פרופיל פנוטיפי של נוירונים דופמינרגיים שמקורם בתאי גזע אנושיים במוח התיכון

Summary

פרוטוקול זה מתאר את תרבית התאים של נוירונים דופמינרגיים במוח התיכון האנושי, ולאחר מכן צביעה אימונולוגית ויצירת פרופילים פנוטיפיים עצביים מתמונות מיקרוסקופיות שנרכשו בתוכן גבוה ומאפשרים זיהוי של וריאציות פנוטיפיות עקב מודולציות גנטיות או כימיות.

Abstract

מחלת פרקינסון (PD) קשורה למגוון תהליכים ביולוגיים של התא הגורמים לאובדן נוירונים דופמינרגיים במוח התיכון (MDA). מודלים תאיים רבים של PD במבחנה חסרים מורכבות ואינם לוקחים בחשבון פנוטיפים מרובים. פרופיל פנוטיפי בתאי עצב mDA שמקורם בתאי גזע פלוריפוטנטיים המושרים על ידי בני אדם (iPSC) יכול לטפל בחסרונות אלה על ידי מדידה בו זמנית של מגוון פנוטיפים עצביים בסוג תא רלוונטי למחלת פרקינסון במקביל. במאמר זה אנו מתארים פרוטוקול להשגה וניתוח של פרופילים פנוטיפיים מנוירוני mDA אנושיים הזמינים באופן מסחרי. פאנל צביעה פלואורסצנטי ספציפי לנוירון משמש להמחשת הפנוטיפים הקשורים לגרעין, α-סינוקלאין, טירוזין הידרוקסילאז (TH) וחלבון הקשור למיקרוטובול 2 (MAP2). פרוטוקול הפרופיל הפנוטיפי המתואר ניתן להרחבה מכיוון שהוא משתמש בלוחות 384 בארות, טיפול אוטומטי בנוזלים ומיקרוסקופ בתפוקה גבוהה. התועלת של הפרוטוקול מודגמת באמצעות נוירונים mDA מתורם בריא ונוירוני mDA הנושאים את מוטציית G2019S המקושרת ל- PD בגן קינאז חוזר עשיר בלאוצין 2 (LRRK2). שני קווי התאים טופלו במעכב קינאז LRRK2 PFE-360 ונמדדו שינויים פנוטיפיים. בנוסף, אנו מדגימים כיצד ניתן לנתח פרופילים פנוטיפיים רב-ממדיים באמצעות אשכולות או שיטות סיווג מונחות למידת מכונה. הפרוטוקול המתואר יעניין במיוחד חוקרים העובדים על מודלים של מחלות עצביות או חוקרים השפעות כימיות של תרכובות בתאי עצב אנושיים.

Introduction

מגוון תהליכים ביולוגיים של התא מופרעים במחלת פרקינסון (PD). לדוגמה, תפקוד לקוי של המיטוכונדריה, עקה חמצונית, פגמים בפירוק חלבונים, הפרעה בסחר שלפוחית השתן ותפקוד אנדוליזוזומלי נקשרו לאובדן נוירונים דופמינרגיים במוח התיכון (mDA), נצפו בדרך כלל במחלת פרקינסון¹. לכן, נראה כי פרקינסון מערבת מנגנוני מחלה מרובים שיכולים לתקשר זה עם זה ולהחמיר זה את זה. דרך שימושית אחת לחקור את יחסי הגומלין המכניסטיים האלה היא יצירת טביעת אצבע פנוטיפית מקיפה או פרופיל של נוירונים דופמינרגיים במוח התיכון (mDA).

פרופיל פנוטיפי הוא גישה הכוללת יצירת פרופיל של מדגם המבוסס על אוסף של מאפיינים מדידים, ושנית, היא כוללת ביצוע תחזיות לגבי מדגם המבוס....

Protocol

1. הכנת מדיום וצלחות לזריעת נוירונים (יום 1)

1. כדי להכין את הצלחות לזריעת תאי עצב ביום הראשון, חממו את הלמינין לטמפרטורת החדר (RT) ממש לפני השימוש. הכינו את תמיסת הלמינין על ידי דילול תמיסת ציר למינין (0.1 מ"ג/מ"ל) 1/10 ב-PBS + / + קר (עם Ca 2+ ו-Mg²⁺).
   הערה: כל הריאגנטים מפורטים בטבלת החומרים. הרכבי התמיסות והמאגרים מתוארים בטבלאות 1-4.
2. לאחר מכן, הוסף 25 μL של תמיסת Laminin לכל באר של צלחת Poly-D-Lysine (PDL) מצופה מראש 384-well, ולדגור לילה ב 4 ° C. ניתן לאחסן את הצלחות המצופות ב -4 מעלות צלזיוס למשך עד שבוע.
   הערה: ניתן להשהות את הפרוטוקול כאן למשך עד שבוע. אטמו את הצלח....

