמצעות מערכת הצנרת האוטומטית, שאפו והשליכו 40 מיקרוליטר של מדיום לכל באר מהצלחת המכילה נוירונים כדי לשמור על 20 μL/באר. לאחר מכן הוסף 40 μL / באר של תמיסת תרכובת 1.5x מלוח האחסון של 384 בארות לכל באר כדי להשיג את הריכוז הסופי הרצוי.
   הערה: חשוב לא לבצע שינויי מדיום מלאים אלא להשאיר תמיד שאריות תווך בבאר כדי למנוע נזק לשטיח העצבי או לציפוי.
6. במקרה התרבות העצבית מבוצעת במשך יותר מ 6 ימים המתוארים בפרוטוקול זה, לשנות את המדיום כל 2-3 ימים.

5. קיבוע נוירונים והכתמה (ימים 6 עד 7)

1. כדי לתקן ולהכתים את תאי העצב בימים 6 ו-7, השתמשו במטפל אוטומטי בנוזלים לכל שלבי הניפוק והכביסה. לחלופין, השתמשו בפיפט בן 16 ערוצים.
2. הכינו פתרון 10% Triton X-100 על ידי דילול Triton X-100 ב-1x PBS. מערבולת עד שהפתרון הומוגני. יש לאחסן בטמפרטורה של 4°C.
3. כדי לתקן את הנוירונים, יש לפזר 20 μL/well של 16% PFA והתוצאה היא ריכוז סופי של 4%. דגרו על הצלחת במשך 30 דקות ב-RT, ושטפו אותה שלוש פעמים עם 1x PBS. השאירו 20 מיקרוליטר/באר של PBS לאחר השטיפה האחרונה.
   אזהרה: PFA מוכר כחומר מסוכן הידוע כגורם לרעילות דרך הפה, העור והנשימה. הוא גם מהווה איום על העיניים ועלול להוביל למוטציות גנטיות ולסרטן. טיפול נכון ב-PFA מחייב שימוש בציוד מגן אישי מתאים, כגון הגנה על העיניים והפנים, בנוסף להבטחת אוורור נאות. חשוב למנוע שחרור של PFA לסביבה.
4. לחדירה וחסימה, הכינו פתרון חסימה פי 2 (טבלה 2).
5. הוסף 20 μL / באר של 2x פתרון חסימה (ריכוז סופי 1x), לדגור במשך 1 שעה ב RT, ולשטוף פעם אחת עם PBS. יש לשמור 20 μL/באר של PBS לאחר הכביסה.
6. לצביעת נוגדנים ראשוניים (ראו טבלת חומרים), הכינו חיץ צביעה ראשוני פי 2 (טבלה 3).
7. הוסף 20 μL / באר של 2x חיץ צביעה ראשוני (1x ריכוז סופי) ודגר לילה ב 4 ° C. למחרת בבוקר ביום 7, שטפו שלוש פעמים עם PBS. יש להשאיר 20 μL/באר של PBS לאחר הכביסה.
8. לצביעת נוגדנים שניונית (ראו טבלת חומרים), הכינו חיץ צביעה משני פי 2 (טבלה 4).
9. יש להוסיף 20 μL/well של חיץ צביעה משני פי 2 (ריכוז סופי של 1x), לדגור במשך שעתיים ב-RT הרחק מאור, ולשטוף שלוש פעמים עם PBS. השאירו 100 μL PBS / היטב לאחר הכביסה האחרונה.
   1. הוסיפו איטום אלומיניום על הצלחת כדי למזער אידוי. לחלופין, מכסים את הצלחת בסרט פלסטיק ובנייר אלומיניום. המשך לרכישת תמונה, או אחסן את הצלחת ב- 4 ° C.
      הערה: ניתן להשהות את הפרוטוקול כאן למשך עד שבוע. אם נצפתה פלואורסצנטיות רקע, שקול להגדיל את זמן החסימה. אם הכתמים אינם מספיקים, נסה להגדיל את ריכוז הנוגדנים הראשוני או את זמן הדגירה.