תוצאות

פרופיל פנוטיפי בנוירונים mDA הוא דרך יעילה לכמת היבטים רבים של ביולוגיה תאית ואת השינויים שלהם במהלך אפנון הניסוי. כדי להדגים מתודולוגיה זו, מחקר זה עשה שימוש ב- LRRK2 G2019S שמור בהקפאה ובנוירונים mDA בריאים מתורם. נוירונים אלה נבדלו במשך כ-37 ימים, הם סמנים עצביים פוסט-מיטוטיים ומבטאים (TUBB3 ו-MAP2) וס?.......

Discussion

פרופיל פנוטיפי הוא טכניקה למדידת מספר רב של פנוטיפים בתאים על ידי החלת כתמים פלואורסצנטיים, מיקרוסקופיה וניתוח תמונה³. ניתן לקבל פרופילים פנוטיפיים ולהשוות אותם בין קווי תאים או תנאי ניסוי אחרים כדי להבין שינויים מורכבים בביולוגיה התאית שעשויים להיעלם מעיניהם בעת שימוש בקר?.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Anti- chicken – Alexa 647	Jackson ImmunoRearch	703-605-155	Immunofluorescence
Anaconda		https://www.anaconda.com/download
Anti-Map2	Novus	NB300-213	Immunofluorescence
Anti-mouse - Alexa 488	Thermo Fisher	A11001	Immunofluorescence
Anti-rabbit - Alexa 555	Thermo Fisher	A21429	Immunofluorescence
Anti-Tyrosine Hydroxylase	Merck	T2928	Immunofluorescence
Anti-α-synuclein	Abcam	138501	Immunofluorescence
Bravo Automated Liquid Handling Platform with 384ST head	Agilent		If no liquid handler is available, the use of an electronic multichannel pipette is recommended.
Confocal microscope	Yokogawa	CV7000	The use of an automated confocal fluorescence microscope is recommended to ensure image quality consistency.
Countess Automated cell counter	Invitrogen		Cell counting before seeding. Can also be done using a manual counting chamber.
DPBS +/+	Gibco	14040-133	Buffer for washing
EL406 Washer Dispenser	BioTek (Agilent)		If no liquid handler is available, the use of an electronic multichannel pipette is recommended.
Formaldehyde Solution (PFA 16 %)	Euromedex	EM-15710-S	Fixation before staining
Hoechst 33342	Invitrogen	H3570	Nuclear staining
iCell Base Medium 1	Fujifilm	M1010	Base medium for neurons
iCell DPN, Donor#01279, Phenotype AHN, lot#106339, 1M	Fujifilm	C1087	Apparently healthy donor
iCell DPN, Donor#11299, Phenotype LRRK2 G2019S, phenotype PD lot#106139	Fujifilm	C1149	Donor carrying LRRK2 G2019S mutation
iCell Nervous System Supplement	Fujifilm	M1031	Supplement for base medium
iCell Neural Supplement B	Fujifilm	M1029	Supplement for base medium
Jupyter Python Notebook	In-house development	https://github.com/Ksilink/Notebooks/tree/main/Neuro/DopaNeuronProfiling	Notebook to perform phenotypic profile visualization and classification from raw data.
Laminin	Biolamina	LN521	Plate coating
PFE-360	MedChemExpress	HY-120085	LRRK2 kinase inhibitor
PhenoLink	In-house development	https://github.com/Ksilink/PhenoLink	Software for image analysis
PhenoPlate 384w, PDL coated	Perkin Elmer	6057500	Pre-coated plate for cell culture and imaging. This plate allows imaging of all wells using all objectives of the Yokogawa CV7000 microscope.
Storage plates Abgene 120 µL	Thermo Scientific	AB-0781	Necessary for compound dispensing using the Vprep pipetting system. If not available, the use of an electronic multichannel pipette is recommended.
Triton	Sigma	T9284	Permeabilization before lysis
Trypan Blue	Sigma	T8154-20ML	Determination of living cells
Vprep Pipetting System	Agilent		Medium change and compound dispensing. Alternatively, an electronic multichannel pipette can be used.