6. הדמיה של נוירונים מוכתמים פלואורסצנטית (יום 7)

1. רכשו תמונות של תאי העצב המצופים, המתורבתים והמוכתמים ביום השביעי. באופן אידיאלי, השתמש במיקרוסקופ פלואורסצנטי קונפוקלי אוטומטי (ראה טבלת חומרים). לחלופין, רכשו תמונות באופן ידני.
2. רכשו את ערוצי Hoechst, TH, α-synuclein ו-MAP2 באמצעות לייזרים של 405 ננומטר, 488 ננומטר, 561 ננומטר ו-647 ננומטר, בהתאמה (איור 2).
   הערה: כדי להפיק כמות מספקת של נתונים מפורטים עבור פרופיל פנוטיפי, השתמש במטרה של 40x ורכוש 16 שדות/באר באמצעות ערימות Z המורכבות מ-3 פרוסות Z המופרדות ב-2 מיקרומטר. במקרה שיש נזקים הקשורים לצנרת בשטיח העצבי, נסו להימנע מהדמיה של אזורים אלה.
3. בהתאם למיקרוסקופ ולמצלמה, התאימו את זמני החשיפה ועוצמות העירור עבור כל אחד מארבעת ערוצי הפלואורסצנט בנפרד כדי לקבל טווח דינמי אופטימלי של עוצמות הפלואורסצנט.
   הערה: תוכנת הדמיה מספקת לעתים קרובות היסטוגרמה כדי לקבוע את זמן החשיפה האידיאלי. אם ההיסטוגרמה מוסטת יותר מדי שמאלה בטווח האות הנמוך, זמן החשיפה קצר מדי או שעוצמת העירור נמוכה מדי. אם יש צוק חד ברמת האות המקסימלית מימין, ערך האות רווי. במקרה זה, להפחית את עוצמת העירור או לקצר את זמן החשיפה.
4. אחסן תמונות בפורמט פתוח וללא אובדן נתונים, כגון .tif.

7. עיבוד תמונה (יום 8)

1. פילוח תמונות וחילוץ תכונות פנוטיפיות נדרשים ליצירת פרופילים פנוטיפיים כמותיים. השתמש בתוכנת PhenoLink לפילוח תמונות וחילוץ תכונות (רשימת חומרים). הוראות להתקנת PhenoLink ניתן למצוא במאגר GitHub (https://github.com/Ksilink/PhenoLink).
   הערה: פילוח תמונה משמש לזיהוי ולהפרדה של אובייקטים או אזורים שונים בתמונה, בעוד חילוץ תכונות פנוטיפי משמש לניתוח ולחילוץ מידע רלוונטי מאזורים אלה. מספר פתרונות תוכנה חלופיים, כגון CellProfiler 10, ImageJ/FIJI¹¹, Napari 12 או Knime Analytics Platform¹³ זמינים לחילוץ מידע כמותי מתמונות פלואורסצנטיות רב-ערוציות.
2. בצעו פילוח תמונה בתמונות גולמיות מתוקנות תאורה. קבעו אמפירית את ספי עוצמת הערוץ הפלואורסצנטי המתאימים לכל לוחית, כך שאות הרקע יהיה מינימלי, והאות המקוטע הרצוי יתאים לאות בתמונה הגולמית. לוחות שעובדו ונצבעו באותו יום דורשים בדרך כלל ספי עוצמת ערוץ דומים לצורך סגמנטציה.
3. הגדר את גודל הגרעין ועוצמתו כדי להפריד בין תאים חיים לתאים מתים. בעת שימוש בתמונות 40x, שמור על כל פרמטרי ברירת המחדל האחרים והפעל את התוכנה. מאה עשרים ושש תכונות תמונה כמותיות יחושבו לכל באר (טבלה משלימה 1).
4. השתמש בנתונים הכמותיים הטבלאיים המתקבלים כדי לבנות פרופילים פנוטיפיים ולהשוות פרופילים פנוטיפיים מקווי תאים שונים או מתנאי טיפול שונים. כל שורה מתאימה למצב ביולוגי (טוב) וכל עמודה מתאימה לתכונה פנוטיפית קבועה.
   הערה: אנו מספקים קובץ פלט לדוגמה יחד עם צינור ניתוח הנתונים כדי להמחיש את השימוש בו (ראה טבלת חומרים). נוסף על כך, איור 3 מראה את ההרכב של פרופיל פנוטיפי.

8. יצירת פרופיל פנוטיפי והדמיה (יום 8)

1. אם Python ו-Jupyter אינם מותקנים במחשב שלך, התקן את Anaconda Distribution ופתח את תוכנת Jupyter. הורד את מחברת Jupyter שסופקה ואת כל הקבצים האחרים שסופקו ושמור אותם באותה ספרייה (ראה טבלת חומרים). פתח את קובץ המחברת Jupyter באמצעות תוכנת Jupyter.
   הערה: אנקונדה היא פלטפורמת קוד פתוח חופשית לשפות תכנות כגון Python. פלטפורמה זו מגיעה עם מתורגמן Python Jupyter אשר יכול לבצע את מחברת Jupyter שסופקה כדי ליצור ולנתח פרופילים פנוטיפיים (https://github.com/Ksilink/Notebooks/tree/main/Neuro/DopaNeuronProfiling).
2. הפעל את מחברת Jupyter תא אחר תא באמצעות תוכנת Jupyter. הנתונים לדוגמה שסופקו .fth ודרישות .txt קבצים צריכים להיות ממוקמים באותה ספריה כמו מחברת Jupyter. כל תא מחברת Jupyter מבואר כדי להסביר את הפונקציונליות שלו.
   הערה: חיוני להשתמש במחברת Jupyter בסדר הנכון החל מטעינת נתונים ושינוי קנה מידה ולהמשיך תא אחר תא עד הסוף. כל הנתונים ופלט הגרפיקה יאוחסנו בתיקייה חדשה שנוצרה בספריית המקור של מחברת Jupyter. איור 4 מתאר את זרימת העבודה ואת פלט זרימת העבודה.

תוצאות

פרופיל פנוטיפי בנוירונים mDA הוא דרך יעילה לכמת היבטים רבים של ביולוגיה תאית ואת השינויים שלהם במהלך אפנון הניסוי. כדי להדגים מתודולוגיה זו, מחקר זה עשה שימוש ב- LRRK2 G2019S שמור בהקפאה ובנוירונים mDA בריאים מתורם. נוירונים אלה נבדלו במשך כ-37 ימים, הם סמנים עצביים פוסט-מיטוטיים ומבטאים (TUBB3 ו-MAP2) וס?...

Discussion

פרופיל פנוטיפי הוא טכניקה למדידת מספר רב של פנוטיפים בתאים על ידי החלת כתמים פלואורסצנטיים, מיקרוסקופיה וניתוח תמונה³. ניתן לקבל פרופילים פנוטיפיים ולהשוות אותם בין קווי תאים או תנאי ניסוי אחרים כדי להבין שינויים מורכבים בביולוגיה התאית שעשויים להיעלם מעיניהם בעת שימוש בקר?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Anti- chicken – Alexa 647	Jackson ImmunoRearch	703-605-155	Immunofluorescence
Anaconda		https://www.anaconda.com/download
Anti-Map2	Novus	NB300-213	Immunofluorescence
Anti-mouse - Alexa 488	Thermo Fisher	A11001	Immunofluorescence
Anti-rabbit - Alexa 555	Thermo Fisher	A21429	Immunofluorescence
Anti-Tyrosine Hydroxylase	Merck	T2928	Immunofluorescence
Anti-α-synuclein	Abcam	138501	Immunofluorescence
Bravo Automated Liquid Handling Platform with 384ST head	Agilent		If no liquid handler is available, the use of an electronic multichannel pipette is recommended.
Confocal microscope	Yokogawa	CV7000	The use of an automated confocal fluorescence microscope is recommended to ensure image quality consistency.
Countess Automated cell counter	Invitrogen		Cell counting before seeding. Can also be done using a manual counting chamber.
DPBS +/+	Gibco	14040-133	Buffer for washing
EL406 Washer Dispenser	BioTek (Agilent)		If no liquid handler is available, the use of an electronic multichannel pipette is recommended.
Formaldehyde Solution (PFA 16 %)	Euromedex	EM-15710-S	Fixation before staining
Hoechst 33342	Invitrogen	H3570	Nuclear staining
iCell Base Medium 1	Fujifilm	M1010	Base medium for neurons
iCell DPN, Donor#01279, Phenotype AHN, lot#106339, 1M	Fujifilm	C1087	Apparently healthy donor
iCell DPN, Donor#11299, Phenotype LRRK2 G2019S, phenotype PD lot#106139	Fujifilm	C1149	Donor carrying LRRK2 G2019S mutation
iCell Nervous System Supplement	Fujifilm	M1031	Supplement for base medium
iCell Neural Supplement B	Fujifilm	M1029	Supplement for base medium
Jupyter Python Notebook	In-house development	https://github.com/Ksilink/Notebooks/tree/main/Neuro/DopaNeuronProfiling	Notebook to perform phenotypic profile visualization and classification from raw data.
Laminin	Biolamina	LN521	Plate coating
PFE-360	MedChemExpress	HY-120085	LRRK2 kinase inhibitor
PhenoLink	In-house development	https://github.com/Ksilink/PhenoLink	Software for image analysis
PhenoPlate 384w, PDL coated	Perkin Elmer	6057500	Pre-coated plate for cell culture and imaging. This plate allows imaging of all wells using all objectives of the Yokogawa CV7000 microscope.
Storage plates Abgene 120 µL	Thermo Scientific	AB-0781	Necessary for compound dispensing using the Vprep pipetting system. If not available, the use of an electronic multichannel pipette is recommended.
Triton	Sigma	T9284	Permeabilization before lysis
Trypan Blue	Sigma	T8154-20ML	Determination of living cells
Vprep Pipetting System	Agilent		Medium change and compound dispensing. Alternatively, an electronic multichannel pipette can be used.